C型利钠肽变体的制作方法

文档序号：6000884阅读：2379来源：国知局

专利名称：C型利钠肽变体的制作方法
技术领域：
本文的领域大体而言涉及C型利钠肽(CNP)的变体、包含CNP变体的组合物、制造 CNP变体的方法，及使用CNP变体来治疗CNP反应性病症的方法，这些病症包括(但不限于) 骨相关病症，诸如骨骼发育不良(例如软骨发育不全)，及血管平滑肌病症。
背景技术：
利钠肽家族系由三种结构上相关的肽组成心房利钠肽(ANP) (Genbank登录号 NP_006163,针对ANP前驱蛋白质NPPA)、脑利钠肽(BNP) (Genbank登录号NP_002512，针对BNP前驱蛋白质NPPB)，及C型利钠肽(CNP) (Biochem. Biophys. Res. Commun.(生物化学生物物理研究通讯)，168 =863-870 (1990) (GenBank登录号NP_077720，针对CNP前体蛋白质 NPPC) (J. Hypertens.(高血压杂志)，10 :907-912 (1992))。此等小型单链肽(ANP、BNP、 CNP)具有一个17个氨基酸的环结构(Levin等人，N. Engl. J. Med.(新英格兰医学杂志)， 339 :863-870(1998))且在多个生物过程中具有重要作用。ANP及BNP结合并活化利钠肽受体A(NPR-A)(亦称为鸟苷酸环化酶A(GC-A))，导致细胞内环单磷酸鸟苷(cGMP)含量升高。同样，CNP与NPR-B(GC-B)相互作用刺激cGMP的产生(J. Hypertens.(高血压杂志)，10 1111-1114(1992))。第三类型的受体NPR-C以高亲和力结合各利钠肽且主要用以捕捉来自细胞外代谢区的肽且使这些肽沉积于溶酶体中，这些肽在此处被降解(kience (科学)， 238 :675-678 (1987))。ANP及BNP主要在心肌细胞内产生，且据信其在心血管内稳定中具有重要作用Science(科学)，252 :120-123(1991))。CNP表达更广泛，包括表达于中枢神经系统、生殖道、骨及血管内皮中(Hypertension (高血压)，49 =419-426 (2007)) 在人类中，CNP最初自呈126个氨基酸单链前原多肽形式的利钠肽前体C(NPPC) 基因产生(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)168 863-870(1990))。移除信号肽得到原CNP，且通过内切蛋白酶弗林蛋白酶(furin)的进一步切割产生53个氨基酸的活性肽(CNP-53)，其经分泌且经未知酶再次切割产生22个氨基酸的成熟肽(CNP-22) (ffu, J.Biol. Chem.(生物化学杂志)278 :25847-852 (2003))。 CNP-53及CNP-22在其分布方面不同，其中CNP-53在组织中居主导，而CNP-22主要见于血浆及脑脊髓液中(J. Alfonzo, Recept. Signal. Transduct. Res.(受体信号转导研究),26 269-297(2006)) ο软骨中的主要CNP形式尚未知。CNP-53与CNP-22类似地结合于NPR-B。此外，其均以剂量依赖性方式及类似方式诱导cGMP产生(VT Yeung, P印tides (肽)，17 : 101-106(1996))。先前已描述天然CNP基因及多肽。美国专利第5，352，770号揭示来自猪脑的在序列方面与人类CNP相同的经分离及纯化的CNP-22，及其在治疗心血管适应症中的用途。美国专利第6，034，231号揭示原CNP (126个氨基酸)的人类基因及多肽，及人类CNP-53基因及多肽。细胞外间隙的CNP清除通过迅速降解CNP的膜结合中性内肽酶(NEP)的作用 (Biochem. J.(生物化学杂志)，(第一部分)83-88 (1993))，及经由结合于CNP且使CNP 沉积于溶酶体(CNP在此处降解)中的NPR-C。已显示CNP在正常人类中具有2. 6分钟的活体内半衰期(J. Clin. Endocrinol. Metab.(临床内分泌代谢杂志),78 1428-35 (1994))。 CNP的低血浆浓度(J. Bone Moner. Res.，(骨矿物质研究杂志)19 (增刊1) S20 (2004))及其与NPR-B在许多组织中共表达表明CNP主要经由自分泌/旁分泌机制起作用。如上所述，CNP结合并活化利钠肽受体B (NPR-B)(亦称为鸟苷酸环化酶B (GC-B))，导致细胞内环单磷酸鸟苷(cGMP)含量升高。由cGMP产生所介导的下游信号传导会影响一系列不同生物过程，包括软骨内骨化。因此，提高或抑制此路径中任何组分的含量皆可能会引起骨生长异常。举例而言，在小鼠模型中敲除CNP或NPR-B产生长骨及椎骨较短的矮化表型的动物。已鉴别出人类NPR-B中阻断适当CNP信号传导的突变且其导致侏儒症(Olney等人，J.Clin. Endocrinol. Metab.(临床内分泌代谢杂志)91 (4) :1229-1232(2006) ；Bartels 等人，Am. J. Hum. Genet.(美国人类遗传学杂志)75 27-34 (2004)) 0相反，工程改造成产生较高含量的CNP的小鼠呈现延长的长骨及椎骨。软骨发育不全是由成纤维细胞生长因子受体3 (FGFRj)基因的常染色体显性突变(导致软骨形成异常)引起。FGFR-3通常对软骨细胞生长及因此骨生长具有负调节作用。在软骨发育不全中，FGFR-3的突变形式具有组成型活性，其引起骨严重缩短。软骨细胞增殖与分化似乎均受到干扰，导致生长板软骨显著较短(P. Krejci等人，J. Cell Sci.(细胞科学杂志)118 :5089-510(^200 )。软骨内骨化为控制长骨纵向生长的过程。生长板存在四个区域静止区、增殖区、肥大区及钙化区。在生长板中，NPR-B由增殖细胞表达，而NPR-C 由肥大细胞表达(Yamashite等人，J. Biochem.(生物化学杂志)127 177-179 (2000))。在正常软骨内骨生长中，软骨细胞组织成柱状形式且在生长板增殖区中增殖。在软骨发育不全患者中，此等柱变得紊乱。另外，在肥大区中，细胞变大且最终凋亡(裂解)，导致骨细胞侵入及矿化。软骨发育不全患者中肥大软骨细胞及该区的总体大小比正常患者小得多。CNP 为软骨细胞及骨生长的正调节剂NPR-B的促效剂。CNP/NPR-B的下游信号传导在有丝分裂原活化蛋白激酶(MAP K)层面上抑制FGFR-3路径。在MAP K处的抑制可促进生长板的增殖区及肥大区中软骨细胞的增殖及分化，使得骨生长。在人类中，FGFR-3的活化突变为遗传性侏儒症的主要原因。具有已活化FGFR-3的小鼠充当软骨发育不全(骨骼发育不良的最常见形式)的模型，且CNP的过度表达拯救此等动物避免矮小。因此，CNP及CNP的功能变体为治疗各种骨骼发育不良的潜在治疗剂。CNP的治疗用途目前受限于其短血浆半衰期，该半衰期在人类中活体内显示为 2. 6 分钟(J Clin. Endocrinol. Metab.(临床内分泌代谢杂志)，78 :1似8_35 (1994))。为提高CNP浓度高于人类血浆中通常所见的固有含量(约5pM)，在使用全身性给予的CNP的所有人类及动物研究中，必需连续输注。相较于野生型CNP，具有较长活体内血清半衰期且显示类似或改良的活性的CNP变体对于可持续治疗策略为重要的。人类血浆中缩短CNP半衰期的两种机制为中性内肽酶(NEP)造成的降解及利钠肽受体C(NPR-C)造成的清除(GrowthHorm. &IGF Res.(生长激素和IGF研究)，16 :S6_S14 (2006))。据报导，对肽进行修饰可增强对内肽酶及外肽酶裂解的抗性(Amino Acids(氨基酸)，30 :351-367(2006) ；Curr. Opin. Biotech (生物技术目前观点).，17 =638-642 (2006))。已评估CNP的多种类似物及衍生物的生物活性。据报导，通过以S-甲基Cys取代Cp6与Cys22,肽经由Cys6-Cys22 二硫键的环化显示对CNP刺激cGMP形成的活性重要 (Biochem. Biophys. Res. Comm.(生物化学生物物理研究通讯)，183 :964-969 (1992)，亦使用丙氨酸扫描以鉴别对CNP功能性重要的氨基酸)。据报导，活性的额外显著增强是氨基酸 1^119、1^81(1及1^1111的组合存在引起的。美国专利第5，434，133号描述包含在氨基酸位置6、 7、9、11或22具有取代的CNP-22的CNP类似物，其中该氨基酸选自位置6的Cys或Pmp (五环巯基丙酸)，位置7的Phe、4-氯-Phe、4-氟-Phe、4_硝基-Phe或Cha (3_环己基-Ala)，位置9的Gly、Val、Aib或tLeu，位置11的Leu或lie，及位置22的Cys或Pmp。美国专利公开案第2004/0138134号(现为美国专利7，276，481)描述包含CNP-22 的氨基酸Cys6至Cys22的CNP变体(“CNP-17”)，其包括位置9、10、11、16、17、19或20的另一天然氨基酸的至少一个取代；具有插入及缺失的CNP变体，诸如在Cp6与Wie7之间NEP 裂解的所报导主要位点添加His残基；及使用此等变体来增大异常骨中骨生长板的尺寸及延长异常骨的方法。然而，如根据cGMP产生所量测，此等变体的活性未得到显著增强，且如在基于活体外细胞的方法(实施例7)中所观测，几乎所有变体的活性均减弱。未提供其它支持性数据，诸如提供活体外稳定性或活体内测定改良的药物动力学(PK)来证实CNP类似物的所声称NEP抗性及NPR-C抗性。美国专利第6，743，425号揭示治疗软骨发育不全的物质，其活化NPR-B/GC-B且为肽或低分子量化合物，包括C型利钠肽CNP-22及CNP-53。PCT 公开案第WO 94/205 号揭示命名为血管钠肽(vasonatrin peptide/VNP)的CNP-22与 ANP的5氨基酸C端的嵌合体，亦即有限数目的氨基酸取代及藉由形成二硫键或双键产生的环状嵌合肽。改良其它利钠肽家族成员的半衰期的方法包括降低ANP对NPR-C的亲和力(美国专利第5，846，932号)、利用NPR-C的五肽拮抗剂(W0 00/6163)及共给予NEP抑制剂，诸如塞奥芬(thiorphan)与坎沙曲(candoxatril) (Clin. Exp. Pharma. Physiol. , 25 986-991 (1997)，Hyperten.，30 184-190 (1997))。WO 2004/047871 描述 BNP 及 BNP 变体与聚烷二醇部分、糖部分、聚山梨醇酯部分、聚阳离子部分及其它亲水性聚合物部分的偶联物，其据报导显示获改良的循环半衰期且据报导适用于治疗急性充血性心脏衰竭。然而，尚无关于制造具有NEP抗性同时保留CNP功能性的CNP的成功策略的公开报导。

发明内容
本文涉及C型利钠肽(CNP)的变体，其适用于治疗骨相关病症(例如软骨发育不全)及血管平滑肌病症。本公开包含血清半衰期增加(例如由于结合于中性内肽酶(NEP) 的能力降低、对NEP的蛋白水解作用的抗性较高及/或对清除利钠肽受体C(NPR-C)的亲和力降低)同时保留CNP功能性的CNP变体。下文阐述人类CNP-22的野生型序列(在本文中称为” hCNP22，，、，，wtCNP22，，或” CNP22”)
(N 端)Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Il e14~Gly15-Ser 16-Met 17~Serlg-GlY19-Leu20-Gly21-CyS22 (SEQ ID NO :1)。CNP22的位置6至22藉助于Cys6与Cys22之间的二硫键形成环状域。已显示17 个氨基酸的环状结构对CNP结合于NPR-B重要GchiIler，Biochem. Biophys. Res. Commun.， (生物化学生物物理研究通讯)138 =880-886 (1986))。CNP22的位置6至22的氨基酸序列在本文中称作” CNP17” (SEQ ID NO :2)。CNP 在许多位点易于被 NEP 裂解Cys6_Phe7、Gly8_Leu9、LyslO-LeulU Argl3-Ilel4、Serl6_Metl7及Glyl9_Leu20。在一实施例中，本公开包括一种CNP变体，其 (1)经修饰以使其总体大小或分子量增至例如以下范围约2. 6kDa或2. SkDa至约4kDa、 4. 2kDa>4. 4kDa>4. 6kDa>4. 8kDa>5kDa>5. 2kDa>5. 4kDa>5. 6kDa>5. 8kDa>6kDa>6. 2kDa>
6.4kDa或至约7kDa、7. 2kDa或约8. 2kDa，及/或( 在某些氨基酸位置经修饰以降低其在
1、2、3、4、5或所有6个上列位点对NEP裂解的敏感性。CNP变体的大小或分子量可藉由多种方式增大，例如藉由将其它氨基酸及/或其它种类的化学(例如天然或合成聚合)基团偶联至肽序列的例如N端、C端及/或侧链，及/或藉由使用天然氨基酸、非天然氨基酸及/或具有较庞大侧链的肽模拟物。视情况进一步使CNP变体偶联偶联至其它功能或结构部分。视情况与本文所述的任何实施例组合，可将突变(例如取代、添加及/或缺失)引入CNP22 的某一(某些)位置以降低CNP变体对NPR-C的亲和力。在不影响NEP抗性或CNP活性的情况下，可进行其它修饰，例如保守性取代，或在此项技术中已知的其它修饰。在一实施例中，CNP变体由以下通式表示(X)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Ph G7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys2 2_(z) (SEQ ID NO :5)，其中在对应于一或多个以下CNP残基的位置Glyl、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、 Leu9、LyslO、LeulU Ilel4、Glyl5、Serl6、Metl7、Glyl9、Leu20 及 Gly21, CNP 变体包含一或多个经修饰的氨基酸，其可产生经修饰的肽键(例如经由使用肽键等构物)；及(χ)及(ζ)独立地可不存在或可为来源于利钠多肽(例如NPPC、ANP、BNP)或非利钠多肽(例如人类血清白蛋白(HSA)、IgG等)的氨基酸序列。在一实施例中，CNP变体包括(1)在对应于CNP22的位置6、7或8 (Cys6、Phe7或 Gly8)的一的氨基酸位置处的修饰；(2)在位置1-5 (GlyU Leu2、Ser3、Lys4及Gly5)的任何或所有氨基酸的视情况存在的缺失、添加及/或取代；及C3)视情况至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10个在对应于位置6-22的位置处的其它修饰(缺失、添加及/或取代)，其中1、
2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰可为保守性取代或本文所述或在此项技术中已知的其它取代。应了解，以编号提及特定氨基酸位置(例如CNP22的位置7)指任何CNP变体中对应的氨基酸位置，即使该CNP变体中的位置编号因前述插入或缺失而发生变化亦如此。举例而言，对于前五个氨基酸已缺失的CNP变体，提及”位置7”或”Phe7”将指相应位置2。类似地，对于一个氨基酸已添加至N端的CNP变体，提及”位置7”指对应位置8。在本文所述的任何实施例中，CNP变体可通过对应于CNP22的6与22位之间的共价键环化。考虑使用此项技术中已知的任何方法形成共价键。在另一实施例中，CNP变体可经由位于肽的N端或靠近N端的氨基酸与C端或靠近C端的氨基酸(出于此目的称为，，末端”氨基酸)之间所形成的共价键来环化。在一实施例中，在两个末端氨基酸的侧链之间或对应于CNP22的6与22的位置的氨基酸之间形成共价键。在另一实施例中，在一个末端氨基酸的侧链与另一末端氨基酸的末端基团之间，或在各末端氨基酸的末端基团之间形成共价键。举例而言，末端氨基酸之间或对应于CNP22的6与22的位置的氨基酸之间所形成的共价键可能为头至尾键、侧链至侧链键、侧链至头键或侧链至尾键。在一实施例中，本文提供一种对NEP的亲和力降低，及/或对NEP裂解的抗性较大及/或活体内血清半衰期增加，同时保留CNP的功能性(例如刺激cGMP产生)的CNP变体。NEP由于其活性位点腔隙的尺寸有限而较佳识别小于约3kDa的底物(Oefner，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，296 :341-349(2000)) ο在一实施例中，例如藉由添加约0. 6kDa 至约5kDa的氨基酸、亲水性或水溶性聚合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或碳水化合物来修饰CNP变体，以使其总分子量增至约2. 6kDa或2. 8kDa至约4,4. 6、5、5· 2,5. 8、6、6· 4 或7kDa的范围。在特定例示性实施例中，CNP变体的分子量在约2. 6kDa与约7kDa之间，或在约2. 8kDa与6kDa之间，或在约2. 8kDa与约5. 8kDa之间。在某些实施例中，添加至少约 0. 6、0· 8、1、1· 2、1· 4、1. 6 或 1. 8kDa，或至多 2、2· 2、2· 4、2· 6、2· 8、3、3· 2、3· 4、3· 6、3· 8、4、 4. 2,4. 4,4. 6,4. 8或5kDa，以使CNP变体的总分子量增至例如约2. 6或2. 8kDa至约4kDa、 4. 2kDa>4. 4kDa>4. 6kDa>4. 8kDa>5kDa>5. 2kDa>5. 4kDa>5. 6kDa>5. 8kDa>6kDa>6. 2kDa> 7. 2kDa、8. 2kDa或更高的范围。在一些实施例中，此等CNP变体包含与CNP22的氨基酸6_22 至少约70%、75%、80%、85%、90%或95%相同或同源的氨基酸序列。在其它实施例中，此等CNP变体包含另一天然或非天然氨基酸或肽模拟物的1、2、3、4、5、6或7个氨基酸的取代、插入或缺失。尽管预想保守性取代与非保守性取代或插入均可在任何位置进行，但可例如藉由保守性取代开始将修饰引入此项技术中已鉴定为与CNP活性或NPR-B结合有关的区域中，而非保守性取代可在先前已显示容许修饰的那些区域中进行。在另一实施例中，CNP变体包含在Cys6与Cys22之间具有完整环化部分，且具有含有约 1-40、1-20、5-40、5-35、10-35、15-35、5-31、10-31 或 15-31 个氨基酸且为来源于 CNP 多肽及/或非CNP多肽的片段的N端尾及/或C端尾的CNP。在一实施例中，此等CNP变体的分子量在约2. 8kDa至约4,4. 6、5、5· 2,5. 8、6、6· 4或7kDa的范围内。此等CNP变体的非限制性实施例包括野生型CNP22 ；或具有一或多个氨基酸取代(例如K4R取代)的CNP22，其具有来源于以下的N端及/或C端延伸人类或其它物种的利钠肽前体序列(例如ANP、 BNP或CNP)；具有氨基酸取代、添加及/或缺失的利钠肽前体C(NPPC)变体(例如这些CNP 变体可为CNP-53的截短形式，其产生分子量在约2. SkDa与5. SkDa之间的肽)；或其它非 CNP多肽，诸如血清白蛋白或IgG蛋白(例如这些CNP变体可为含有人类或其它物种的血清白蛋白或IgG的片段的CNP嵌合体)。在一实施例中，总质量特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. SkDa 至约6kDa或7kDa)、经设计以便增强对NEP降解的抗性的CNP变体由以下通式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4 "Gly5-Cy S6-Phe7-Gl y8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :6)，其中(χ)为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为聚乙二醇(PEG，亦称为聚环氧乙烷(ΡΕ0))，且天然聚合基团的非限制性实例为含有1至35个氨基酸且来源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的变体、ANP、BNP,或其它非CNP多肽或肽，诸如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、骨织素(osteocrin)或成纤维细胞生长因子2 (FGF2)；(ζ)可不存在或可为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为PEG，且天然聚合基团的非限制性实例为来源于利钠多肽(例如NPPC、CNP、ANP或 BNP)或非利钠多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且(b)及(h)可各自独立地在该位置是野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或经侧链上不具有反应性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、 Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、6111、6111或％1·)置换。在一实施例中，(b)为Arg。在另一实施例中，为了改良NEP抗性，(b)不为Gly。在又一实施例中，(h)不为Arg。来源于NPPC或其变体的氨基酸序列的非限制性实例包括Arg ；Glu-Arg ；Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 7)；Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 8)；Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO 9)；Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 10)；Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO: 11)；Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO: 12)；Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID N0:13)；Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID N0:14)；Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID N0:15)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO 16)；Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO 17)；Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO 18)；Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 19)；Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 20)；Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 21)；及Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 22)。来源于非CNP多肽(诸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性实例包括Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO 23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO 24)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 25)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 26)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO 27)；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO 28)；Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO 29)；Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO 30)；Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID N0:31)；及Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO :32)。在一实施例中，CNP22或其变体的N端及/或C端可独立地偶联偶联于含有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的氨基酸延伸。在一实施例中，氨基酸延伸来源于NPPC、CNP53、ANP或BNP。在一特定实施例中，氨基酸延伸为Gln-Glu-His-Pro-Asn-A Ia-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO :33)。在一相关实施例中，将此 15 个氨基酸的延伸添加至N端以提供下式的CNP变体=Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys-Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4~G1 y5-Cy S6-Phe7-Gl Y8-Leu9- (h) 10~Leu H-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (ζ) (SEQ ID NO :34)。在一实施例中，CNP变体包含N端及/或C端偶联与亲水性聚合物(例如PEG)偶联以使其总体分子大小增至约2. 6kDa或2. 8kDa至约4、5、6或7kDa的范围的wtCNP22或其变体(例如具有添加、缺失及/或取代(诸如K4R取代)的变体)(SEQ ID N0:35)。此等 CNP变体视情况在N端及/或C端进一步偶联偶联于包含例如氨基酸、碳水化合物、疏水性酸及/或磷脂的聚合基团，该聚合基团的一非限制性实例为含有1至35个、或5至31个氨基酸的N端氨基酸延伸。在一实施例中，将至少约0. 4,0. 6,0. 8、1、1· 2,1. 4、1· 6或1. 8kDa 或至多 2,2. 2,2. 4,2. 6,2. 8、3、3· 2,3. 4,3. 6,3. 8、4、4· 2,4. 4,4. 6,4. 8 或 5kDa 的亲水性聚合(例如PEG)部分添加至wtCNP22或其变体的N端及/或C端。如本文中所示，约0. 6kDa或更高的亲水性或水溶性PEG(或ΡΕ0)聚合物偶联偶联于CNP22或其变体一般会显著增强对NEP裂解的抗性。然而，将PEG(即使小至0. 6kDa) 添加至wtCNP22可能会降低CNP功能性(例如刺激cGMP信号传导)，且将大于约2kDa或 3kDa的PEG添加至CNP22或其变体可能会以尺寸依赖性方式降低CNP功能活性。但当使约0. 6kDa至约1. 2kDa或可能达约2kDa的PEG (或ΡΕ0)聚合物偶联与具有N端氨基酸延伸的CNP变体偶联时，CNP功能性得以保留(至少与wtCNP22的功能性相当)，其中至少一个在生理条件下可能带正电荷的相对较大氨基酸(例如精氨酸)紧接于对应于CNP22的 Glyl 的位置之前，诸如 GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)、GANPR_CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、R-CNP22 (SEQ ID NO :40) 及 R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)。因此，在一实施例中，聚乙二醇化CNP变体在CNP22或其变体(例如具有K4R取代的变体)的N端包含含有至少1、2、3、4或5个氨基酸的氨基酸延伸，其中使PEG聚合物偶联与经氨基酸延伸的CNP变体的N端偶联以产生特征在于本文一般描述的范围(例如约 2. 6kDa或2. 8kDa至约6kDa或7kDa)以便增强对NEP裂解的抗性的总质量。在一实施例中，为增强CNP的功能性，此等聚乙二醇化且经氨基酸延伸的CNP变体含有至少一个紧接于对应于CNP22的Glyl的位置之前的在生理条件下可能带正电荷的相对较大的天然或非天然氨基酸。在一特定实施例中，聚乙二醇化且经氨基酸延伸的CNP变体含有至少一个紧接于对应于CNP22的Glyl位之间的精氨酸残基。除在N端及/或C端偶联偶联亲水性或水溶性聚合物(诸如PEG (或ΡΕ0))的CNP 变体外，本发明亦包括在内部位点与这种偶联聚合物偶联的CNP变体。本文中为简明起见，将使用PEG(或ΡΕ0)作为亲水性或水溶性聚合物的代表性实例。CNP变体可能在各种位点聚乙二醇化，包括(但不限于)(1)仅在N端聚乙二醇化；( 仅在C端聚乙二醇化；(3)仅在内部位点(例如Lys4)聚乙二醇化；(4)在N端与C端皆聚乙二醇化；(5)在N端及内部位点聚乙二醇化；及(6)在C端及内部位点聚乙二醇化。为增强对NEP降解的抗性及保留 CNP功能性，在某些实施例中，聚乙二醇化CNP变体的总质量的特征在于本文一般描述的范围，例如在约2. 6kDa或2. 8kDa至约4、5、6或7kDa的范围内。在一特定实施例中，CNP17、 CNP22、CNP37 (下文定义)或其变体(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的变体)仅在 N端聚乙二醇化。在另一实施例中，CNP变体仅在内部位点(例如Lys4)聚乙二醇化。在另一实施例中，CNP变体在N端及内部位点(例如Lys4)聚乙二醇化。在又一实施例中，为得到更佳功能性，CNP变体不在环状域(对应于CNP22的Cys6至Cys22)内的位点(例如 LyslO)聚乙二醇化。为防止在内部位点聚乙二醇化，可用在侧链上不含反应性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(诸如Gly、kr、Arg、Asn、Gln、Asp、GlU或瓜氨酸(Cit))取代Lys4及/或LyslO。在一特定实施例中，Lys4及/或LyslO经Arg置换。在另一实施例中，LyslO不经Arg置换。本文包括使用可在以下方面不同的亲水性或水溶性聚合物(例如PEG分子)类型(例如均聚物或共聚物；无规共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；线性或分支；单分散或多分散)、键联(例如可水解键或稳定键联，诸如酰胺、亚胺、胺、伸烷基或酯键)、偶联位点 (例如在N端及/或C端，较佳不在CNP的环化区(对应于CNP22的残基6-22)中的任何残基处)，及长度(例如约0. 2,0. 4或0. 6kDa至约2、3、4或5kDa)。亲水性或水溶性聚合物可藉助于此项技术中已知的基于N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或基于醛的化学或其它化学偶联至CNP肽。此等CNP变体可使用以下产生例如wtCNP-22 (2. 2kDa)、仅保留wtCNP22 的环化区(残基6-22)的CNP-17、在CNP22的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP变体，或具有氨基酸取代、添加及/或缺失的变体，例如GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、 GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、R-CNP22 (SEQ ID NO 40)、R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)、ER-CNP22(SEQ ID NO :38)及 ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)。在一实施例中，总质量的特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. 8kDa至约6或7kDa)的PEG-CNP变体含有经由基于NHS或基于醛的化学偶联偶联于N端及/或C端的单分散性线性PEG (或 ΡΕ0)基团，或经由基于NHS的化学偶联于N端及/或C端的两臂或三臂分支PEG基团。本文进一步包括经设计以降低肾清除率的带负电PEG-CNP变体，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物。在一相关实施例中，本文包括PEG-CNP偶联物，其包含基于NHS或基于醛的式 (CH2CH2O)n的PEG，其中η为12至50的整数，且PEG聚合物的分子量为至多约2. 5kDa。在一特定实施例中，η为12或M。在一实施例中，PEG聚合物的末端羟基经非反应性基团封端。在一特定实施例中，封端基团为烷基，例如低级烷基，诸如甲基。在另一实施例中，PEG聚合物或其衍生物具有约0. 4kDa至约2. 5kDa或约0. 6kDa 至约1.5kDa范围内的聚合物数目平均分子量。
在另一实施例中，使WtCNP或CNP变体肽偶联至包括例如二磷酸盐、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)或氨基酸序列的部分。此等氨基酸序列包括例如适用于靶向骨/ 软骨的聚Asp或聚Glu，或可来源于具有已阐明骨靶向域的骨蛋白或其衍生物，诸如骨桥蛋白(osteopontin)、骨钙化素(osteocalcin)、涎蛋白(sialoprotein)等的融合蛋白或肽序列。在本文所述的CNP22或其变体连接至骨或软骨靶向部分的实施例中，这种部分设计成促进经修饰的CNP肽到达骨生长板的软骨细胞，该肽可在此处结合并活化软骨细胞上的 NPR-B0在另一实施例中，本文提供具有不太易于被肽酶(包括NEP)切割的肽键的CNP变体。本文包括在内肽酶裂解位点包含至少一个经修饰残基的CNP变体。在一实施例中，CNP 中NEP裂解位点处的Cys6-Phe7肽键(-C ( = 0)_ΝΗ_)可经任一以下肽键等构物置换-CH2-NH-,-C( = 0)-N(R)-，其中酰氨基经任何以下R基团烷基化甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S(O)n-,其中 η 为 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-，-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，及-NHC ( = 0)ΝΗ-ο在另一实施例中，Phe7经其对映异构体D-Phe取代。在另一实施例中，将D-对映异构体引入wtCNP-22内的一或多个(至多所有22个)位点。在另一实施例中，用β氨基酸(诸如3-氨基-2-苯基丙酸)取代Wie7，这在减小侧链长度的同时增加主链长度。在另一实施例中，本文包括Cys6位置的Cys类似物，包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、 2-巯基丙酸及3-巯基丙酸。即使在Cys6与Wie7之间存在NEP抗性键，其它肽键(包括Gly8_Leu9、 LyslO-Leull、Argl3-Ilel4、Serl6-Metl7 及 Glyl9_Leu20)亦可能会被 NEP 水解。因此，本文包括在CNP类似物主链中多个位置处含有肽键等构物的CNP类似物。在一实施例中，CNP 类似物或变体在一个以上肽酶裂解位点处包含修饰。在另一实施例中，此变体包含在结合于NEP活性位点中重要的氨基酸残基处具有取代从而增强对NEP降解的抗性的CNP。一或多个NEP结合残基(包括(但不限于)6178、61715、^^18、61719及/或61721)经较大尺寸的天然或非天然氨基酸残基置换以降低对NEP活性位点的亲和力。在另一实施例中，NEP 识别所必需的一或多个疏水性残基(包括(但不限于)？&7、1^119、1^1111、11614^讨17及 Leu20)被降低NEP结合的天然或非天然氨基酸及/或肽模拟物取代。在另一实施例中，CNP 的前五个氨基酸中的一至五个可缺失或经任何其它天然氨基酸或非天然氨基酸或肽模拟物取代，或可将一或多个天然或非天然氨基酸或肽模拟物添加至CNP的前五个位置中的任一位置或所有位置。在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或 2. 8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量，且由下式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5_ (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10- (g) n_Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :46)，其中(χ)可不存在，或可选自由以下组成的群合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu ；来源于具有已阐明骨靶向域的骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的氨基酸序列；降低肾清除率的聚合或非聚合分子，诸如带电PEG分子；及延伸，包含例如聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或氨基酸，且其中此等氨基酸延伸可含有例如1至31 个，或1至35个，或5至35个，或10至35个，或15至35个氨基酸残基，且可来源于NPPC、 ANP、BNP、其它非CNP多肽或肽(诸如血清白蛋白或IgG)，或具有取代、添加及/或缺失的上述多肽的变体，或其组合；(ζ)可不存在，或可选自由以下组成的群适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu;来自骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；及来源于非CNP多肽或肽(诸如ANP或BNP)的氨基酸序列；(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg ；(b)选自由Cys、及Cys6与Phe7之间的Cys和肽键等构物(诸如Cys-CH2-NH)组成的群；(c)选自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代商素、羟基、氰基、直链或支链Cp6烷基、直链或支链CV6烷氧基、直链或支链卤基-Cp6烷基、C3_10环烷基、杂环基、C6_14芳基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置换；(d)选自Gly、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)选自Leu、Ser, Thr 及肽键等构物，诸如 N-Me-Leu ；(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg ；(g)选自Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu ；(h)选自Ile、tBu-Gly、及肽键等构物，诸如 N-Me-Ile ；⑴选自僅讨、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且
(j)选自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(homoleucine) (Hleu)、Val、叔丁基-Ala(tBu-Ala)、Ser, Thr、Arg、及肽键等构物，诸如 N-Me-Leu。在一实施例中，CNP变体在位置 6、7、8、9、10、11、13、14、16、17、19 及 / 或 20 中一
或多个位置处包含修饰，且可视情况在本文所揭示的任何其它位置处具有修饰。在本文所述的CNP22或其变体可连接至疏水性酸的实施例中，CNP肽可连接至一或多个疏水性酸。疏水性酸的非限制性实例包括直链或支链、饱和或不饱和C5-C12羧酸(例如戊酸、庚酸等)及天然脂肪酸。疏水性酸可连接至一或多个氨基酸残基的N端、C端及/ 或侧链。在一实施例中，疏水性酸偶联至N端。在一实施例中，CNP22或其变体与疏水性酸的偶联经过特别设计，以促进经修饰CNP肽与血清白蛋白之间的非特异性相互作用，藉此增大CNP肽的尺寸并保护其避免被蛋白酶(诸如NEP)切割。与疏水性酸偶联的CNP肽与白蛋白之间的相互作用的设计不能太强，以使经修饰CNP肽可扩散穿过软骨，到达骨生长板的软骨细胞，且结合及活化NPR-B。在另一实施例中，本文提供CNP变体，其在活体外或活体内刺激产生cGMP，其产量为相同浓度wtCNP22(例如ΙμΜ)下的cGMP产量的至少约50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % , 100%,110%,120%,130%,140%^ 150%，在位置(b)6、(。)7及/或(山8包含至少一个经修饰氨基酸，且由以下通式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c)厂(d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) n-Asp12-Ai^13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :47)，其中(χ)可不存在，或可为含有1至5个氨基酸且来源于如本文所述的利钠多肽(例如 NPPC、CNP, ANP或BNP)或非利钠多肽(例如HSA、IgG、骨靶向蛋白等)的肽序列；(ζ)可不存在，或可选自由以下组成的群合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨/软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu ；具有骨靶向域的骨蛋白及其衍生物，诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白的融合蛋白或肽序列；降低肾清除率的分子，诸如带电PEG ；及如本文所述增强CNP对NEP介导降解的抗性的分子；(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg ；(b)可为Cys或去羧基半胱氨酸，或(b)6_(c)7肽键(_C( = 0)_NH_)可经任一以下肽键等构物置换-CH2-NH-,-C( = O)-N(R)-，其中酰氨基经任何以下R基团烷基化甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S(0)n-，其中 η 为 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-,-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,
-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，或-NHC ( = 0) NH-;(c)选自L_Phe ；D-Phe ；3-氨基_2_苯基丙酸；Phe的肽键等构物，诸如Phe的 N-烷基化衍生物，其中N-烷基系选自由甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基及叔丁基组成的群；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代卤素、羟基、氰基、直链或支链C^6烷基、直链或支链CV6烷氧基、直链或支链卤基-Cp6烷基、C3,环烷基、C6_14芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3_氯-苯丙氨酸、 3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置换；(d)选自Gly、i^TS-Gly(tBu-Gly)、Val、kr、Thr&Asn ；(e)选自Leu、kr、Thr、及肽键等构物，诸如 N-Me-Leu ；(f)为侧链上不具有反应性伯氨基的任何天然或非天然氨基酸或肽模拟物，包括 (但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu，其中在一实施例中，(f)不为Arg;(g)选自Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu ；(h)选自Ile、tBu-Gly 及肽键等构物，诸如 N-Me-Ile ；⑴选自僅讨、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且(j)选自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。在另一实施例中，本文包括CNP变体，其在活体外或活体内刺激产生在相同浓度 wtCNP22(例如 ΙμΜ)下所产生的 cGMP 量的至少约 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、 110 %、120 %、130 %、140 %或150 %，具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或 2. SkDa至约6kDa或7kDa)的总质量以增强对NEP降解的抗性，且由以下通式表示 (χ) - (y) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Ai^13-I Ie14-Gly15-Ser16-Met17-S er18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO :48)，其中(χ)为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为聚乙二醇(PEG)，且天然聚合基团的非限制性实例为含有1至35个氨基酸且来源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的变体、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，诸如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、骨织素或FGF2;(y)可不存在，或可为一或多个来自Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (对应于CNP22的位置1至幻(SEQ ID NO 1)的氨基酸及/或在一或多个这些位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)；(h)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(h)不为Arg ；且
(z)可不存在，或可为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为PEG，且天然聚合基团的非限制性实例为来源于利钠多肽(例如NPPC、CNP、ANP 或BNP)或非利钠多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列。在一实施例中，(x)、(y)与(ζ)总共含有约10至约40个，或约15至约35个氨基酸。在另一实施例中，(X)为包含1至40个氨基酸或1至20个氨基酸的氨基酸序列。还包括在活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22 (例如1 μ Μ)下所产生的 cGMP 量的至少约 50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%或 150% 且包含以下序列的CNP变体(y) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22 (SEQ ID NO :138)，其中(y)包含一或多个选自 Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5 (SEQ ID NO 1)的氨基酸及 / 或在一或多个该位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)，且进一步包含分子量为约0. 6kDa至约5kDa的亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，亲水性或水溶性聚合物偶联至此经氨基酸延伸的CNP变体的N端。在另一实施例中，亲水性或水溶性聚合物为 PEG (或 ΡΕ0)。在另一实施例中，本文提供在活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如 ΙμΜ)下所产生的 cGMP 量的至少约 50%,60%,70%,80%,90%UOO%U10%,120%, 130%、140%或150%的CNP变体，其中这些CNP变体包含含有1至15个氨基酸的N端及/ 或C端肽延伸，且偶联至亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，肽延伸含有5至10个氨基酸。在一特定实施例中，肽延伸含有5个氨基酸。在另一特定实施例中，亲水性或水溶性聚合物为PEG (或ΡΕ0)。在另一实施例中，本文的CNP变体在活体外或活体内外刺激产生在相同浓度 wtCNP22 (例如 1 μ Μ)下所产生的 cGMP 量的至少约 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、 110 %、120 %、130 %、140 %或150 %，且包含至少一个来源于利钠肽前体C (NPPC)的15个氨基酸的片段，其中该片段与含有相同数目氨基酸残基的野生型NPPC的序列至少70%同源。在又一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或 2. 8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量以便增强NEP抗性，且由下式表示(χ) - (b) 6- (c) 7- (d) 8- (e) 9_ (f) 10- (g) n-Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-Ser16- (i) 17_Ser18-Glyi9-(J)20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :4 ，其中(χ)可不存在(亦即，以-NH2基团为N末端)，或可选自由以下组成的群来自肽 Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5(SEQ ID NO :1)的1、2、3、4或5个氨基酸的序列；适用于靶向骨 /软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp或聚Glu ；来自骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素或涎蛋白)的骨靶向域；降低肾清除率的分子，诸如亲水性或水溶性聚合物，包括(但不限于)带电PEG分子；及包含PEG、碳水化合物、疏水性酸、氨基酸或其组合的部分，其中此等部分可为氨基酸延伸，包括(但不限于)来源于NPPC或非CNP多肽或肽(诸如BNP、ANP、血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；(ζ)可不存在，或可选自由以下组成的群适用于靶向骨/软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp或聚Glu ；来源于骨靶向蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素或涎蛋白)的氨基酸序列；及来源于如本文所述的NPPC或非CNP多肽或肽的氨基酸序列；
(b)选自Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH ；(c)选自=L-Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代商素、羟基、氰基、直链或支链Cp6烷基、直链或支链CV6烷氧基、直链或支链卤基-Cp6烷基、C3_10环烷基、C6_14芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置换；(d)选自Gly、i^TS-Gly(tBu-Gly)、Val、kr、Thr&Asn ；(e)选自Leu、kr、Thr、及肽键等构物，诸如 N-Me-Leu ；(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg ；(g)选自Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu ；(h)选自Ile、tBu-Gly 及肽键等构物，诸如 N-Me-Ile ；⑴选自僅讨、￥￡114卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且(j)选自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或 2. 8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量以便增强NEP抗性，且其由下式表示；(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5_ (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) n-Asp12_Arg13- (h) 14-(i) 15-Ser16-(j) 17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(z) (SEQ ID NO :50)，其中(x)及(ζ)独立地可不存在，或可选自由以下组成的群合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨/软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp或聚Glu ；来源于骨蛋白及其衍生物(诸如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列；降低肾清除率的部分，包括(但不限于)亲水性或水溶性聚合物，诸如带电PEG分子；及包含例如亲水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸及/或氨基酸的部分；(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg ；(b)选自Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH ；(c)选自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代商素、羟基、氰基、直链或支链Cp6烷基、直链或支链CV6烷氧基、直链或支链卤基-Cp6烷基、C3_10环烷基、C6_14芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、
263-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置换；(d)选自:Gly、叔丁基-Gly、Thr、kr、Val 及 Asn ；(e)选自Leu、Ser、Thr 及肽键等构物，诸如 N-Me-Leu ；(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg ；(g)选自Leu、Asn及肽键等构物，诸如N-Me-Leu ；(h)选自Ile、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Asn 及肽键等构物，诸如 N-Me-Ile ；(i)选自Gly、Arg, Ser 及 Asn ；(j)选自僅讨、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及 2-氨基-异丁酸(Aib)；且(k)选自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Arg、Thr, Ser及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。在另一实施例中，CNP变体可在CNP22的位置1至22中任何一或多个位置具有氨基酸取代。在一实施例中，Glyl经Arg或Glu取代。在另一实施例中，Lys4经Arg置换。在又一实施例中，Gly5经Arg、Gln或Ser取代。在另一实施例中，Glyl5经kr、Asn、Arg 或Cit取代。在另一实施例中，61719经^^3印或Asn取代。在另一实施例中，Gly21经 kr、Ilir 或 Arg 取代。在一实施例中，CNP变体选自GLSKGC (CH2NH) FGLKLDRIGSMSGLGC (使用去羧基-Cys 形成)(SEQ ID NO 56)、GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 57)、GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO : 136)、GLSKGCF-(tBuG)-LKLDRIG SMSGLGC(SEQ ID NO :58)、GLSKGC-(3_Cl_Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :137)及 GLSKGC-[NHCH2CH (Ph) CO]-GLKLDRIGSMSGLGC (使用 3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO: 59)。在另一实施例中，在本文所述任何CNP变体中Cys6、Cys6位置处的去羧基-Cys或另一含巯基半胱氨酸类似物与Cys22之间存在二硫键。在另一实施例中，CNP变体在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸，包括(但不限于)DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，类似物 BL) (SEQ ID NO 60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CA) (SEQ ID NO 61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CB) (SEQ ID NO 62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CC) (SEQ ID NO 63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 64)；
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :144)(在实例及图中有时称作” CNP27-HSA” 或” HSA-CNP27”)；SPKMVQGSG-CNP17_KVLRRH(类似物 CD) (SEQ ID NO 68)(具有来源于 BNP 的 N 端及C端尾的CNP17)。在另一实施例中，CNP变体在CNP22的位置4处具有K4R取代。CNP(K4R)变体的非限制性实例包括GANRRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 AY) (SEQ ID NO 36)；GANPRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 Cl) (SEQ ID NO 37)；RGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ERGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 BA) (SEQ ID NO 39)；GANQQGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CH) (SEQ ID NO 69)；及GANSSGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CG) (SEQ ID NO 70)。在一实施例中，具有PEG (或ΡΕ0)部分及N端氨基酸延伸的CNP变体在紧接于对应于CNP22的Glyl位前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP变体经设计为增强对NEP降解的抗性、降低与血清白蛋白的结合且增强CNP功能活性(例如活化cGMP信号传导)。聚乙二醇化CNP变体的非限制性实例包括 PE024-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)、PE012-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 36) , PE024-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO :65)、PE012-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO :65)、 PE024-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :37)、PEOl2-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :37)、PE024-GANPR-CNP22(SEQ ID NO :37)、PE012-GANPR-CNP22(SEQ ID NO: 66)、PE024-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO :64)、PE012-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、 PE024-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、 PE024-ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、PE012-ER-CNP22 (SEQ ID NO :38)、PE024-R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)、PE012_R_CNP22(K4R)(SEQ ID NO :41)、PE024_R_CNP22(SEQ ID NO :40)及 PE012-R-CNP22 (SEQ ID NO :40)，其中 PE024 为单分散性 1. 2kDa PEG 聚合物且 PEO12 为单分散性0. 6kDa PEG聚合物。在一实施例中，PEG (或ΡΕ0)聚合物连接至CNP变体的N端。其它CNP变体包括(但不限于)CNP37的衍生物，这些衍生物在弗林蛋白酶裂解位点(加下划线)具有突变，旨在提高对弗林蛋白酶的活体内抗性，及/或在谷氨酰胺之前具有甘氨酸(加下划线)，旨在防止形成焦谷酰胺(pyroglutamine)，这些衍生物包括(但不限于)GQEHPNARIWKGAN￡EGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物⑶)(SEQ ID NO 71) ；GQEHP NARKIGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 CT) (SEQ ID NO 72) ；GQEHPNARKYKGANQQGLS KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CU) (SEQ ID NO 73) ；GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGS MSGLGC (类似物 CW) (SEQ ID NO 74) ；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CN P37，类似物DB) (SEQ ID NO 75) ；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-C NP37)(SEQ ID NO :145)。
在另一实施例中，CNP变体为包含CNP22及N端肽片段的嵌合体，其包括(但不限于)GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 CQ)(富含组氨酸的糖蛋白 (HRGP)片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CR) (HRGP 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CX) (HRGP 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 CF) (IgG1 (Fc)片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CT)(人类血清白蛋白 (HSA)片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 80)； GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CE) (HSA 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 CZ)(骨织素”NPR C 抑制剂，，片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 82)；及GKRTGQILGSKTGPGH(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 DA) (FGF2” 肝素结合域” 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 83)。在另一实施例中，CNP变体为包含N端肽片段及CNP22 (其中精氨酸取代CNP22的 Lys4( “CNP22(K4R)”))的嵌合体，其包括(但不限于)GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CK) (IgG1 (Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CL) (HSA 片段-CNP22 (K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CM)(纤连蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CN)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CO)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CP)(锌指片段-CNP22 (K4R) 嵌合体)(SEQ ID NO 89)。在另一实施例中，CNP变体为嵌合体或融合蛋白，其包含CNP肽或变体，及可切割肽或蛋白质，或肽标签。例示性可裂解蛋白质或肽包括(但不限于)组氨酸(例如六His) 标签；TAF12 人类转录因子TAF12 ；KSI 酮类固醇异构酶；MBP 麦芽糖结合蛋白；β-Gal β -半乳糖苷酶；GST 谷胱甘肽-S-转移酶；Trx 硫氧还蛋白(thioredoxin) ；CBD 壳多糖结合域；BMPM :BMP-2突变、SUM0、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内葡聚糖酶A的纤维素结合域、外葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA、Flag、 c-Myc、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gln)、聚(Phe)、聚(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体表位及其片段。在另一实施例中，CNP变体可为单体或二聚体。在一相关实施例中，二聚CNP变体的单体可经由接头或不经接头使N端连接至N端，经由接头或不经接头使N端连接至C端，或经由接头或不经接头使C端连接至C端。包含IgG片段及CNP22或其变体的嵌合体设计成尤其增强对NEP降解的抗性且降低与血清白蛋白的结合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合体设计成尤其降低免疫原性且降低与血清白蛋白的结合。在N端含有富含组氨酸、无赖氨酸、无精氨酸的阳离子性序列的 HRGP-CNP22及HRGP-CNP22 (K4R)嵌合体经设计为尤其增强对蛋白酶的稳定性。含有骨织素片段的嵌合体经设计以在骨生长板处在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)裂解后释放骨织素片段，其中该片段将抑制清除受体NPR-C。关于包含FGF2肝素结合片段的嵌合体，结合于片段的肝素经设计以保护嵌合体避免降解，藉此提供较长血清半衰期。含有纤连蛋白、纤维蛋白原或锌指片段的嵌合体系设计为降低与血清白蛋白的结合，以及其它有利特征。不希望受理论束缚，与wtCNP22相比对NEP降解的抗性增强且具有类似或改良的功能性(例如结合于NPR-B及刺激cGMP信号传导)的分子量为约2. 6kDa或2. 8kDa至约 6kDa或7kDa的CNP变体若不紧密结合于血浆蛋白(诸如血清白蛋白)，则可能更有效。不紧密结合于血浆蛋白(例如血清白蛋白)的CNP变体可更有效地扩散穿过软骨，到达骨生长板的软骨细胞，且结合并活化NPR-B以进行cGMP信号传导。在一实施例中，经设计为降低与血浆蛋白(例如血清白蛋白)的结合的CNP变体为包含CNP22或其变体及来自IgG的肽片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为降低与血浆蛋白的结合的CNP变体为包含CNP22 或CNP22(K4R)及来自多肽(例如IgG、HSA、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽等)的片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为降低与血浆蛋白的结合的CNP变体包含CNP22或其变体偶联至亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，亲水性或水溶性聚合物为PEG (或ΡΕ0)。在另一实施例中，亲水性或水溶性聚合物(例如PEG)经在生理条件下赋予聚合物负电荷的一或多个官能基(诸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其组合)官能化。在本文所揭示的任何实施例中，CNP变体可具有与野生型CNP22实质上相同或比其更佳的生物活性。举例而言，CNP变体例如就与NPR-B (GC-B)相互作用以刺激产生cGMP 而言，可保留野生型CNP22活性的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高于CNP22的活性。或者或另外，CNP变体就调节软骨内骨生长及软骨细胞活性而言，可保留野生型CNP22活性的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，或可具有高于0呢22 的活性，包括(但不限于)软骨细胞增殖、软骨细胞分化、有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶 /MEK(Raf-I)激酶信号传导路径的抑制，及促进软骨内骨化。在本文所述的任何实施例中， CNP变体可包含与野生型CNP22的氨基酸6-22或1_22至少40 %、50%、60 %、70 %、80%、 90 %、95 %或更高相同或同源的氨基酸序列。在另一实施例中，本文提供对NPR-C清除受体具有较小亲和力，同时保留结合及活化NPR-B的能力的CNP22变体。本文包括自或可自如实施方式中所述基于同源性的 NPR-B/CNP复合物结构模型产生的变体。在另一实施例中，CNP变体在位置1、5、8、15、19及 21的一或多个Gly位点处具有取代以降低构型柔性，此可增强其结合于NPR-B超过NPR-C 的特异性。对NPR-C的亲和力可能降低的CNP变体包括(但不限于)具有一或多个以下取代的变体G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、KlOCit、K10Q、K10S、 I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、 L20S、G21S、G21T 及 G21R。在另一实施例中，CNP变体在位置5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20及21中一或多
个位置处具有修饰及/或取代，且视情况可在本文所揭示的任何其它位置具有修饰及/或取代。在另一实施例中，CNP变体可视情况例如在N端及/或C端具有偶联或延伸以有助于靶向骨/软骨、降低肾清除率及/或增强对NEP降解的抗性。此(等)偶联或延伸可包含由以下形成或来源于以下的分子或序列例如，聚Asp、聚Glu、骨或软骨靶向肽、骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白、PEG、碳水化合物、疏水性酸、NPPC或非CNP多肽或肽，或其组合。在又一实施例中，CNP变体是藉由标准固相肽合成法，用适当时经取代及/或添加的天然或非天然氨基酸或肽模拟物来制备。在另一实施例中，CNP变体是通过重组合成方法，例如经由含有标签或载体蛋白的融合蛋白来产生，其中使用标签或载体蛋白有助于例如检测、分离及/或纯化融合蛋白，且使标签或载体蛋白自融合蛋白选择性化学裂解或蛋白水解裂解提供目标CNP变体。在另一实施例中，CNP变体的聚乙二醇化在化学或生物合成之后或作为化学或生物合成的部分进行，其中偶联反应利用基于NHS或基于醛的化学或此项技术中已知的其它化学来进行。在另一实施例中，CNP变体包含二硫键。在一相关实施例中，二硫键形成环状肽。在另一实施例中，在对应于CNP22的位置6与22的位置的半胱氨酸残基之间形成二硫键。还包括CNP变体可偶联至疏水性聚合或非聚合部分，诸如庚酸、戊酸或脂肪酸。疏水部分可偶联至氨基酸残基(包括(但不限于)赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸)的侧链，或可连接至CNP变体的N端及/或C端。在一实施例中，如本文所述的CNP变体具有在约8至约10. 5或约8. 5至约10范围内的Pi值。在另一实施例中，本文提供一种医药组合物，其包含CNP变体、视情况选用的另一生物活性剂，及视情况选用的医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施例中，这些组合物为适于非经肠注射的无菌医药组合物。在一些实施例中，组合物包含实质上纯 (例如至少约90%或95%纯)的CNP变体。在一些实施例中，这些组合物含有少于约5%、 4%、3%、2(%、1(%或0.5(%的污染物，诸如其它人类蛋白质、猪蛋白质，或0呢53或其片段 (除所需CNP变体的外)。在某些实施例中，给予个体该无菌组合物以供治疗或预防本文所揭示的任何CNP反应性病状或病症。本文的CNP变体宜保留CNP活性且显示增加的血清半衰期。保留CNP活性可显示为例如保留所需活体内生物作用，或保留在相同浓度(例如Ιμπι CNP肽或高于ED80)下 CNP22的cGMP刺激活性的至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少约100%。在一些实施例中，CNP变体显示相较于CNP22血清半衰期增至至少约1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5 倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。在一相关实施例中，本文所述的CNP变体与野生型CNP22相比具有增强的NEP抗性且显示增加的半衰期。在一实施例中，与野生型CNP22相比，CNP变体的半衰期增加约 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或约 100%。在某些实施例中，本文所述的CNP变体增加活体外cGMP产生、增加活体内cGMP产
31生、活体内增加一或多种与软骨或骨形成或生长相关的生物标记的含量、增强对活体外NEP 裂解的抗性、增加血浆或血清活体内半衰期、增强活体内生物可用性，或增加活体内特定骨的长度，或实现此等增加(增强)的组合，与野生型CNP22相比，增至约1.5倍、约2倍、约 2. 5倍、约3倍、约3. 5倍、约4倍、约4. 5倍或约5倍或更多倍。在另一实施例中，本文提供治疗CNP反应性病状或病症的方法，其包含给予有需要的个体治疗有效量的CNP变体或包含其的组合物。在一实施例中，CNP反应性病症为骨生长病症，包括(但不限于)骨骼发育不良及遗传性骨骼畸形，诸如与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-;3)突变相关的病症。在一特定实施例中，与FGFR-3突变相关的病症为软骨发育不全。在另一实施例中，CNP反应性病症为与血管平滑肌细胞及组织相关的病症。在另一实施例中，CNP变体适用于增大骨(例如肢骨)的生长板的尺寸。在另一实施例中，CNP 变体适用于使骨延长或增强长骨生长。在又一实施例中，CNP变体适用于增强软骨细胞的基质产生、增殖及分化。在某些实施例中，以约5nmol/kg 或 10nmol/kg 至约 300nmol/kg，或约 20nmol/kg 至约200nmol/kg范围内的剂量给予本文所述的CNP变体。在一些实施例中，以约5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、210、 220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750 或 2000nmOl/kg的剂量或治疗医师认为适当的其它剂量给予CNP变体。在其它实施例中，以约 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750 或 800μ g/kg，或约 lmg/kgU. 25mg/kg、 1. 5mg/kg、2mg/kg的剂量或治疗医师认为适当的其它剂量给予CNP变体。本文所述的CNP 变体的剂量可根据本文所述的给药频率/给药频率来给予，这些频率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。在另一实施例中，以单次治疗或多次剂量形式给予CNP变体。多次剂量可在疗程内每日给予，或分多次剂量给予。在某些实施例中，包括以如下频率给予CNP变体单次剂量或多次剂量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每两周、每3周、每月、每 6周、每2个月、每3个月，或治疗医师认为适当的频率。在某些实施例中，调节CNP变体的给予以留出生长期(例如软骨生成)，接着为恢复期(例如骨生成)。举例而言，可皮下、静脉内，或藉由另一模式每日或每周多次给予 CNP变体持续一段时间，接着为无治疗时期，接着重复该循环。在一些实施例中，初始治疗期(例如每日或每周多次给予CNP变体)持续3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8 周、9周、10周、11周或12周。在一相关实施例中，无治疗时期持续3日、1周、2周、3周或4 周。在某些实施例中，CNP变体的给药疗程为每日给药持续3日，接着3日不给药；或每日或每周多次给药持续1周，接着3日或1周不给药；或每日或每周多次给药持续2周，接着 1或2周不给药；或每日或每周多次给药持续3周，接着1、2或3周不给药；或每日或每周多次给药持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接着1、2、3或4周不给药。在其它实施例中，本文提供一种治疗CNP反应性病状或病症的方法，其包含给予个体CNP肽或变体，及监测个体中(例如来自个体的生物样品中)至少一种骨或软骨相关生物标记的含量，其中骨或软骨相关生物标记的含量增加或降低表明CNP肽或变体对该个体具有治疗作用。在一些实施例中，当生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加时，该生物标记含量的增加表明CNP肽或变体对该个体具有治疗作用。在其它实施例中，当生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而降低时，该生物标记含量的降低表明CNP肽或变体对该个体具有治疗作用。在其它实施例中，治疗方法进一步包含调节给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率，其中(i)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量低于目标含量，则增加给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率；或(ii)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量高于目标含量，则降低给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率；或(iii)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而降低的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量高于目标含量，则增加给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率；或(iv)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而降低的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量低于目标含量，则降低给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率。预期生物标记的目标含量指与个体中治疗作用及/或在缓解或改善病症或病状的症状方面的有益作用相关的生物标记的含量或含量范围。在某些实施例中，高于或低于目标含量的生物标记含量可能对个体有害。在其它实施例中，本文包括一种评估给予CNP肽或变体对骨或软骨形成或生长的影响的方法。在一实施例中，该方法提供分析或量测已给予CNP肽或变体的个体中至少一种骨或软骨相关生物标记的含量以评估CNP肽或变体在活体内对骨及软骨形成及生长的影响。在一相关实施例中，至少一种骨或软骨相关生物标记的含量增加可表明给予CNP肽或变体对骨或软骨形成或生长具有积极影响且为适用于与CNP活性降低相关的骨骼发育不良及其它骨或软骨相关疾病或病症的治疗。例示性骨或软骨相关生物标记包括(但不限于)CNP (例如内源性含量的CNP-22或CNP-53)、cGMP、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、 I型原胶原的前肽(PINP)及其片段、I型胶原蛋白及其片段、II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素(aggrecan chondroitin sulfate) 及碱性磷酸酶。在其它实施例中，本文包括一种评估CNP肽或变体对个体中至少一种骨或软骨相关生物标记的含量的影响的方法，其包含分析或量测来自已给予CNP肽或变体的个体的生物样品中骨或软骨相关生物标记的含量。在一些实施例中，该方法进一步包含给予个体CNP 肽或变体，随后分析或量测骨或软骨相关生物标记的含量。在某些实施例中，至少一种骨或软骨相关生物标记选自CNP (例如内源性含量的 CNP-22或CNP-53)、cGMP、II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、I型原胶原的前肽(PINP)及其片段、I型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。在与骨或软骨相关生物标记有关的方法(例如治疗方法、诊断方法及分析方法)的一些实施例中，CNP肽或变体为CNP-22、CNP-53,或本文所述的任何CNP肽及变体。在此等方法的某些实施例中，CNP肽或变体不是CNP-22或CNP-53。在其它实施例中，本文提供一种重组产生CNP变体的方法，其包含将包含编码CNP 变体肽的多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的多核苷酸的宿主细胞在培养基中在使得由这些多核苷酸编码的融合多肽得以表达的条件下培养。在一相关实施例中，宿主细胞经包含编码CNP变体肽的多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的多核苷酸的表达载体转化。在一实施例中，载体为质粒。在又一实施例中，质粒选自pET-21a、pjexpress、 pET-31b、pET-15b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pQE-30、pET-SUMO、pET_22b 及 pTYBll。在某些实施例中，可切割肽或蛋白质包含选自由以下组成的群的多肽组氨酸标签、人类转录因子TAF12、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域，及ΒΜΡ-2突变，或其片段。在一相关实施例中，可切割肽或蛋白质由切割剂切割。在一些实施例中，切割剂选自甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割(protein self cleavage)、因子)(a、肠激酶、ftx)TEV及SUMO蛋白酶。其它例示性切割剂包括(但不限于)钯、梭菌蛋白酶 (clostripain)、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、肠肽酶、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、枯草杆菌蛋白(subtilisin)、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、变种枯草杆菌蛋白酶(furilisin)、IgA蛋白酶、人类I^ce蛋白酶、胶原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皱胃酶(rerminM凝乳酶(chymosin))、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、钙蛋白酶(calpain)、木瓜凝乳酶(chymopapain)、无花果酶(ficin) (无花果蛋白酶(ficain))、菠萝酶(bromelain)(菠萝蛋白酶(bromelase))、组织蛋白酶B(cath印isin B)、卡斯蛋白酶(caspase)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、内切蛋白酶 Arg-C、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素(kallikrein)及纤维蛋白溶酶。在某些实施例中，融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。在一相关实施例中，本文包括自宿主细胞或培养基分离所表达的融合多肽。在另一实施例中，使经分离的融合多肽与如本文所述的切割剂接触。在一实施例中，本文提供一种包含表达载体的细菌宿主细胞，该载体包含编码CNP 变体肽的多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，可切割肽或蛋白质选自组氨酸标签、人类转录因子TAF12、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、 β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域，及ΒΜΡ-2突变，或其片段。在另一实施例中，宿主细胞为细菌，诸如大肠杆菌(E. coli)。在一相关实施例中，大肠杆菌细胞选自BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS、BL21 (DE3) pGro7、ArcticExpress (DE3)、 C41 [亦称作 C41 (DE3) ]、C43 [亦称作 C43 (DE3) ]、Origami B (DE3)、Origami B (DE3) pLysS、 KRX及Timer(DE;3)。在另一实施例中，宿主细胞包含如上所述的载体。在一些实施例中，宿主细胞在细胞培养的前经载体转化。在某些实施例中，包括在培养基中在适于表达由多核苷酸编码的融合多肽的条件下培养宿主细胞。在一实施例中，融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。在一相关实施例中，自宿主细胞或培养基分离所表达的融合多肽。在又一实施例中，使经分离的融合多肽与如本文所述的切割剂接触。

图1展示大肠杆菌中CNP融合蛋白的表达(图IA 考马斯蓝染色，图1B:蛋白质印迹分析)。M 蛋白质标记；T 总细胞溶胞物；S:可溶上清液；P :2yg CNP22 ；KSI KSI-CNP (M/N)融合蛋白表达(不可溶)；N:未诱导的KSI-CNP融合蛋白总溶胞物；KSI ’ KSI-P-CNP融合蛋白表达(不可溶)；Trx =Trx-P-CNP融合蛋白表达(可溶)；MBP MBP-P-CNP融合蛋白表达(可溶)；TAF =TAF-P-CNP融合蛋白表达(不可溶)(BL21) ；TAF’ TAF-P-CNP融合蛋白表达(不可溶)BL21 (DE3)，其中CNP为Gly_CNP37 ；图2展示TAF-CNP包涵体的甲酸裂解。M 蛋白质标记；1 :Gly_CNP37阳性对照；2 未裂解的TAF-CNP包涵体；3 甲酸裂解的TAF-CNP包涵体，其中CNP为Gly_CNP37 ；图3A-E描绘大肠杆菌中CNP融合蛋白的表达。M 蛋白质标记；Tu 未经诱导的总细胞溶胞物；Su 未经诱导的可溶上清液；T 诱导的总细胞溶胞物；S 可溶上清液；Cl CNP22 ；C :Gly-wtCNP37 ( “CNP38”)；P 不可溶沉淀。A :KSI :KSI_CNP38 (M/N)融合蛋白表达(不可溶)；KSI，:KSI-Pro-CNP38 (Pro_Gly-wtCNP37 指定为” Pro_CNP38 ”)融合蛋白表达(不可溶)；Trx :Trx-Pro-CNP38融合体表达(可溶)；MBP :MBP-Pro-CNP38融合蛋白表达(可溶)；TAF:来自BL21细胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表达(不可溶)；TAF’ 来自BL21 (DE3)细胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表达(不可溶)。B :TAF-Pro_CNP37及 BMP-Pro-CNP37融合蛋白表达。C :BMP-Pro_CNP38融合蛋白及BMP蛋白质表达。D TAF-Pr o-HSA-CNP ( "Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO :188)指定为”Pro-HSA-CNP，，)融合蛋白表达。E :TAF-Pro-CNP38融合蛋白及TAF蛋白质表达；图4A-C描绘TAF-Pro-CNP38包涵体的甲酸切割。A :TAF-Pro_CNP38包涵体的50 % 甲酸切割。M 蛋白质标记；U 未切割的TAF-Pro-CNP38包涵体；25 °C、37 °C、42 °C、55 °C TAF-Pro-CNP38包涵体在50%甲酸中在25°C、37°C、42°C或55°C下切割24小时。37°C -S及 55°C -S 来自37°C及55°C下的切割反应、以ION NaOH中和且在14，OOOrpm下离心15分钟的可溶上清液。B :TAF-Pro-CNP38包涵体的10%及2%甲酸切割。M 蛋白质标记；U 未切割的TAF-Pro-CNP38包涵体；C 甲酸切割的TAF-Pro_CNP38 ；S 无中和下在14，OOOrpm下离心5分钟后的可溶上清液；P 无中和下在14，OOOrpm下离心5分钟后的不可溶沉淀；C 来自TAF-Pro-CNP38包涵体的2%及10%甲酸切割产物的LC/MS分析；图5A-C描绘在不同温度及甲酸切割时间下TAF-Pro_CNP38包涵体的甲酸切割。M 蛋白质标记；C :Gly-wtCNP37(‘‘CNP38”)阳性对照；U 未切割的TAF_Pro_CNP38包涵体。A 在 42°C、55°C或 70°C下以 2% 甲酸切割 6、24 或 48 小时的 TAF_Pro_CNP38。B 在 55°C、60°C、 65°C或 70°C下以 2% 甲酸切割 17 或 24 小时的 TAF-Pro_CNP38。C 来自 TAF-Pro_CNP38 包涵体的2%甲酸切割产物的LC/MS分析；图6为TAF-CNP34融合蛋白表达的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)。M 蛋白质标记； C 对照Wly-CNP37(“CNP38”)] ；T 总细胞溶胞物；S 上清液；TI 经诱导的总细胞溶胞物； SI 经诱导上清液；图 7 为融合蛋白 TAF-NL- (C/A 及 6D/6E) _Pro_CNP38、TAF (C/A 及10D/10E)-Pro-CNP38 及 TAF_Pro_CNP53 表达的 SDS-PAGE(考马斯蓝染色)，其中” Pro-CNP38”表示 Pro-Gly-CNP37。Μ:蛋白质标记；C 对照[Gly-CNP37 ( “CNP38，，)] ；T 总细胞溶胞物；TI 经诱导的总细胞溶胞物；S 上清液；SI 经诱导上清液；图8为融合蛋白TAF-CNP34及TAF_Pro_CNP53的甲酸切割产物的SDS-PAGE (考马斯蓝染色)。M 蛋白质标记；P:阳性对照[Gly-CNP37(“CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀；图9为展示TAF-CNP3甲酸切割后CNP-34的峰的LC/MS层析图；图10为展示TAF-Pro-CNP53甲酸切割后Pro_CNP53的峰的LC/MS层析图；图 11 为融合蛋白 TAF (C/A 及 4D/4E) -Pro-CNP38 及 TAF (4D/4E) -Pro-CNP38 表达的SDS-PAGE (考马斯蓝染色)，其中” ft~o-CNP38”表示Pro_Gly-CNP37。M 蛋白质标记；C 对照[Gly-CNP37( “CNP38”)] ；T 总细胞溶胞物；TI 经诱导的总细胞溶胞物；S 上清液； SI 经诱导上清液；图 12 为融合蛋白 TAF (4D/4E) -Pro_CNP38 及 TAF (C/A 及 4D/4E) -Pro_CNP38 的甲酸切割产物的SDS-PAGE (考马斯蓝染色)，其中”Pro-CNP38”表示Pro_Gly-CNP37。M :蛋白质标记；P 阳性对照[Gly-CNP37( “CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀；图 13 为融合蛋白 TAF-NL-(C/A 及 6D/6E)-Pro_CNP38 及 TAF (C/A 及 10D/10E) -Pro-CNP38的甲酸切割产物的SDS-PAGE (考马斯蓝染色)，其中” Pro-CNP38"表示 ftx)-Gly-CNP37。M 蛋白质标记；P 阳性对照[Gly_CNP37 ( “CNP38”)] ；U 未切割；C 切割；CS 切割的上清液；CP 切割的沉淀；图14为在BL21 (DE3)细胞的IOL发酵物中产生的TAF-Pro_CNP38融合蛋白的使用抗CNP抗体的蛋白质印迹分析，其中在OD6tltl = 64时及第17小时诱导这些细胞且” Pro-CNP38” 表示 Pro_Gly-CNP37 ；图15为来自较粗Pro-Gly_CNP37 ( "Pro-CNP38")产物的SP-琼脂糖阳离子交换管柱层析的洗脱级分的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)。A 水中的TAF-Pro-CNP38包涵体 (IB) ；B :甲酸盐中的IB ；C :甲酸盐中的IB，经中和；D 中和的沉淀；E 中和的上清液；F TMAE Hi-CAP负载；G 流经的TMAE Hi-CAP/SP-琼脂糖负载；H 流经的SP-琼脂糖；SP-琼脂糖洗脱级分1-47 10微升/泳道；图16展示N端聚乙二醇化CNP22偶联物在活体外对中性内肽酶(NEP)的抗性程度；图17描绘在N端具有氨基酸延伸的CNP变体[“CNP27”为GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)]的NEP抗性程度；图 18 说明 N 端聚乙二醇化 CNP17 及 GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27”) (SEQ ID NO 36)的NEP抗性程度；图 19 说明 wtCNP22 及 CNP 变体 Gly_CNP37、GHKSEVAHRFK_wtCNP27 (图中的” CNP27-HSA”)(SEQ ID NO :144)及 PE012-GANRR-CNP22 (K4R)(图中的” CNP27-PE012”) (SEQ ID NO 36)的 NEP 抗性程度；图20展示具有N端氨基酸延伸的CNP变体在NIH3T3细胞中活体外刺激cGMP 产生的能力。这些结果是相对于在ΙμΜ CNP22存在下产生的cGMP含量。”CNP27”为GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO 36)；图 21 展示 N 端聚乙二醇化 CNP17 及 GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27”) (SEQ ID NO 36)在NIH3T3细胞中刺激cGMP产生的能力；图22说明CNP22的N端聚乙二醇化对cGMP产生的影响；图 23 说明 NIH3T3 细胞中由 wtCNP22 及 CNP 变体 Gly_CNP37、 GHKSEVAHRFK-wtCNP27 ( "CNP27-HSA" ) (SEQ ID NO : 1 44)、wtCNP29 及 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27-PE012，，)(SEQ ID NO :36)诱导的 cGMP 产生；图24A及B展示在活体外信号传导竞争分析法中，CNP-22及 Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")经由NPR-B、以类似剂量-反应曲线、且以比经由NPR-A高得多的程度刺激cGMP产生，且显示NPR-B相对于NPR-C选择性的类似概况；图25显示每日一次1小时或每日一次2小时将大鼠软骨肉瘤细胞暴露于CNP22在逆转FGF2诱导的软骨细胞生长停滞方面与连续暴露于CNP22具有实质上类似的有效性；图^A及B展示来自对CNP22对FGF2停滞的大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞的影响进行的剂量反应研究的结果；图27A-D展示将CNP22添加至藉由FGF2停滞的RCS细胞中增加基质合成且部分抑制FGF2，如由35S-硫酸盐及3H-Pro并入基质中或在基质中减少所评估。A及C图，合成；B及 D图，降解；A及B图,3 量测；C及D图，3H量测。统计学上显著的差异经突出显示(AN0VA ； *p < 0. 05，**p < 0. 01)；图28A-C展示以FGF2及CNP22培养的RCS细胞中聚集蛋白聚糖及纤连蛋白产生的程度(mRNA，图A及C，及蛋白质，图B)；图 29 展示 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R)(图中的” CNP27-PE024，，) (SEQ ID NO 36)在离体小鼠器官模型中刺激野生型股骨的纵向生长的功效；图 30 展示每两日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理的2-3日龄野生型小鼠胫骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值士 SEM (n = 8)的形式表示；图 31 展示每两日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理的2-3日龄软骨发育不全FGFR3aeh小鼠胫骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值士 SEM (n = 7-8)的形式表示；图 32 展示每两日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理的2-3日龄野生型小鼠股骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值士 SEM (n = 8)的形式表示；图 33 展示每两日以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理的2-3日龄FGFR3aeh小鼠股骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值士 SEM (n = 3-7)的形式表示；图34Α-Ι描绘每两日离体处理的FGFR3aeh小鼠股骨中的CNP37生物分布。图A-C 说明股骨远端中的分布，图D-F说明关节软骨细胞中的分布且图G-I说明肥大软骨细胞中的分布；图35A-C描绘在每两日以CNP22或CNP37处理野生型及FGFR3aeh小鼠股骨持续8 日之后生长板中增殖柱的细胞结构。㈧无处理，⑶处理后每柱的细胞数，(C)处理后的形态学研究。图35C(i)至C(Vi)中的图对应于图35B中所述的样品顺序。数据以平均值士 SEM (n = 4-8)的形式表示；图36A-C描绘在每两日以CNP22或CNP37离体处理野生型及FGFR3aeh小鼠股骨持续8日之后的软骨细胞肥大。(A)无处理，(B)处理后的细胞尺寸，(C)处理后的形态学研究。图36C(i)至C(vi)中的图对应于图36B中所述的样品顺序。数据以平均值士SEM(n =4-9)的形式表示；图37A-I描绘经活体内处理的FGFR3aeh小鼠胫骨中的CNP37生物分布。图A-C展示股骨远端中的分布，图D-F说明关节软骨细胞中的分布且图G-I说明肥大软骨细胞中的分布；图38A-C说明CNP37对FGFR3aeh小鼠胫骨生长板的活体内作用㈧总生长板厚度，(B)增殖区厚度，及(C)肥大区厚度。数据以平均值士SEM(n = 7-15)的形式表示；图 39 展示来自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) ( “CNP27-PE024，，) (SEQ ID NO 36)离体处理的野生型小鼠股骨的条件培养基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；图 40 展示来自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)离体处理的FGFR3aeh小鼠股骨的条件培养基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；图 41 描绘来自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)离体处理的野生型小鼠胫骨的条件培养基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；图 42 展示来自以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)离体处理的FGFR3aeh小鼠胫骨的条件培养基中的cGMP含量(ρ < 0. 01)；图43显示使野生型及FGFR3aeh小鼠股骨离体暴露于CNP22、CNP37或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)使条件培养基中切割的第II型胶原蛋白的含量增加(P < 0. 05)；图44描绘自野生型小鼠及FGFR3Y367G小鼠(严重软骨发育不全的小鼠模型)分离且以载体或ΙμΜ Pro-Gly-CNP37 ( "ProCNP38 ”)离体处理6日的股骨肥大区，表明 Pro-Gly-CNP37处理使得生长板中的骨生长及扩展增强；图 45 展示静脉内(i. v.)给予大鼠的 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在血浆中具有比CNP22长得多的半衰期及高得多的生物可用性；图 46 说明皮下(s. c.)给予大鼠的 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在血浆中亦具有比CNP22长得多的半衰期及高得多的生物可用性；图 47 显示静脉内给予的 CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)在大鼠中刺激比CNP22高得多的cGMP产生量；图 48 展示皮下给予的 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)及(以较低程度)CNP37实质上比CNP22更有效地在大鼠中刺激cGMP产生；图 49 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理的野生型小鼠的体重量测值；图 50 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理的野生型小鼠的尾长量测值；图 51 说明以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理 FGFR3adl小鼠对身长的影响(ρ = 0.02，单尾t-检验，不等变异)；
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图 52 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)对 FGFR3ach 小鼠尾长的影响；图 53A 及 B 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)对 FGFR3aeh小鼠的远程长骨(A，尺骨；B，胫骨)长度的影响(ρ < 0. 01，单尾t_检验，不等变异)；图 54A 及 B 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)对 FGFR3aeh小鼠的近端骨(A，肱骨；B，股骨)长度的影响(ρ < 0. 01，单尾t_检验，不等变异)；图55说明给予CNP37矫正近端肢骨短小(近端肢长不成比例)，如由在FGFR3aeh 小鼠中观察到的股骨胫骨比率所评估(P < 0.01，单尾t-检验，不等变异)；图 56 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)对 FGFR3ach 小鼠头长的影响(P <0.01，单尾t-检验，不等变异)；图57展示以CNP37处理FGFR3aeh小鼠使外耳道(EAM)尺寸增加(P = 0. 03，单尾 t-检验，不等变异)；图 58 展示 CNP22、CNP37 及 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)对软骨发育不全小鼠的脊椎长度的影响，其表达为椎骨体(例如腰椎5)延伸；图 59 展示以 CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理 FGFR3ach 小鼠使得给药后15分钟cGMP血浆含量增加；图 60 说明以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理 5 周
的FGFR3aeh小鼠中切割的第II型胶原蛋白的血清含量；图 61 展示以 CNP22、CNP37 或 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理 5 周
的FGFR3aeh小鼠中骨钙化素的血清含量；图 62 展示来自以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理的野生型小鼠的给药后15分钟的cGMP血浆含量(ρ < 0. 05)；图 63 展示以 Gly-CNP37 或 PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)处理 5 周的野生型小鼠中切割的第II型胶原蛋白的血清含量；图64-66展示在给予野生型小鼠载体或20nmol/kg或70nmol/kg Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")之后cGMP、切割的第II型胶原蛋白及碱性磷酸酶的含量；图67及68描绘在依据不同给药疗程给予载体或Pro_Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38") 之后，切割的第II型胶原蛋白及总碱性磷酸酶含量；图69说明在两个个别研究(Si及S2)中在第37日相对于第1日，经 Pro-Gly-CNP37 ( "Pro-CNP38")及载体处理的动物的身长的相对增加；图70A及B展示在给予Pro-Gly_CNP37 (“ft~0-CNP38”)之后骨密度(A)及骨矿质含量⑶的变化；图71展示第36日在最后一次皮下给予CNP变体之后15分钟的血浆cGMP含量，其中在图 71-73 中，Gly-wtCNP37 为” CNP38”，Pro-Gly-wtCNP37 为” Pro_CNP38”，且 GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO :144)为，，HSA-CNP27” ；图 72 展示以 Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37 或 GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO :144) 处理的小鼠的切割的第II型胶原蛋白的血清含量；图 73 展示以 Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37 或 GHKSEVAHRFK-CNP27 (SEQ ID NO :144)处理的小鼠的碱性磷酸酶的血清含量；图74A及B描绘在以1 μ M Gly_CNP37短期㈧或长期⑶处理后cGMP反应的脱敏；图 75A 显示以 200nmol/kg Pro_Gly-CNP37 ( “Pro_CNP38”)每日处理野生型小鼠持续8日不使cGMP反应脱敏。图75B展示一日一次以200nmol/kg Pro_Gly-CNP37处理小鼠持续连续两日增强cGMP反应；图76A-D展示以200nmol/kg Gly_CNP37处理野生型小鼠刺激股骨远端(软骨及骨)(A)、股骨皮层(骨)(B)、耳翼(软骨)(C)及肾脏⑶中的cGMP分泌。图76E-H展示肝(E)、心脏(F)、肺(G)及脑(H)组织在所研究时点相对于载体对照并未显示响应于 Gly-CNP37的显著cGMP分泌；图77-82展示来自在经每日皮下注射载体或10 μ g/kg或36 μ g/kg Pro-Gly-CNP37的正常幼年猕猴中正进行的研究的结果。两种剂量的Pro_Gly-CNP37均具有增加的生长板宽度(图77)、增加的左胫骨及右胫骨长度(图78A及B)、增加的腿长(图 79)、增加的臂长(图80)、增加的身长(图81)，及增加的碱性磷酸酶血清含量(图82)；及图83描绘Gly_CNP37制剂的降解速率常数(K。bs)在pH 3-8及5°C、25°C及40°C 下随PH值变化的观察曲线图。
具体实施例方式本发明涉及CNP的新颖变体，其对NEP及/或NPR-C具有降低的亲和力，且对NEP 的切割作用及/或NPR-C的清除作用具有降低的敏感性；包含此等CNP变体的医药组合物；及使用此等CNP变体来治疗CNP反应性病症的方法，这些病症包括(但不限于)骨相关病症(诸如软骨发育不全)及与血管平滑肌细胞及组织相关的病症。A.定义除非另作说明，否则本申请案(包括说明书及申请专利范围)中所用的以下术语具有下文给出的定义。除非上下文另有明确规定，否则如说明书及随附申请专利范围中所用，不定冠词” 一”及定冠词”该/这些”包括复数个以及单数个所指物。术语”约”或”大约”指如一般技术者所测定的特定值具有可接受的误差，其部分视量测或测定该值的方式而定。在某些实施例中，术语”约”或”大约”指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施例中，术语”约”或”大约”指在指定值或范围的30^^25^^20%, 15%,10%,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%>0. 5%或 0. 05% 以内。每当术语”约” 或”大约”置于一系列两个或两个以上数值中的第一个数值之前时，应了解术语”约”或”大约，，适用于该系列中的每个数值。术语”环境温度”及”室温”在本文中可互换使用且指周围环境(例如进行反应或储存组合物的空间)的温度。在某些实施例中，环境温度或室温为约15°C至约^°C，或约 15°C至约25°C，或约20°C至约28 V，或约20 V至约25°C，或约22°C至约28 V，或约22°C至约25°C的范围。在其它实施例中，环境温度或室温为约15°C、16°C、17V、18°C、19°C、20°C、 21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C或 28°C。标准化学术语的定义可见于参考著作中，包括Carey及Sundberg，AdvancedOrganic Chemistry (高等有机化学)第3版，A及B卷(Plenum Press,纽约1992)。除非另有规定，否则本发明的实施可采用在此项技术的技能内的合成有机化学、质谱分析、制备型及分析型层析、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术及药理学的某些习知方法。例如参看 Τ· E· Creighton，Proteins :Structures and Molecular Properties (蛋白质结构禾口分子特性)(W. H. Freeman 和公司，1993) ；A. L Lehninger, Biochemistry (生物化学)(Worth 出版公司，第 4 版，2004) ；Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验手册)(第 2 版，1989) ；Methods In Enzymology (酶学方法)(S. Colowick 及 N. Kaplan编，Academic Press,Inc.) ；Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington 药典)第 18 片反(Easton，Pennsylvania :Mack Publishing Company, 1990)。本文中(无论上文或下文)所引用的所有公开案、专利及专利申请案均以全文引用的方式并入本文中。本文通篇使用以下氨基酸缩写丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg (R)天冬酰胺Asn (N)天冬氨酸Asp (D)半胱氨酸Cys (C)谷氨酰胺Gln (Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly (G)组氨酸His(H)异亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)赖氨酸Lys (K)甲硫氨酸Met (M)苯丙氨酸Phe (F)脯氨酸Pro(P)丝氨酸Ser (S)苏氨酸Thr(T)色氨酸Trp (W)酪氨酸Tyr⑴缬氨酸Val (V)“多肽”及”蛋白质”指由经由肽键或肽键等构物连接的氨基酸残基、其天然存在的相关结构变体及非天然存在的合成类似物构成的聚合物。合成多肽可例如使用自动化多肽合成器来合成。术语”多肽”及”蛋白质”不限于产物的最小长度。术语”蛋白质”通常指较大多肽。术语”肽”通常指较短多肽。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体及其类似物均包括于该定义内。该定义包括全长蛋白质与其片段。术语”多肽”及”蛋白质”亦包括多肽或蛋白质的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化及其类似修饰。此外，出于本文的目的，”多肽” 可包括对原生序列的”修饰”，诸如缺失、添加、取代(其性质上可具有保守性，或可包括用以下取代人类蛋白质中通常存在的20种氨基酸中的任一者，或任何其它天然或非天然存在的氨基酸或非典型氨基酸)及化学修饰(例如添加肽模拟物或以肽模拟物取代)。此等修饰可为有意的，如经由定点突变诱发，或经由氨基酸的化学修饰以移除或连接化学部分，或可为意外的，诸如经由产生蛋白质的宿主引起的突变，或经由因PCR扩增所致的错误。在本文中使用习知符号来描绘多肽序列多肽序列的左手端为氨基端；多肽序列的右手端为羧基端。“保守性取代”系指多肽中的氨基酸经功能上、结构上或化学上类似的天然或非天然氨基酸取代。在一实施例中，以下群组各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸(1)丙氨酸(A)、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴；(2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；
(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；(5)亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；及(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。在另一实施例中，以下群组各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸(1)甘氨酸(G)、丙氨酸㈧；(2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；(5)亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)；(6)丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)；及(7)丝氨酸⑶、苏氨酸⑴、半胱氨酸(C)。在另一实施例中，氨基酸可如下所述来分组。(1)疏水性Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp ；(2)中性亲水性=Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ；(3)酸性Asp、Glu ；(4)碱性His、Lys、Arg ；(5)影响主链取向的残基Gly、Pro ’及(6)芳族Trp、Tyr、Phe、Hi s。在一实施例中，本文所述的肽或多肽系使用编码CNP变体的多核苷酸经由重组方式产生。因此，本文包括编码本文所述的任何CNP变体的多核苷酸，包含此等多核苷酸视情况连接至表达控制序列的宿主细胞或载体，及使用此等多核苷酸、载体或宿主细胞来产生本文的CNP变体的方法。由此等多核苷酸表达的CNP变体可藉由包括以下的方法产生在适于表达编码CNP变体的多核苷酸的条件下，使宿主细胞在培养基中生长，及自宿主细胞或培养基分离表达产物。实际表达产物可视任何转译后加工而与所编码的蛋白质产物略微不同。“多核苷酸”系指由核苷酸单元构成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，诸如脱氧核糖核酸(“DNA”)及核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。术语”核酸”通常系指较大多核苷酸。术语”寡核苷酸”通常系指一般不超过约50个核苷酸的较短多核苷酸。应了解，当将核苷酸序列以DNA序列(亦即A、T、G、C)表示时，核苷酸序列亦包括”U”置换”Τ” 的RNA序列(亦即A、U、G、C)。”cDNA”系指与mRNA互补或相同的呈单股或双股形式的DNA。“表达控制序列”指调控其所可操作地连接的核苷酸序列的表达的核苷酸序列。” 可操作地连接”系指两个部分之间的功能关系，其中一部分的活性(例如调控转录的能力) 引起对另一部分的作用(例如序列的转录)。表达控制序列可包括(例如且不限于)启动子(例如诱导性或组成性启动子)、强化子、转录终止子、起始密码子(亦即ATG)、内含子的拼接信号及终止密码子的序列。“重组多核苷酸”指具有在天然状态下并不联接在一起的序列的多核苷酸。经扩增或组装的重组多核苷酸可包括于适合载体中，且该载体可用于转化适合宿主细胞。将包含重组多核苷酸的宿主细胞称作”重组宿主细胞”。接着于重组宿主细胞中表达基因以产生例如”重组多肽”。重组多核苷酸亦可提供非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。如本文中所用，”嵌合体”指包含至少两个异源多核苷酸或多肽序列(亦即，来源于不同来源或彼此无关的天然存在的序列)的多核苷酸或多肽，这些异源多核苷酸或多肽序列系使用此项技术中通常已知的技术(例如重组表达或化学交联)直接或间接连接在一起。在一实施例中，异源序列可包含蛋白质或肽直接或间接连接至CNP肽或变体，包括可自 CNP肽或变体切割的蛋白质或肽。在一相关实施例中，CNP变体为如本文所述的嵌合体。在某些实施例中，嵌合体包括包含可切割载体蛋白或肽标签的CNP融合蛋白。术语”可切割载体蛋白”或”切割可切割肽标签”指可直接或经由接头间接融合至异源多肽序列，且可使用使切割可切割肽或多肽自异源多肽或蛋白质切割或分离的试剂自异源序列移除的肽或多肽序列。在一些实施例中，可切割载体蛋白或肽标签改良融合蛋白或异源多肽的产生、纯化及/或侦测。例示性可切割载体蛋白及肽标签包括(但不限于)人类转录因子 TAF12(TAF12)、酮类固醇异构酶(KSI)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(Trx)、壳多糖结合域(CBD)、BMP-2突变(BMPM)、 SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白Α、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内葡聚糖酶A的纤维素结合域、外葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA、Flag、C-MyC、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gin)、聚(Phe)、聚(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体表位及其片段。“切割剂”为适用于自异源多肽或蛋白质切割或分离例如可切割肽或多肽的试剂。例示性切割剂包括(但不限于)钯、溴化氰(CNBr)、甲酸、羟胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、肠激酶(肠肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子)(a蛋白酶、枯草杆菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、变种枯草杆菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人类I^ce蛋白酶、胶原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皱胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、钙蛋白酶、木瓜凝乳酶、无花果酶(无花果蛋白酶)、菠萝酶(菠萝蛋白酶)、组织蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纤维蛋白溶酶。在两个或两个以上多核苷酸或多肽序列的情形中，术语”相同”或”相同性”百分比系指当比较及对准以获得最大对应性时，如使用一种以下序列比较算法或藉由目测来量测，两个或两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。在两个核酸或多肽的情形中，词组”实质上同源”或”实质上相同”一般指当比较及对准以获得最大对应性时，如使用一种以下序列比较算法或藉由目测所量测，两个或两个以上序列或子序列具有至少40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或98 %核苷酸或氨基酸残基相同性。在某些实施例中，实质同源性或相同性存在于长度为至少约25、50、100或 150个残基的序列的区域上。在另一实施例中，这些序列在比较生物聚合物中任一者或两者的整个长度上实质上同源或相同。对于序列比较，通常以一个序列充当参考序列，用于与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列及参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，且指定序列算
43法的程序参数。接着由序列比较算法依据所指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列相同性百分比。供比较的序列的最佳对准可由以下来进行例如Smith及Waterman，Adv. Appl. Math.(高等应用数学)，2 :482(1981)的局部同源性算法、Needleman及mmsch， J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，48 443 (1970)的同源性对准算法、Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.USA,85 :2444(1988)的相似性搜寻法、此等算法的计算机化实施 (Wisconsin Genetics 软件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 及 TFASTA，Genetics Computer Group (遗传学计算机组)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或目测。适用算法的一实例为 PILEUP,其使用 Feng 及 Doolittle，J. Mol. Evo 1.(分子进化学杂志)，35 :351-360 (1987) 的渐进式对准法的简化形式且类似于Higgins及Sharp，CABI0S，5 :151-153(1989)所描述的方法。适用于产生序列多重对准的另一算法为Clustal W(Thompson等人，Nucleic Acids Research (核酸研究)，22 :4673-4680 (1994))。适用于测定序列相同性及序列相似性百分比的算法实例为BLAST算法(Altschul等人，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)， 215 :403-410(1990) ；Henikoff 及 Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :10915(1989)； Karlin 及 Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5787 (1993))。执行 BLAST 分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) 公开获得。如下所述，两个核酸序列或多肽实质上同源或相同的另一指标为第一核酸所编码的多肽可与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。因此，例如当一多肽与第二多肽不同的处仅在于保守性取代时，该两种多肽通常实质上相同。如本文所述，两个核酸序列实质上相同的另一指标为两个分子在严格条件下彼此杂交。“实质上纯”或”经分离”指目标物质为主要存在物质(亦即以摩尔浓度计，比组合物中任何其它个别大分子物质的丰度高)，且实质上纯化的部分为目标物质占所存在的所有大分子物质的至少约50% (以摩尔浓度计)的组合物。在一实施例中，实质上纯的组合物指，以摩尔浓度或重量计，相关物质占组合物中所存在大分子物质的至少约70%、75%、 80^^85%,90^^95^^98%或更高。若组合物基本上由单一大分子物质组成，则目标物质经纯化至基本均质(藉由习知侦测方法在组合物中不可侦测到污染物质)。出于此定义的目的，溶剂物质、小分子(< 500道尔顿)、稳定剂(例如BSA)及元素离子物质不被视为大分子物质。在一实施例中，本文的化合物为实质上纯或经分离。在另一实施例中，本文的化合物相对于其制造中所用的大分子起始物质为实质上纯或经分离。在另一实施例中，本文的医药组合物包含实质上纯或经分离的CNP变体与一或多种医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂及视情况与另一生物活性剂混合。如应用于目标的”天然存在”指该目标可见于自然界的事实。举例而言，存在于生物体(包括病毒)中且未经人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。在一实施例中，”天然存在的”物质具有人类来源。“野生型” (Wt)为提及物种的多核苷酸、多肽或蛋白质的天然形式(包括序列)的术语。野生型形式有别于自遗传突变产生的多核苷酸、多肽或蛋白质的突变形式。在一实施例中，作为第二多肽的”类似物”或”变体”或”衍生物”的第一多肽为与该第二多肽具有至少约50^^60%或70%序列同源性但小于100%序列同源性的多肽。此等类似物、变体或衍生物可包含非天然存在的氨基酸残基(包括(但不限于)高精氨酸、鸟氨酸、青霉胺及正缬氨酸)以及天然存在的氨基酸残基。此等类似物、变体或衍生物亦可由一个或复数个D-氨基酸残基构成，且亦可含有肽模拟物或肽键等构物，诸如两个或两个以上氨基酸或肽模拟物残基之间的非肽键。在另一实施例中，若第一多肽不为第二多肽的已知切割产物或不为第二多肽的已知前体，则即使第一多肽与第二多肽具有100%序列同源性或其具有野生型序列，第一多肽仍为该第二多肽的”类似物”、，，变体”或”衍生物”。在一实施例中，如本文中所用，术语”来源于”系指多肽或肽序列系基于野生型或天然存在的多肽或肽序列且可具有天然氨基酸、非天然氨基酸或肽模拟物的一或多个缺失、添加及/或取代。在一实施例中，衍生序列与野生型或天然存在的序列共享至少约 40 %、50 %、60 %或70 %但小于100 %的序列相似性。在另一实施例中，衍生物可为多肽的片段，其中该片段与野生型多肽在至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度上实质上同源(例如至少约70%、75%、80%、85%、90%或95%同源)。在又一实施例中，若多肽具有野生型多肽上所不存在的部分(例如聚合物，诸如PEG)与其直接或间接连接，则即使该两种多肽的氨基酸序列共享100%同源性，该多肽仍”来源于”该野生型多肽。如本文中所用，”NPPC来源的”多肽系指来源于利钠肽前体C(NPPC)多肽的多肽，其为1 个氨基酸的单链前原多肽且在切割后最终产生wtCNP22。将信号肽自NPPC移除得到原CNP，且以内切蛋白酶弗林蛋白酶进一步切割产生53个氨基酸的活性肽(CNP-53)，其经分泌且经未知酶再切割，产生22个氨基酸的成熟肽(CNP或CNP-22)。因此，CNP22本身因来源于NPPC而为”NPPC来源的”多肽。在一实施例中，NPPC来源的多肽与野生型NPPC 在相同数目的氨基酸残基上至少约40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 % 同源。进一步预期，NPPC来源的肽可包含NPPC多肽的约1至约53个，或1至37个，或1 至35个，或1至31个，或1至27个，或1至22个，或10至35个，或约15至约37个残基。在一实施例中，NPPC来源的肽可包含具有来源于NPPC多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52 或 53 个氨基酸的序列。术语”有效量”指足以对个体的健康状况、病理学或疾病产生所需结果或用于诊断目的的剂量。所需结果可包含剂量接受者的主观或客观改良。”治疗有效量”指对健康有效产生预定有利作用的药剂量。任何个别情况下的适当”有效”量均可由一般技术者使用常规实验来决定。应了解，用于任何特定患者的特定剂量浓度及给药频率均可改变且将视多种因素而定，包括所用特定化合物的活性；该化合物的生物可用性、代谢稳定性、排泄速率及作用时长；化合物的给予模式及时间；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别及膳食；及特定病状的严重度。“治疗”指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。在某些实施例中，”治疗”指出于治疗、预防或诊断目的给予个体化合物或组合物。“预防性”治疗为出于降低产生病变的风险的目的给予未显示疾病征兆或仅显示疾病早期征兆的个体的治疗。可以预防性治疗的形式给予本文的化合物或组合物以降低产生病变的可能性或若已产生则将病变的严重度降至最小。“治疗性”治疗为给予显示病变征兆或症状的个体以用于减弱或消除彼等征兆或症状的目的的治疗。这些征兆或症状可为生化、细胞、组织、功能或身体、主观或客观征兆或症状。本文的化合物亦可以治疗性治疗的形式给予或给予用于诊断。“诊断”指鉴别病理学病状的存在、程度及/或性质。诊断方法在其特异性及选择性方面不同。尽管特定诊断方法可能不提供病状的确诊，但该方法若能提供有助于诊断的正面指示则已足够。“骨或软骨相关生物标记”或”骨或软骨相关标记”指生长因子、酶、蛋白质或其它可侦测生物物质或部分，其含量与例如软骨更新(cartilage turnover)、软骨形成、软骨生长、骨吸收、骨形成、骨生长或其组合相关而增加或降低。此等生物标记可在给予如本文所述的CNP变体之前、期间及/或之后量测。例示性骨或软骨相关生物标记包括(但不限于) CNP、cGMP、第II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、I型胶原蛋白的前肽及其片段、I型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。可在任何适当生物样品(包括(但不限于)组织、血液、血清、血浆、脑脊髓液、滑液及尿)中量测软骨及骨相关生物标记。在一些实施例中，在来自经历功效/药效学活体内研究的动物及/或来自离体研究的条件培养基的血液、血浆或血清中量测生物标记。在某些实施例中，量测至少一种骨或软骨相关生物标记的含量，且可根据所量测生物标记含量来调节给予个体的CNP变体的给予量或频率。在一些实施例中，生物标记的含量”低于目标含量”或”高于目标含量”。生物标记的目标含量为在接受CNP变体的个体中观察到治疗作用时生物标记的含量或含量范围。在某些实施例中，患有CNP反应性病症或病状的个体的生物标记目标含量为在未受影响的正常个体中观察到的生物标记的含量或含量范围。在其它实施例中，为指示治疗作用，生物标记的目标含量不需要与在正常个体中观察到的生物标记的含量或含量范围相等，但可在未受影响的个体中观察到的生物标记的”正常”含量或含量范围的例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%或5%以内。举例而言，若生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加，则指示治疗作用的生物标记的目标含量可高于未经给予CNP变体的患CNP反应性病症的患者中生物标记的含量，且可视情况低于未患该病症的个体中生物标记的”正常”含量、大致等于该生物标记的”正常”含量，或高于该生物标记的”正常”含量。在一实施例中，若生物标记的含量低于目标含量，则表明治疗作用不足，可能需要增加所给予CNP变体的给予量或频率。在一相关实施例中，若生物标记高于目标含量，则表明已给予多于必要量的CNP变体，可能需要降低所给予CNP变体的给予量或频率。再举一实例，若生物标记的含量与骨或软骨形成或生长相关而降低，则指示治疗作用的生物标记的目标含量可低于未经给予CNP变体的患CNP反应性病症的患者中生物标记的含量，且可视情况高于未患该病症的个体中生物标记的”正常”含量、大致等该生物标记的”正常”含量，或低于该生物标记的”正常”含量。在该种情况下，可能适用上述调节CNP 变体给予量及频率的相反情况。“医药组合物”指在个体动物(包括人类及哺乳动物)中适用于医药用途的组合物。医药组合物包含治疗有效量的CNP变体、视情况选用的另一生物活性剂，及视情况选用的医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一实施例中，医药组合物包含包含以下的组合物活性成分，及构成载体的惰性成分，以及经由任何两种或两种以上成分的组合、复合或聚集，或经由一或多种成分的解离，或经由一或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产物。因此，本文的医药组合物包括混合本文的化合物与医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂所制得的任何组合物。“医药学上可接受的载体”指任何标准医药载体、缓冲剂及其类似物，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5%葡聚糖水溶液，及乳液(例如油/水或水/油乳液)。赋形剂的非限制性实例包括佐剂、黏合剂、填充剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、助流剂、甜味剂、调味剂及着色剂。适合医药载体、赋形剂及稀释剂描述于Remington药典(Remington药典)第19版(Mack Publishing Co.，Easton，1995)中。较佳医药载体视活性剂的预定给予模式而定。典型给予模式包括经肠(例如经口)或非经肠(例如皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或表面、经皮或经黏膜给予)。“医药学上可接受的盐”为可调配为医药用化合物的盐，包括(但不限于)金属盐 (例如钠、钾、镁、钙等)及氨或有机胺的盐。“医药学上可接受”或”药理学上可接受”指并非在生物学上或其它方面不合需要的物质，亦即该物质可给予个体而不会引起任何不合需要的生物作用，或不会以有害方式与含其的组合物中的任何组分或与个体的身体上或体内所存在的任何组分相互作用。术语”单位剂型”系指适于以单一剂量形式用于人类及动物个体的实体不连续单元，各单元以足以产生所需作用的量计算含有预定量的本文的化合物，视情况与医药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体或载体结合。本文的新颖单位剂型的规格视以下而定所用特定化合物及欲达成的效果，及宿主中与各化合物相关的药效学。“生理状况”指动物(例如人类)体内的状况。生理状况包括(但不限于)体温，及生理性离子强度的水性环境、PH值及酶。生理状况亦包括特定个体体内不同于大多数个体中存在的”正常”状况的状况，例如这些状况不同于约37°C的正常人类体温或不同于约 7.4的正常人类血液pH值。“生理pH值”或”生理学范围内的pH值”指在包括约7. 0至8. 0在内的范围内、较通常在包括约7. 2至7. 6在内的范围内的pH值。如本文中所使用，术语”个体”包括哺乳动物及非哺乳动物。哺乳动物的实例包括 (但不限于)哺乳动物纲的任何成员人类、非人类灵长类动物(诸如黑猩猩)，及其它猿及猴物种；农畜，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如兔、犬及猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其类似动物。非哺乳动物的实例包括(但不限于)鸟类、鱼及其类似动物。该术语不指定特定年龄或性别。除非另有指示，否则术语”聚乙二醇”、”PEG”、”聚环氧乙烷”及”ΡΕ0”在本文中可互换使用。经由氨基偶联至与数值η相关的”PEOn”聚合物的CNP肽(CNP22或其变体)一般具有式CH3-[-0-CH2CH2-]n-C( = 0)-NHR，其中η为环氧乙烷单元的数目且R表示肽的剩余部分。"PEOn”聚合物可视情况在羰基碳与重复的环氧乙烷单元之间具有伸烷基(CH2)m，其中 m为1至5的整数。该种"PEOn”(例如PE012或PE024)聚合物具有单分散性，亦即，其为具有特定分子量的单一不连续聚合物。类似地，经由氨基偶联至与数值nK相关的"ΡΕ&ιΚ”聚合物的CNP肽一般具有式CH3-[-O-CH2CH2-]P-C( = 0)_NHR，其中ρ为大于1的整数。"ΡΕ&ιΚ” 聚合物亦可视情况在羰基碳与重复的环氧乙烷单元之间具有伸烷基(CH2)m，其中m为1至 5的整数。然而，该种” PEGnK” (例如PEG1K、PEG2K、PEG5K或PEG20K)聚合物具有多分散性，亦即含有具有分子量分布的聚合物的混合物，其中数值nK表示聚合物的数目平均分子量(Mn)(以千道尔顿为单位)。举例而言，偶联至CNP肽的”PEGI”表示具有数目平均分子量为约2kDa的聚合物的多分散性PEG聚合物。除非另作明确指示，否则当指定聚合物(例如PEG)的质量范围(例如以kDa为单位)时，该范围指聚合物数目平均分子量的范围，而非多分散性混合物中多种聚合物的分子量的范围。术语”卤素”、，，卤化物”或”卤基”系指氟、氯、溴及/或碘。术语”烷基”指直链或支链饱和单价烃基，其中烷基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。在某些实施例中，烷基为具有1至20个(C1-JU至15个(CV15)U至 12个(CV12)U至10个(C1,)或1至6沁_6)个碳原子的直链饱和单价烃基，或具有3至 20 个(C3_J、3 至 15 个(C3_15)、3 至 12 个(C3_12)、3 至 10 个(C3_10)或 3 至 6 (C3_6)个碳原子的支链饱和单价烃基。如本文中所使用，直链Ch6及支链c3_6烷基亦称为”低碳烷基”。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基(包括所有异构形式，包括正丙基及异丙基)、丁基(包括所有异构形式，包括正丁基、异丁基、仲丁基及叔丁基)、戊基(包括所有异构形式)及己基(包括所有异构形式)。举例而言，Ch6烷基指具有1至6个碳原子的直链饱和单价烃基或具有3至6个碳原子的支链饱和单价烃基。术语”烷氧基”指-0-烷基。在某些实施例中，烷氧基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。术语”卤代烷基”指经一或多个卤原子取代的烷基。在某些实施例中，卤代烷基系经一、二、三、四、五或六个卤原子取代。在某些实施例中，卤代烷基可视情况经一或多个如本文所述的其它取代基Q取代。术语”环烷基”指可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代的环状饱和桥联及/或非桥联单价烃基。在某些实施例中，环烷基具有3至20(C3_J、3至15(C3_15)、3至 12 (C3_12)、3至10 (C3_1Q)或3至7 (C3_7)个碳原子。环烷基的实例包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、十氢萘基及金刚烷基。术语”杂环基”或”杂环”指单环非芳族环系统或含有至少一个非芳族环的多环系统，其中一或多个非芳族环原子为独立地选自0、S或N的杂原子，且其余非芳族环原子为碳原子。在某些实施例中，杂环基或杂环基团具有3至20个、3至15个、3至10个、3 至8个、4至7个或5至6个环原子。在某些实施例中，杂环基为单环、双环、三环或四环系统，其可包括稠合或桥联的环系统，且其中氮或硫原子可视情况经氧化，氮原子可视情况经季铵化，且一些环可为部分或完全饱和，或为芳族。杂环基可于使得产生稳定化合物的任何杂原子或碳原子处连接至主结构。杂环基团的实例包括(但不限于)吖啶基、氮杂草基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并异嚼唑基、苯并异_嗪基、苯并二噪烷基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并呋喃基、苯并萘并呋喃基(benzonaphthofuranyl)、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并苯硫基、苯并三唑基、苯并硫代吡喃基、苯并嚼嗪基、苯并嘿唑基、苯并噻唑基、β -咔啉基、咔唑基、色满基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氢异喹啉基、二苯并呋喃基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异_嗪基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氧戊环基、二氢吡嗪基、二氢吡啶基、二氢吡唑基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氧戊环基、1，4-二噻烷基、呋喃酮基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲唑基、吲哚啉基、吲嗪基、吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、异色满基、异香豆素基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异嚼唑烷基、异B恶唑基、吗啉基、萘啶基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、η恶二唑基、_唑烷酮基、卩恶唑烷基、嚼唑并吡啶基、嚼唑基、环氧乙烷基(oxiranyl)、萘嵌二氮苯基、菲啶基、菲咯啉基(phenathrolinyl)、吩吡嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基基、吩_嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡嗪基、批唑烷基、批唑基、哒嗪基、吡啶基、吡啶并吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基(tetrahydrofuryl)、四氢呋喃基 (tetrahydrofurany 1 )、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四唑基、噻二唑并嘧啶基、噻二唑基、噻吗啉基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基及1，3，5-三噻烷基。在某些实施例中，杂环基团可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。术语”芳基”指含有至少一个芳族烃环的单环芳族基团或多环单价芳族基团。在某些实施例中，芳基具有6至20个(C6_2。)、6至15个(C6_15)或6至10(C6_10)个环原子。芳基的实例包括(但不限于)苯基、萘基、弗基、奧基、蒽基、菲基、芘基、联苯及三联苯。芳基亦指至少一个环为芳族且其它环可为饱和、部分不饱和或芳族的双环或三环碳环，例如二氢萘基、茚基、二氢茚基及四氢萘基(萘满基)。在某些实施例中，芳基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。术语”杂芳基”指含有至少一个芳族环的单环芳族基团或多环芳族基团，其中至少一个芳族环含有一或多个独立地选自0、s及N的杂原子。杂芳基的各环可含有一或两个0 原子、一或两个S原子及/或一至四个N原子，限制条件为各环中杂原子的总数为四或四以下且各环含有至少一个碳原子。杂芳基可于使得产生稳定化合物的任何杂原子或碳原子处连接至主结构。在某些实施例中，杂芳基具有5至20个、5至15个或5至10个环原子。单环杂芳基的实例包括(但不限于)吡咯基、批唑基、批唑啉基、咪唑基、嗯唑基、异嗯唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、嘴二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基及三嗪基。双环杂芳基的实例包括(但不限于)吲哚基、苯并噻唑基、苯并P恶唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、喷嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色原酮基、香豆素基、噌啉基、喹喔啉基、喷唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基及四氢喹啉基。三环杂芳基的实例包括(但不限于) 咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基及咕吨基。在某些实施例中，杂芳基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。术语”视情况经取代”意欲指基团(包括烷基、烷氧基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基及杂芳基)可经一或多个取代基Q(在一实施例中，一、二、三或四个取代基Q)取代，其中各Q独立地选自由以下组成的群氰基、卤基、氧、硝基、(；_6烷基、 CV6烷氧基、卤基-CV6烷基、C3_7环烷基、杂环基、C6_14芳基、杂芳基、-C (0) Re、-C (0) ORe、-C(O) NRfRg, -C (NRe) NRfRg、-ORe、-OC(O) R% -OC(O) 0R% -OC(O)NRfRg, -OC ( = NRe) NRfRg, -OS(O) R% -OS(O)2Re, -OS (0) NRfRg, -OS (0) 2NRfRg、-NRfRg, -NReC (0)Rf、-NReC (0) 0Rf, -NReC (0) NRfRg, -NReC ( = NRh) NRfRg, -NReS (0) Rf、-NReS (0) 2Rf、-NReS(O) NRfRg、-NReS (0) 2NRfRg、-SRe、-S (0) Re、-S (0) 2Re 及-S (0) 2NRfRg，其中各 Re、Rf、Rg 及 Rh 独立地为氢、CV6烷基、C3_7环烷基、杂环基、C6_14芳基或杂芳基；或Rf及Rg连同其所连接的N原子一起形成杂环基。B. GNP 变体CNP22作为治疗剂的用途受限于其在血浆中的短半衰期(J. Clin. Endocrinol. Metab.(临床内分泌代谢杂志)，78 1428-35 (1994))。在人类血浆中，CNP22的浓度通常小于5皮摩尔。在人体中，CNP22由NEP及NPR-C降解且自循环中清除(Growth Hormone&IGF Res. , 16 :S6-S14)。在使用全身性给予的CNP22的所有人类及动物研究中，均已使用连续输注来增加个体体内的CNP22浓度。具有较长半衰期及至少类似程度功能性的CNP肽将有益于基于CNP的治疗策略。CNP变体亦揭示于相关国际申请案第PCT/US08/84270号(以引用的方式明确并入本文中)中。本文提供对NEP及/或NPR-C具有降低的亲和力，且对NEP的切割及NPR-C的清除作用具有降低的敏感性，但具有与野生型CNP22相比实质上类似或更佳的功能性的CNP变体。CNP变体对NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的敏感性降低将使变体的血浆或血清半衰期增加，藉此增加变体分布至目标组织及部位且实现所需药理学作用的机会。在某些实施例中，与wtCNP22相比，本文所述的CNP变体对NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的活体外或活体内敏感性至少降至约1/1. 5、1/2、1/2. 5、1/3、1/3. 5、1/4、1/4. 5或1/5，且与 wtCNP22相比，活体内血浆或血清半衰期至少增至约1. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、4倍、 4. 5倍或5倍，同时保留wtCNP22功能性的至少约50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %，或具有wtCNP22功能性至少约1. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、4倍、4. 5倍或5倍大的功能性。可在活体外或活体内研究中就一或多种与软骨或骨形成或生长相关的生物标记(例如 cGMP)的含量、在离体或活体内研究中就特定骨的长度等来评估CNP功能性。NEP的天然底物较小且利钠肽(约2. 2kDa至约3. 2kDa)为最大的天然底物。根据X射线结晶学分析，NEP活性位点深埋于中央腔隙内部，从而有效限制底物分子大小不超过约3kDa (Oefner等人，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，四6 :341-349 (2000))。基于 NPR-B信号传导研究，CNP-22的变体(诸如CNP_17(仅保留CNP22的环状域Cys6-Cys22) 及CNP-53 (在N端具有31个氨基酸的延伸的CNP-22))仍可类似于2. 2kDa wtCNP-22结合并活化NPR-B。因此，本文包括在CNP22或其变体的N端及/或C端偶联至天然聚合物(例如肽)及/或合成聚合物(例如PEG)的CNP变体，其显示NEP抗性增强，但保留结合及活化NPR-B信号传导受体的能力。在一实施例中，本文包括由以下通式表示的CNP变体(χ) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Serl6-Met17-Serl8-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (z) (SEQ ID NO :139)，或(χ) -Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :140)，其中(χ)及(ζ)各自独立地为本文所述的天然聚合物(例如含有至少一个氨基酸的肽序列)及/或合成聚合物(例如PEG)，使得CNP变体的总质量的特征在于本文一般描述的范围，例如在约2. 6kDa或2. 8kDa至约6kDa或7kDa的范围内。在一实施例中，Cys6至Cys22 的残基形成环状部分。在一实施例中，(χ)及/或(ζ)包含来源于NPPC或非CNP多肽(例如ANP、BNP、IgG等)的氨基酸延伸，其中该延伸含有1至40个、1至35个、1至31个、5至 35个、5至31个或5至15个氨基酸。在另一实施例中，CNP变体在CNP22的一或多个以下
50位置包含一或多个另一天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模拟物及/或肽键等构物的修饰及 / 或取代=GlyU Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、LyslO、LeulU Ilel4、Glyl5、Serl6、 Metl7、Glyl9、Leu20 及 Gly21。在另一实施例中，总质量特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. SkDa 至约6kDa或7kDa)，经设计为增强对NEP降解的抗性的CNP变体系由以下通式表示
(χ) -Cys6-Phe7-Gly8-Leu9- (h) !O-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22- (z) (SEQ ID NO :141)，或(χ) -Gly1-Leu2-Ser3- (b) 4 "Gly5-Cy S6-Phe7-Gl y8-Leu9- (h) 10-Leun-Asp12-Arg13-Ile H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :6)，其中(χ)为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为 PEG(PEO)，且天然聚合基团的非限制性实例为含有1至35个氨基酸且来源于以下的氨基酸序列NPPC或其具有取代及/或缺失的变体、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，诸如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、骨织素或成纤维细胞生长因子2(FGF2)；(ζ)可不存在或可为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为PEG，且天然聚合基团的非限制性实例为来源于利钠多肽(例如NPPC、CNP、ANP或 BNP)或非利钠多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且(b)及(h)可独立地为该位置的野生型Lys，或可经由保守性氨基酸取代或经侧链上不具有反应性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、 6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Glu或义！·)置换。在一实施例中，(b)为Arg。在另一实施例中，为提高NEP抗性，(b)不为Gly。在另一实施例中，(h)不为Arg。来源于NPPC或其变体的氨基酸序列的非限制性实例包括Arg,Glu-Arg,Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 7),Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 8),Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO 9),Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO: 10)，Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO :11)，Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO :12)，Gly-Ala-Asn-Arg-Met(SEQ ID NO :13)，Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(SEQ ID NO :14)，Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO :15)，Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO :16)，Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO :17)，Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO :18)，Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO 19)，Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ IDNO 20)，Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO :21)，及Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-G Iu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO 22)。来源于非CNP多肽(诸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性实例包括Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO 23)；Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO 24)；Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 25)；Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO 26)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO 27)；Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO 28)；Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO 29)；Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO 30)；Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID NO 31)；Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO :32)。在一实施例中，如本文所述，具有(χ)及/或(ζ)基团的任何CNP变体的N端(χ) 基团及/或C端(ζ)基团独立地包含含有少量(若存在)天然或非天然酸性氨基酸(例如 Asp或Glu)的氨基酸序列。在另一实施例中，(χ)及/或(ζ)富含天然或非天然碱性氨基酸(例如Lys、Arg或His)，以维持类似CNP22的pi值(pi 8. 9)的碱性pi值。在一实施例中，CNP变体的pi值在约8至约10. 5的范围内，旨在使得CNP变体可更容易扩散穿过包围骨生长板的软骨细胞的细胞外基质。在较窄的实施例中，CNP变体的pi值为约8. 5至约 10. 5，或约8. 5至约10，或约9至约10。在另一实施例中，(χ)及/或(ζ)富含天然或非天然极性氨基酸，旨在增强水溶性。在又一实施例中，(X)及/或(Z)含有少量(若存在)天然或非天然疏水性氨基酸(例如 Ala、Val> Leu> Ile 或 Met)。在另一实施例中，CNP变体的N端以至少一个甘氨酸残基终止，其设计在于增加血清半衰期。在相关实施例中，为防止形成焦谷氨酰胺，CNP变体的N端以甘氨酸残基终止，或者以谷氨酰胺终止。在一实施例中，(χ)基团含有延伸的氨基酸，其N端以至少一个甘氨酸残基终止。在另一实施例中，(χ)及/或(ζ)不含两个相邻天然或非天然碱性氨基酸(例如Lys-Lys或Arg-Arg)，旨在降低对弗林蛋白酶切割的敏感性。在一实施例中，(χ)不含紧接于对应于CNP22的Glyl的位置之前的两个相邻碱性氨基酸。在又一实施例中，CNP变体的(χ)基团及/或(ζ)基团包含来源于NPPC (例如来源于CNP53)的氨基酸序列。在一实施例中，(χ)包含来源于ANP或BNP的N端尾的氨基酸序列。在另一实施例中，(ζ)包含来源于ANP或BNP的C端尾的氨基酸序列。在另一实施例中，(χ)及/或(ζ)包含来源于非利钠多肽的氨基酸序列，诸如，例如IgG、人类血清白蛋白 (HSA)、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、TOF-2及骨靶向蛋白(例如骨织素、骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)。在本文所述的CNP22或其变体可具有N端(χ)基团及/或C端(ζ)基团的任何实施例中，(X)及/或(Z)可独立地含有来源于骨形态发生蛋白(BMP)的功能域的氨基酸序列。藉由增加CNP变体的总质量以使其特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或 2. SkDa至约6或7kDa的范围)，来源于BMP的功能域的N端及/或C端氨基酸延伸可增强 NEP抗性，且因此增加CNP变体的血清半衰期。另外，因为某些BMP为诱导骨及软骨形成的生长因子及细胞因子，所以来源于BMP的功能域的片段可通过不同于以CNP22或其变体的环状域活化NPR-B的鸟苷酸环化酶功能的机制促进软骨细胞、软骨或骨生长。促进骨形成及发育、软骨形成及发育及/或成骨细胞分化的BMP的非限制性实例包括BMP1、BMP2、BMP3、 BMP5、BMP7及BMP8a。在一实施例中，CNP22或其变体的N端及/或C端独立地偶联至来源于BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7或BMP8a的C端部分中最后140个氨基酸的氨基酸序列。在一实施例中，CNP变体在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸，包括(但不限于)DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，类似物 BL) (SEQ ID NO 60)；AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CA) (SEQ ID NO 61)；AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CB) (SEQ ID NO 62)；DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CC) (SEQ ID NO 63)；RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 40)；ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 38)；GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 64)；GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 65)；GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 66)；GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 67)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :144)；及SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (类似物 CD)(具有来源于 BNP 的 N 端及 C 端尾的 CNP17) (SEQ ID NO 68)。在另一实施例中，CNP变体在CNP22的位置4具有K4R取代。CNP (K4R)变体的非限制性实例包括GANRRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 AY) (SEQ ID NO 36)；GANPRGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 Cl) (SEQ ID NO 37)；RGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ERGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 BA) (SEQ ID NO 39)；GANQQGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CH) (SEQ ID NO 69)；及GANSSGLSEGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CG) (SEQ ID NO 70)。在其它实施例中，CNP变体为包含CNP22或其具有氨基酸添加、缺失及/或取代的变体，及位于CNP肽N端的来源于除CNP外的多肽或蛋白质的肽片段，或完整非CNP多肽或蛋白质的嵌合体，其中CNP22或其变体可视情况具有一或多个氨基酸残基的N端氨基酸延伸。在某些实施例中，CNP嵌合体包含CNP22或其具有一或多个氨基酸残基的N端氨基酸延伸的变体。在某些实施例中，CNP嵌合体在紧接于CNP22或其变体的第一位置(在CNP22 的情况下为Gly)之前含有赖氨酸-赖氨酸(KK)残基或GANKK残基。在其它实施例中，CNP 嵌合体在紧接于CNP22或其变体的第一位置之前含有一或两个不同于赖氨酸-赖氨酸的残基。可紧接于CNP22或其变体的第一位置之前的残基的非限制性实例包括KP、PK、PR、 PQ、QK、QQ、RR、SS、GANKP(SEQ ID NO :200)、GANPK(SEQ ID NO :201)、GANPR(SEQ ID NO :9)、 GANPQ(SEQ ID NO :202)、GANQK(SEQ ID NO :203)、GANQQ(SEQ ID NO :10)、GANRR(SEQ ID NO 8)及 GANSS(SEQ ID NO :11)。在另一实施例中，CNP变体为包含CNP22及N端肽片段的嵌合体，包括(但不限于)GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CQ)(富含组氨酸的糖蛋白 (HRGP)片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 76)；GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CR) (HRGP 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 77)；GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CX) (HRGP 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 78)；GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CF) (IgG1 (Fc)片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 79)；GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CT)(人类血清白蛋白 (HSA)片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 80)；GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CE) (HSA 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 81)；FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 CZ)(骨织素”NPR C 抑制剂，，片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 82)；及GKRTGQILGSKTGPGH(GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物 DA) (FGF2” 肝素结合域” 片段-CNP22 嵌合体)(SEQ ID NO 83)。在另一实施例中，CNP变体为包含N端肽片段及CNP22 (其中精氨酸取代CNP22的 Lys4( “CNP22(K4R)”))的嵌合体，包括(但不限于)GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CK) (IgG1 (Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 84)；GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CL) (HSA 片段-CNP22 (K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 85)；GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CM)(纤连蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 86)；GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CN)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 87)；GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CO)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 88)；及GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CP)(锌指片段-CNP22 (K4R)嵌合体)(SEQ ID NO 89)。包含IgG及CNP22或其变体的嵌合体经设计为尤其增强对NEP降解的抗性且减少与血清白蛋白的结合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合体经设计为尤其降低免疫原性且减少与血清白蛋白的结合。在N端含有富含组氨酸、无赖氨酸、无精氨酸的阳离子性序列的 HRGP-CNP22及HRGP-CNP22 (K4R)嵌合体经设计为尤其增强对蛋白酶的稳定性。含有骨织素片段的嵌合体经设计以在骨生长板处在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)切割后释放骨织素片段，其中该片段将抑制清除受体NPR-C。关于包含FGF2肝素结合片段的嵌合体，结合于片段的肝素经设计以保护嵌合体避免降解，从而提供较长血清半衰期。含有纤连蛋白、纤维蛋白原或锌指片段的嵌合体经设计为减少与血清白蛋白的结合，以及其它特征。不希望受理论束缚，如与wtCNP22相比，对NEP降解的抗性增强且具有类似或改良的功能性(例如结合于NPR-B及刺激cGMP信号传导)的分子量为约2. 6kDa或2. 8kDa至约6kDa或7kDa的CNP变体若不紧密结合于血浆蛋白(诸如血清白蛋白)，则可能更有效。不紧密结合于血浆蛋白(例如血清白蛋白)的CNP变体可更有效地扩散穿过软骨，到达骨生长板的软骨细胞，且结合并活化NPR-B以进行cGMP信号传导。在一实施例中，经设计为减少与血浆蛋白(例如血清白蛋白)的结合的CNP变体为包含CNP22或其变体及来自IgG 的肽片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为减少与血浆蛋白的结合的CNP变体为包含 CNP22或CNP22(K4R)及来自多肽(例如IgG、HSA、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽等) 的片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为减少与血浆蛋白的结合的CNP变体包含CNP22 或其变体偶联至亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，亲水性或水溶性聚合物为PEG (或 ΡΕ0)。在另一实施例中，亲水性或水溶性聚合物(例如PEG)经一或多个在生理条件下赋予聚合物负电荷的官能基(诸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其组合)官能化。在另一实施例中，本文的CNP变体包括介于人类CNP-17(hCNP_17)至人类 CNP-53 (hCNP-53)的范围内，且具有来源于hCNP-53的野生型氨基酸序列的截短CNP肽。此等截短CNP肽包括DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO 4)；LRVDTKSRAAffARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO 146)；RVDTKSRAAffARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO 147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO
148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49) (SEQ ID NO
149)；TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO:
150)；KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO:
151)；SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46) (SEQ ID NO:152)；RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO :153)；AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO :154)；AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO :155)；WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO :156)；ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :157)；RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO :158)；LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :159)；LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :160)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO 60)；EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO :161)；HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO :162)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO :163)；NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33) (SEQ ID NO :164)；ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO :165)；RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO :166)；KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO :167)；YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :168)；KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO :169)；GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO :170)；ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO :171)；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO :172)；KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO :173)；KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO :174)；GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO 1)；LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO :175)；SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO :176)；KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO :177)；GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18) (SEQ ID NO :178)；及CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(SEQ ID NO :2)。在某些实施例中，CNP变体不包括CNP-17、CNP-22或CNP-53。在另一实施例中，介于hCNP-17至hCNP-53范围内的截短CNP肽可在特定截短CNP 肽的任一或多个氨基酸位置含有如本文所述天然或非天然氨基酸或肽模拟物(例如肽键等构物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。在另一实施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代的截短CNP肽可在N端、C端及/或内部位点偶联至本文所述的任何部分，包括(但不限于)靶向骨或软骨的部分(例如二磷酸盐、靶向骨或软骨的肽序列(例如聚 Asp、聚Glu)、来源于骨蛋白(例如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白)的骨靶向域的肽序列)、来源于骨形态发生蛋白(例如BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、BMP8a)的功能域的肽序列、来源于利钠多肽(例如NPPC、ANP、BNP)的肽序列、来源于非利钠来源多肽(例如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、FGF-2、骨织素)的肽序列、降低肾清除率的部分(例如带负电PEG部分)、亲水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物(例如由骨生长板的细胞表面上的受体识别的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸、天然脂肪酸)、磷脂及其组合。在一实施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代且视情况在N端、C端及/或内部位点偶联至一或多个部分的截短CNP肽具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. 8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量。在另一实施例中，CNP变体为CNP37的衍生物，该CNP37为 QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (SEQ ID NO 60)。CNP37 变体可在 CNP37 的 37 个位置中任一或多处含有天然或非天然氨基酸或肽模拟物(例如肽键等构物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。依据CNP22的编号，CNP37中可进行的取代的非限制性实例包括K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、 G15S、S16Q、M17N、G19R及其组合。在一实施例中，CNP37衍生物含有天然氨基酸(例如天冬酰胺)或非天然氨基酸或肽模拟物对Metl7的取代，旨在部分避免甲硫氨酸的硫原子被氧化。在另一实施例中，CNP37变体含有天然或非天然非碱性氨基酸或肽模拟物对Lys8、 LyslO、Lysl4及/或Lysl5 (依据始于CNP37的N端的编号)的取代，旨在部分减少白蛋白
纟口口。除氨基酸添加、缺失及/或取代的外或替代氨基酸添加、缺失及/或取代，CNP37 衍生物可在N端、C端及/或内部位点偶联至本文所述的任何部分，这些部分包括(但不限于)靶向骨/软骨的部分(例如骨靶向肽域)、降低肾清除率的部分(例如带负电PEG部分)、亲水性聚合物(例如PEG)、包含一或多个氨基酸的氨基酸序列(例如骨织素” NPR-C 抑制剂”片段)、碳水化合物(例如由骨生长板的细胞表面上的受体识别的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸及天然脂肪酸)，及其组合。在一实施例中，CNP变体为经修饰的CNP37肽，其在弗林蛋白酶切割位点具有突变 /取代(加下划线)，旨在提高对弗林蛋白酶的活体内抗性，及/或在N端含有甘氨酸(加下划线)，旨在提高血浆稳定性及防止形成焦谷氨酰胺。此等CNP37变体包括(但不限于)GQEHPNARIWKGAN￡EGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物⑶)(SEQ ID NO 71)；GQEHPNARKIGAN巡GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CT) (SEQ ID NO 72)；GQEHPNARKIGAN通GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CU) (SEQ ID NO 73)；GQEHPNARKIGANEEGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 CW) (SEQ ID NO 74)；GQEHPNARKIGANEKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37，类似物 DB) (SEQ ID NO: 75) ’及PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 145)。在另一实施例中，本文的CNP变体包括可通过本文所述的融合蛋白方法产生的 CNP肽及其变体。可用本文所述的融合蛋白方法使用化学或蛋白水解切割或切割蛋白质自切割产生的CNP变体的非限制性实例包括 GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP53) (SEQ ID NO 179)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO :75)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP37) (SEQ ID NO :60)；
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (HSA 片段 _wtCNP27) (SEQ ID NO
144)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO 36)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP53(M48N)] (SEQ ID NO 180)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N) ](SEQ ID NO: 181)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO 182)；GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO: 183)；GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO :184)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP53) (SEQ ID NO 185)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO:
145)；PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP37)(SEQ ID NO 186)；PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP34)(SEQ ID NO 187)；P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-wtCNP27)(SEQ ID NO 188)；PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :189)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP53) (SEQ ID NO 190)；MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO: 191)；MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP37)(SEQ ID NO 192)；M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA_wtCNP27)(SEQ ID NO 193)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met_CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO 194)。其它CNP变体(包括介于hCNP-17至hCNP_53范围内且具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代的截短CNP肽)亦可通过本文所述的融合蛋白方法产生，只要融合蛋白的化学或蛋白水解切割的预定位点不存在于目标CNP变体本身的氨基酸序列内。作为一非限制性实例，可采用本文所述的融合蛋白方法使用甲酸切割来产生截短wtCNP34。在其它实施例中，对于具有天冬酰胺(Asn/N)残基及/或谷氨酰胺(Gln/Q)残基的本文所述的任何CNP肽及CNP变体，无论其是否具有野生型序列或非天然氨基酸序列，任何Asn残基及/或任何Gln残基均可独立地经任何其它天然或非天然氨基酸取代，包括保守性取代，诸如Asn经取代为Gin。此等取代系部分地旨在最小化或避免天冬酰胺及/或谷氨酰胺发生任何可能脱酰胺作用。任何Asn残基及/或任何Gln残基均可独立地经任何其它天然或非天然氨基酸取代(包括保守性取代，诸如Asn经取代为Gln)的CNP肽及变体的非限制性实例包括 wtCNP34、wtCNP37、Gly_wtCNP37、Pro_wtCNP37、Pro_Gly-wtCNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO 144)、Pro-GHKSEVAHRFK_wtCNP27(SEQ ID NO :188)、 PE012-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)及 PE024-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :36)。在某些实施例中，本文所述的CNP肽及CNP变体的天冬酰胺残基未经谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。在某些实施例中，本文所述的CNP肽及CNP变体的谷氨酰胺残基未经天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。作为一非限制性实例，Pro-Gly-wtCNP37 (PGQEHPNARKYKGANKK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 145)的天冬酰胺残基7及/或15可独立地经任何其它天然或非天然氨基酸(包括谷氨酰胺)取代以避免天冬酰胺残基脱酰胺为天冬氨酸或异天冬氨酸的任何可能性。在某些实施例中，Pro-Gly-wtCNP37的天冬酰胺残基7及/或 15未经谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。然而应了解，本文包括如下CNP变体其中任一或多个(至多所有)易于发生脱酰胺或类脱酰胺反应(例如异构化)的残基均可经由脱酰胺或类脱酰胺反应以任何程度(依据转化的残基，至多转化100%)转化为其它残基。在某些实施例中，本文包括CNP变体，其中(1)任一或多个(至多所有)天冬酰胺(Asn/N)残基可经由脱酰胺作用转化为天冬氨酸或天冬氨酸盐，及/或转化为异天冬氨酸或异天冬氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% ；或(2)任一或多个(至多所有)谷氨酰胺(Gln/Q)残基可经由脱酰胺作用转化为谷氨酸或谷氨酸盐，及/或转化为异谷氨酸或异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5 %、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(3)任一或多个(至多所有)天冬氨酸或天冬氨酸盐(Asp/D)残基可经由类脱酰胺反应(亦称为异构化)转化为异天冬氨酸或异天冬氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约 5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(4)任一或多个(至多所有)谷氨酸或谷氨酸盐(Glu/E)残基可经由类脱酰胺反应(亦称为异构化)转化为异谷氨酸或异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5%、 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100% ；或(5)上述各项的组合。作为一非限制性实例，本文包括CNP变体，其中Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKG ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO :145)的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)谷氨酸/谷氨酸盐及/或异谷氨酸/异谷氨酸盐、( 异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(4)异谷氨酸/异谷氨酸盐，如上所述，依据转化的残基，至多转化约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90% 或 100%。作为另一实例，本文包括CNP变体，其中ftx)-Gly-(SEQ ID NO :145)的任一或多个 (至多所有)天冬酰胺及 / 或 wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC]天冬氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、及/或( 异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作为另一实例，本文包括CNP 变体，其中 Gly-wtCNP37 [GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :75)]的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、( 谷氨酸/谷氨酸盐及/或异谷氨酸/异谷氨酸盐、(3)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(4)异谷氨酸/异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作为又一实例，本文包括CNP 变体，其中 wtCNP37 [QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLD RIGSMSGLGC(SEQ ID NO60)]的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及 /或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/ 或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、( 谷氨酸/谷氨酸盐及/或异谷氨酸/异谷氨酸盐、(3) 异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(4)异谷氨酸/异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。作为另一实例，本文包括CNP变体，其中HSA-wtCNP27嵌合体GHKSpAHRFKGApK GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO 144)的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或( 异谷氨酸 /异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5 %、10%、20 %、30%、40 %、50%、60 %、70%、 80%、90% 或 100%。作为又一实例，本文包括CNP变体，其中Pro-HSA-wtCNP27嵌合体PGHKSgVAHRFKG ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO :188)的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或( 异谷氨酸/异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5^^10^^20^^30^^40^^50^^60%, 70%、80%、90% 或 100%。另外，本文包括CNP变体，其中任一或多个(至多所有)甲硫氨酸(Met/M)残基可氧化为任何化学上可行的氧化形式(例如亚砜及/或砜)，依据氧化的残基，至多转化约 5% ,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%。在另一实施例中，CNP变体包含CNP22或其变体在N端及/或C端偶联至有助于变体移位穿过细胞膜或细胞障壁的部分。在一实施例中，CNP变体在N端及/或C端偶联至有助于输送变体穿过细胞膜或细胞障壁(包括经由活性肽转运体)的肽序列。在另一实施例中，使CNP22或其变体的N端及/或C端偶联至化学部分，诸如天然及/或合成聚合物，以将经修饰的CNP肽的总质量增加至本文一般描述的范围，例如约 2. 6kDa或2. 8kDa至约6kDa或7kDa的范围。在一实施例中，化学部分为生物兼容性亲水性或水溶性天然(例如肽、碳水化合物)或合成(例如PEG(或PEO))聚合物。在另一实施例中，使CNP22或其变体的N端及/或C端偶联至PEG (或ΡΕ0)聚合物以产生特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. 8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量。CNP22或其变体的聚乙二醇化旨在尤其降低免疫原性及藉由降低肾清除率及增强蛋白酶抗性来提高半衰期。PEG部分可连接至本文所述的CNP22或任何变体的N端及/或 C端，该变体包括(但不限于)CNP-17 (CNP22的Cys6_Cys22环化部分)、CNP37，及CNP17、 CNP22或CNP37的具有N端及/或C端氨基酸延伸、氨基酸取代及/或氨基酸缺失的变体。在一实施例中，CNP17、CNP22或CNP37或其变体的Lys4及/或LyslO残基经侧链上不含反应性伯胺的天然或非天然氨基酸(例如Arg、Gly, Ser, Gin、Glu或Cit)或肽模拟物取代，以排除此等赖氨酸残基的任何可能的聚乙二醇化。在一实施例中，CNP肽的Lys4及/或 LyslO残基经Arg取代。在另一实施例中，LyslO残基未经Arg取代。在另一实施例中，具有PEG(或ΡΕ0)部分及位于N端的氨基酸延伸的CNP变体(包括CNP22及其变体)在紧接于对应于CNP22的Glyl的位置之前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP变体经设计为增强对NEP降解的抗性、减少与血清白蛋白的结合及增强CNP功能活性(例如活化cGMP信号传导)。聚乙二醇化CNP变体的非限制性实例包括 PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、PE012-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :36)、PE024-GANRR-CNP22(SEQ ID NO 36)、PE012-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO 36)、PE024-GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :37)、PE012-GANPR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :37)、PE024-GANPR-CNP22(SEQ ID NO :37)、PEOl2-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO 37), PE024-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、PE012-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO :64)、 PE024-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :39)、 PE024-ER-CNP22 (SEQ ID NO :39)、PE012-ER-CNP22 (SEQ ID NO :39)、PE024-R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :41)、PE012-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :41)、PE024-R-CNP22 (SEQ ID NO :41) 及 PE012-R-CNP22 (SEQ ID NO :41)，其中 PE024 为单分散性 1. 2kDa PEG 聚合物且 PEO12 为单分散性0. 6kDa PEG聚合物。在一实施例中，PEG(或ΡΕ0)聚合物系偶联至CNP变体的N 端。本文包括使用以下方面可不同的亲水性或水溶性聚合物(例如PEG)类型(例如同聚物或共聚物；随机共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；线性或分支；单分散或多分散)、键联(例如可水解键联或稳定键联，诸如酰胺、亚胺、胺、亚烷基或酯键)、偶联位点(例如在 N端及/或C端，较佳不在CNP的环化区(对应于CNP22的残基6-2 中任何残基处)，及长度(例如约0. 2、0. 4或0. 6kDa至约2、3、4或5kDa)。亲水性或水溶性聚合物可藉助于此项技术中已知的基于N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或基于醛的化学或其它化学偶联至CNP肽。此等CNP变体可使用以下产生例如wtCNP22(2. 2kDa)、仅保留wtCNP22的环化区(残基6_22) 的CNP17、在CNP22或CNP17的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP变体，或具有氨基酸取代、添加及 / 或缺失的变体，诸如 GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)、GANPR_CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 37)、R-CNP22 (SEQ ID NO :40)、R-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO :41)、ER-CNP22 (SEQ ID NO 38)及ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO :39)。在一实施例中，总质量的特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. 8kDa至约6或7kDa)的PEG-CNP变体含有经由基于NHS 或基于醛的化学偶联于N端及/或C端的单分散性线性PEG (或ΡΕ0)部分，经由基于NHS 的化学偶联于N端及/或C端的两臂或三臂分支PEG部分。本文亦包括经设计以降低肾清除率的带负电PEG-CNP变体，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物(Caliceti， Adv. Drug Deliv. Rev.(高等药物传递综述)，55 :1洸1_77 Q003) ；Perlman, J. Clin. Endo. Metab.(临床内分泌代谢杂志)，88 :3227-35(2003) ；Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo. ,29 440-444(1986) ；Vehaskari,Kidney Int，1 (国际肾脏)，22 :127-135 (1982))。在一实施例中，PEG (或ΡΕ0)部分含有羧基、硫酸根及/或磷酸根。在另一实施例中，本文所述的偶联至CNP变体的N端、C端及/或内部位点的PEG(或ΡΕ0)部分含有一或多个在生理条件下带正电荷的官能基。此等PEG部分尤其旨在改良此等聚乙二醇化CNP变体于软骨组织的分布。在一实施例中，此等PEG部分含有一或多个一级、二级或三级氨基、季铵基及/或其它含胺(例如脲)基团。在一实施例中，本文包括经由基于NHS或基于醛的化学偶联至式(CH2CH2O)nW PEG (或ΡΕ0)的CNP22或其变体，其中η为约6至约100的整数，且PEG聚合物为约0. 3kDa 至约5kDa。在另一实施例中，η为约12至约50的整数，且PEG聚合物为约0. 6kDa至约 2. 5kDa。在另一实施例中，η为约12至约对，且PEG聚合物为约0. 6kDa至约1.2kDa。在又一实施例中，PEG聚合物的末端羟基经非反应性基团封端。在一特定实施例中，封端基团为烷基，例如低级烷基，诸如甲基。在另一实施例中，本文提供具有一或多个对肽酶(包括中性内肽酶(NEP))切割的敏感性降低的肽键或肽键等构物的CNP变体。NEP为切割较大疏水性残基的氨基端的底物肽键的膜结合锌依赖性内肽酶。因此，将NEP的切割位点处的肽键修饰为非天然肽键或非肽键可排除NEP切割或降低NEP切割的效率。对于ANP及CNP，报导NEP切割首先发生于环化区内的CyS6_Phe7键，接着发生于遍及结构的其余部分的其它处。对于BNP，报导切割首先发生于肽N端，接着发生于环状结构内。尽管报导CNP上的主要NEP切割位点为Cys6-Phe7键，但当将wtCNP22于活体外暴露于NEP消化维持2. 5分钟时，所有可能位点均意外水解，其中Cys6-Phe7及Gly8_Leu9肽键略微最不稳定，如实例2中所述。NEP的底物特异性主要由两个底物结合子位点Si，及S2’决定(Oefner等人， J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)296 :341-349 (2000))。Sl，位点接受N端肽键经受水解的较大疏水性ΡΓ残基(例如Phe,Leu.Ile及Met)。S2，位点一般优选称为P2，的较小残基 (例如Gly或Ser)。在CNP的情况下，报导Phe7为NEP Si，位点的较佳Pl，残基，而Gly8 为S2’位点的较佳P2’残基。由于此两个子位点一起仅可容纳特定总侧链尺寸，因此CNP 的ΡΓ -P2’残基的总尺寸的任何增大可能会潜在地破坏NEP结合。举例而言，将氯原子添加于Pl，Phe7芳族环的3位(亦即3-Cl-Phe7)可潜在地修饰CNP与NEP切割位点(例如在Si’子位点)之间的相互作用(例如使这些相互作用不稳定)。将叔丁基添加至较小P2’ 残基GlyS (亦即tBu-Gly8)可潜在地破坏CNP与S2’子位点之间的相互作用。因此，在一实施例中，本文的CNP变体包括ΡΓ -P2，残基(诸如Wie7-Gly8)尺寸增大以干扰活性位点处的底物识别，从而降低对NEP切割的敏感性的CNP。天然氨基酸、非天然氨基酸及/或肽模拟物部分可取代一或多个较大ΡΓ疏水性残基(包括(但不限于) Phe7、Leu9、Leull、Ilel4、Metl7&Leu20)及/或一或多个较小P2，残基(包括(但不限于)Cys6、Gly8、Glyl5、Serl6 及 Glyl9)。本文包括在至少一个牵涉于底物识别及/或NEP切割的残基处包含至少一个经修饰氨基酸及/或至少一个经修饰肽键的CNP变体，其中这些经修饰氨基酸及经修饰肽键可为天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模拟物及/或肽键等构物。在一实施例中，CNP上在Cys6 与Wie7之间的NEP切割位点经修饰。在一相关实施例中，Cys6与Wie7之间的肽键(_C(= 0)-ΝΗ-)经一个以下肽键等构物置换-CH2-NH-,-C( = O)-N(R)-，其中酰氨基系经任何以下R基团烷基化甲基、乙基、正丙基、异
62丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，-C( = 0)-NH-CH2-,-CH2-S-,-CH2-S (0) n_，其中 η 为 1 或 2，-CH2-CH2-,-CH = CH-，-C( = 0)-CH2-,-CH(CN) -NH-,-CH(OH) -CH2-,-0_C( = 0)-ΝΗ-，或-NHC ( = 0)ΝΗ-ο在另一实施例中，CNP变体系由下式表示(χ) -Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5- (b) 6_ (c) 7~ (d) 8-Leu9-LyS10-Leu11-Asp12-Arg13-I Ie H-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :90)，其中(χ)及(ζ)独立地可不存在或可选自由以下组成的群合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，例如聚Asp及聚Glu ；来源于骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列(Wang等人，Adv. Drug Delivery Rev.，57 1049-76 (2005))；降低肾清除率的聚合分子及非聚合分子，诸如带负电PEG ；及藉由使CNP变体的总质量增至本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. 8kDa至约6kDa或 7kDa)来增强CNP变体对NEP降解的抗性的天然聚合物(例如含有氨基酸、脂肪酸及/或碳水化合物的天然聚合物)及合成聚合物(例如PEG)；(b)及(c)可为野生型Cys6及Wie7、另一天然氨基酸或非天然氨基酸，或可含有如本文所述的肽键等构物以增强对NEP切割的抗性；且(d)可为野生型Gly8，或可为较大天然或非天然(例如t-Bu-Gly)氨基酸或肽模拟物以减少与NEP的结合。在一实施例中，此等CNP变体在(b)、(C)及/或(d)处含有至少一个经修饰氨基酸。即使CNP22或其变体在CyS6_Phe7具有抗NEP的肽键或肽键等构物，但CNP内的其它肽键(包括 Gly8-Leu9、Lysl0-Leull、Argl3_Ilel4、Serl6-Metl7 及 Glyl9-Leu2O 键) 亦可能会被切割。因此，本文包括除Cys6-Phe7键外亦在一或多个其它NEP切割位点具有肽键等构物的CNP变体，其中这些肽键等构物包括本文所述者。在另一实施例中，本文包括在Cys6及/或Cys22具有半胱氨酸类似物(包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、2-巯基丙酸及3-巯基丙酸)的CNP变体。在一实施例中，此等CNP变体具有由野生型Cys6或类似物与Cys22或类似物之间的二硫键所形成的环状域。在另一实施例中，CNP22或其变体的一或多个残基(至多所有残基)经D-氨基酸取代。以D-氨基酸取代L-氨基酸基本上将侧链自其原始位置移动约120度，藉此可能破坏CNP肽与NEP的结合。在一特定实施例中，Phe7处的L-Phe经其D-对映异构体D-Phe取代。在又一实施例中，β氨基酸(诸如3-氨基-2-苯基丙酸(或2-苯基-β-丙氨酸))置换野生型α-氨基酸I^e7。使用氨基酸将肽主链长度有效增加一个亚甲基单元。蛋白酶抗性可因底物构型的变化或氨基酸侧链之间的距离增加而引起。具有非天然α -氨基酸、β -氨基酸或肽键等构物的CNP22变体的非限制性实例包括GLSKGC (CH2NH) FGLKLDRIGSMSGLGC (类似物 A) (SEQ ID NO 56)、GLSKGC- (N-Me-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (类似物 B) (SEQ ID NO 57)、GLSKGC- (D-Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (类似物 E) (SEQ ID NO 136)、GLSKGCF- (tBu-Gly) -LKLDRIGSMSGLGC (类似物 F) (SEQ ID NO 58)、GLSKGC- (3_Cl_Phe) -GLKLDRIGSMSGLGC (类似物 G) (SEQ ID NO 137)，及GLSKGC-[NHCH2CH(Ph) CO] -GLKLDRIGSMSGLGC (类似物 H，使用 3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO :59)。在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或 2. SkDa至约6kDa或7kDa)的总质量，旨在增强对NEP降解的抗性，且这些变体由下式表示(x) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10- (g) H-Asp12-Arg13- (h) 14-Gly15-kr164i)17-kr18-Gly19-(j)2。-Gly21-Cys22-(Z) (SEQ ID NO :46)，其中(χ)及(ζ)独立地可不存在或可选自由以下组成的群合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu ；来源于骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；降低肾清除率的聚合及非聚合部分，诸如带负电PEG ；含有例如氨基酸、疏水性酸及/或碳水化合物的聚合物；及合成亲水性聚合物，诸如PEG;(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg ；(b)选自Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH ；(c)选自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位系经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代商素、羟基、氰基、直链或支链Cp6烷基、直链或支链CV6烷氧基、直链或支链卤基-Cp6烷基、C3_1Q环烷基、杂环基、C6,芳基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置换；(d)选自Gly、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)选自Leu、Ser, Thr 及肽键等构物，诸如 N-Me-Leu ；(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg ；(g)选自Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu ；
(h)选自Ile、tBu-Gly、及肽键等构物，诸如 N-Me-Ile ；⑴选自僅讨、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且(j)选自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Ser, Thr、Arg、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或 2. SkDa至约6kDa或7kDa)的总质量，旨在增强对NEP切割的抗性，且高等变体由下式表示(x) -Gly1-Leu2-Ser3- (a) 4_Gly5- (b) 6_ (c) 7_ (d) 8_ (e) 9_ (f) 10_ (g) H-Asp12-Arg13- (h) 14-(i) 15-Ser16-(j) 17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(ζ) (SEQ ID NO :143)，其中(x)及(ζ)独立地可不存在或可选自由以下组成的群合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu ；来源于骨蛋白及其衍生物(诸如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列；降低肾清除率的部分，包括(但不限于)亲水性或水溶性聚合物，诸如带电PEG分子；及包含例如PEG、氨基酸、碳水化合物及/或疏水性酸的部分；(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gin、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg ；(b)选自Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH ；(c)选自L_Phe ；D-Phe ；3_氨基_2_苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位系经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代商素、羟基、氰基、直链或支链Cp6烷基、直链或支链CV6烷氧基、直链或支链卤基-Cp6烷基、C3_1Q环烷基、C6,芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、 3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸) 置换；(d)选自:Gly、叔丁基-Gly, Thr、Ser、Val 及 Asn ；(e)选自Leu、Ser, Thr 及肽键等构物，诸如 N-Me-Leu ；(f)选自Lys、Arg、Gly、6_ 羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln 及 Ser ；(g)选自Leu、Asn及肽键等构物，诸如N-Me-Leu ；(h)选自Ile、叔丁基-Gly (tBu-Gly)、Asn 及肽键等构物，诸如 N-Me-Ile ；⑴选自Gly、Arg、Ser 及 Asn ；(j)选自僅讨、￥￡11、六卯、3-(141￡1、2-氨基丁酸(Abu)及 2-氨基-异丁酸(Aib)；且(k)选自Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala (tBu-Ala)、 Arg、Thr、Ser及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。为改良CNP变体传递至骨相关病症(例如骨骼发育不良)的目标部位，可将CNP 变体连接(例如在N端及/或C端)至靶向骨/软骨的部分。靶向骨/软骨的部分的非限制性实例包括二磷酸盐；羟基磷灰石；葡糖胺；胶原蛋白(例如X型胶原蛋白) ’聚Asp ；聚 Glu;及来源于骨蛋白(诸如骨织素、骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列。除较不易为NEP切割的外，CNP变体亦可能具有降低的对NPR-C清除受体的亲和力，同时保留CNP功能性。除NEP介导的降解外，CNP22的半衰期亦受清除受体NPR-C 影响，该NPR-C与NPR-B的细胞外肽结合域共享58%的序列同源性。CNP22不仅紧密结合于NPR-B(7-30pM亲和力)，而且亦紧密结合于NPR-C(ll_140pM) (Bennett, B. D.等人， J. Biol. Chem.(生物化学杂志)J66 :23060-67(1991) ；Koller K. J.及 Goeddel，D. V.， Circulation (循环)，86 :1081-88(1992) ；Suga, S.等人，Endocrinology (内分泌学)，130 229-39 (1992))。尽管NPR-B晶体结构尚有待报导，但NPR-C与NPR-A晶体结构之间的序列同源性以及相似性(He，X. -L.等人，Science (科学)，四3(55；35) :1657-62(2001) ；Ogawa, H.等人，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，279 Q7) :28625-31(2004) ；He, X.-L.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，361(4) :698-714(2006))表明NPR-B可能呈现类似的总体结构折迭。因此，依据基于结构的序列比对及以下相关系统的结晶结构来建立NPR-B同源性模型结合于NPR-C的CNP、结合于NPR-A的ANP，及结合于NPR-C的ANP (He，X. -L.等人， Science (科学)，293(5535) :1657-62(2001) ；Ogawa, H.等人，J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，279 07) =28625-31(2004) ；He，X.-L.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，361 (4) 698-714 Q006))。依据受体似乎决定所结合肽的构型，且就一级结构及功能特性而言NPR-B 最接近类似于NPR-A的观察结果，以NPR-A/ANP晶体结构作为模型来建立NPR-B/CNP同源性模型。使用公开的CNP变体的信号传导数据(美国专利第5，434，133号及美国专利申请公开案第2004/0138134A1号)及不再结合于NPR-C的功能性ANP变体的信号传导数据 (Cunningham, EMBO 13 (11) 2508-15，1994)来改进及解释 NPR-B/CNP 模型。本文包括依据NPR-B/CNP复合物的基于同源性的结构模型，经设计以改良NPR-B 选择性的CNP变体。组合结合于各种受体的利钠肽的实验及计算结构数据与公开的功能性数据，产生仍旧结合于NPR-B但可潜在地降低对NPR-C清除受体的亲和力的CNP变体。举例而言，NPR-C在环结构中于肽结合位点中具有独特插入，从而使得与NPR-A及NPR-B中的各别环残基相比，该NPR-C的环残基处于更靠近诸如CNP Gly8(或ANP Gly9)的肽残基的位置。早期研究表明，ANP中的G9T突变有助于降低对NPR-C的亲和力，藉此改良NPR-A选择性(Cunningham，EMBO J. ,13(11) :2508-15 (1994))。因此，产生 CNP 变体以用较大残基 (Ser, Val、Thr或Asn)置换相应Gly8残基，以在不影响CNP与NPR-B的结合的情况下，破坏其与NPR-C的结合。此外，依据对受体/肽复合物的详细结构分析，将一或多个突变引入预期与受体特异性残基相互作用的CNP的C端(包括Glyl5至Gly21)。举例而言，CNP22 中的G19R突变不会引起NPR-B信号传导活性的显著损失。然而，不能在不改变邻近残基的构型的情况下，于NPR-C/CNP的可用晶体结构中模拟此突变。此等观察结果表明，G19R突变可能会选择性破坏CNP与特定受体(诸如NPR-C)的结合。在一实施例中，CNP变体在位置1、5、8、15、19及21的一或多个Gly位点具有取代，以降低构型柔性且藉此增强受体特异性。对结合于NPR-C及NPR-A的ANP的晶体结构的比较分析(0gawa,H.等人，J. Biol. Chem.(生物化学杂志),279 =28625-31 (2004) ；He,X. -L.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志)，361 =698-714 (2006))表明ANP的构型柔性可在决定受体选择性方面起到重要作用。在一实施例中，对NPR-C的亲和力可能降低的功能性CNP变体具有一或多个以下氨基酸取代GlR、GlE、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、 I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、 L20S、G21S、G21T 及 G21R。在一实施例中，CNP 变体在位置 1、5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、
20及/或21具有多点取代，且可视情况在变体的肽序列的任何其它位置具有修饰。在另一实施例中，可将本文所述的CNP变体在N端、C端及/或内部位点偶联至部分，直至总质量的特征在于本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa或2. SkDa至约6kDa或 7kDa)，以有助于靶向骨/软骨、降低NPR-C及肾清除率、增强对NEP降解的抗性，及/或改良CNP功能性。在一实施例中，CNP变体未在环状区域(对应于CNP22的Cys6至Cys22) 内的位点偶联至聚合部分。可偶联至CNP变体的聚合或非聚合部分的非限制性实例包括合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；骨/软骨靶向肽序列，诸如聚Asp及聚Glu ；来源于骨蛋白 (诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的肽序列；来源于骨形态发生蛋白(诸如 BMP2、BMP3、BMP5、BMP7及BMP8a)的功能域的肽序列；来源于利钠来源的多肽(例如NPPC、 ANP及BNP)的肽序列；其它天然聚合或非聚合部分，诸如碳水化合物、脂肪酸及磷脂；生物兼容性合成亲水性聚合物，诸如PEG (或ΡΕ0)；疏水性聚合或非聚合部分，诸如庚酸及戊酸；及其组合。例如就刺激cGMP产生及信号传导而言，本文所述的CNP变体可具有与CNP22相比实质上类似或更佳的功能活性。在一实施例中，CNP变体于活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22 (例如1 μ Μ)下所产生的cGMP量的至少约50%。在某些实施例中，CNP 变体保留野生型CNP22活体外或活体内的cGMP刺激活性的至少约50%、60%、70%、80%、 90 %、95 %或100 %。在另一实施例中，与CNP22相比，CNP变体具有改良的cGMP刺激活性。在某些实施例中，CNP变体于活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如1 μ m)下所产生的 cGMP 量的至少约 110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、 400%、450%、500% 或更高。本文中视情况排除本文中所参考的任何先前公开案中特定揭示的任何利钠(例如CNP)肽、片段及变体，及实际产生的任何利钠(例如CNP)肽、片段及变体，这些先前公开案包括(但不限于):U. S. 5，434，133、U. S. 6，034，231、U. S. 6，020，168、U. S. 6，743，425、 U. S. 7，276，481、WO 94/20534、WO 02/047871、WO 2005/098490、WO 2004/047871、EP 0497368,EP 0466174，及 Furuya 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm.(生物化学生物物理通讯)183 :964-969(1992)).所有此等文献均以全文引用的方式并入本文中。在一实施例中，本文视情况排除所有已知野生型CNP-53、野生型CNP-22、野生型CNP-17、野生型BNP及人类来源及非人类来源的野生型ANP。举例而言，在一实施例中，本文视情况排除人类CNP-17、人类CNP-22、鸡CNP_22(对应于hCNP-22 (Leu9Val))、鳟鱼及鳗鱼 CNP-22 (对应于 hCNP-22 (Leu2Trp、Ser3Asn、Lys4Arg))、蛙 CNP22-I (对应于 hCNP-22 (Leu2Tyr、Lys4Arg、Leu9Val、Serl6Ala、Metl7Phe))、蛙 CNP22-II (对应于 hCNP-22 (Leu2Thr、Serl6Ala))、人类 CNP-53，及猪及大鼠 CNP-53 (对应于 hCNP-53(Glnl7HiS、Ald8Gly))。在另一实施例中，本文视情况排除藉由在人类及非人类动物中活体内蛋白水解切割产生的NPPC、原CNP及CNP-53的片段。在另一实施例中，本文视情况排除野生型人类CNP-53的以下截短片段CNP-50、CNP-46、CNP-44、CNP-39、CNP-30、 CNP-29、CNP-28、CNP-27 及 CNP-26。在另一实施例中，本文视情况排除自鲨鱼物种皱唇鲨(Triakis scyllia)及小点猫鲨(Scyliorhinus canicula)分离或搜寻到的CNP肽及其片段(例如参看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454(1994))，其包括RLLKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :204)；LKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :205)；KDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :206)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :207)。在另一实施例中，本文视情况排除自鲨鱼物种鼠鲨(Lamna ditropis)分离或搜寻到的CNP肽及其片段(例如参看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454 (1994))，其包括RLLKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :208)；LKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :209)；KDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :210)；FKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :211)；及GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :212)。在又一实施例中，本文视情况排除自鲨鱼物种白斑角鲨(Squalus acanthias)分离的CNP肽及其片段(例如参看M. Takano等人，Zool. Sci.，11 :451-454 (1994))，其包括RLLQDLSNNPLRFKGRSKKGPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :213)；及 GPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO :214)。在另一实施例中，本文视情况排除自青鏘(medaka)及河豚(puffer fish)分离的 CNP 肽，其在 K. Inoue 等人，Proc. Nat. Acad. Sci.，100 (17) 10079-10084 (2003)中命名为 ” CNP-I ”、” CNP-2 ”、” CNP-3 ” 及” CNP-4 ” GWNRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (青鏘及河豚 CNP-1) (SEQ ID NO :215)；PMVAGGGCFGMKMDRIGSISGLGC (青鏘 CNP-2) (SEQ ID NO :216)；GRSSMVGGRGCFGMKIDRIGSISGLGC (河豚 CNP-2) (SEQ ID NO :217)；GGMRSCFGVRLERIGSFSGLGC (青鏘 CNP-3) (SEQ ID NO :218)；GGLRSCFGVRLARIGSFSGLGC (河豚 CNP-3) (SEQ ID NO :219)；GGSTSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (青鏘 CNP-4) (SEQ ID NO :220)；及GGSSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC (河豚 CNP-4) (SEQ ID NO :221)。在另一实施例中，本文视情况排除自鸭嘴兽(platypus)毒液分离的CNP_39 及其 CNP-22 片段，其在 G. de Plater 等人，Toxicon.，36 (6) :847-857(1998)中命名为” ovCNP-39” 及” ovCNP-39 (18-39) ” LLHDHPNPRKYKPANKKGLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39)(SEQ ID NO 222)；及GLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39(18-39)(SEQ ID NO :223)。在另一实施例中，本文视情况排除以下如US 2007/0197434中特定揭示的肽Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Met-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :224)；
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :225)；Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Ala-S er-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :226)；Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-M et-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO :227)；Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-S er-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO :228)；及Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-A sn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO :229) 在另一实施例中，本文视情况排除US 2007/0197434中一般性揭示的SEQ ID NO: 10的肽，其中此等肽为在位置4、5、6、11、12、14及/或15具有特定天然氨基酸取代的 CNP-17变体。在又一实施例中，本文视情况排除对应于以下的肽hCNP-53 6er47Ala)、 hCNP-53(Met48Gln)、hCNP-53 (Met48Ala)及 hCNP-53(C 端)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr 在一实施例中，本文视情况排除如US 7,276,481中特定揭示的SEQ ID NO :1_4 及6-71的肽。在另一实施例中，本文视情况排除US 7，276，481中一般性揭示的SEQ ID NO 5 的肽，其中此等肽为在 Leu9、LyslO、LeulU Serl6、Metl7、Glyl9 及 / 或 Leu20 具有至少一个天然氨基酸取代的CNP17变体。在又一实施例中，视情况排除CNP17或其变体含有N-Me-Phe7或N-Me-Phe7及N-Me-Leull的CNP17变体。在另一实施例中，本文视情况排除融合或偶联至生长激素(GH)、类胰岛素生长因子I(IGF-I)或甲状腺激素(TH)的如US 7，276，481中揭示的SEQ ID NO :5的CNP17变体。在另一实施例中，视情况排除CNP22融合至GH、IGF-I或TH或经由接头(例如肽接头)连接至GH、IGF-I或TH的CNP22变体。在又一实施例中，视情况排除CNP17或其变体在N端或C端偶联至生物素或荧光素的CNP17变体。在另一实施例中，本文视情况排除如US 5，434，133中特定揭示的化合物第1_27 号及SEQ ID N0:l-17、22-24、30、31及40-42的肽。在另一实施例中，本文视情况排除US 5，434，133中一般性揭示的SEQ ID NO :18-21及25-29的肽。在又一实施例中，本文视情况排除如WO 94/20534中特定揭示的SEQ ID NO :1_4及9的肽。然而，在一些实施例中，本文仍包括本文中视情况排除的利钠(例如CNP)肽、片段及变体的使用方法，以及包含此等利钠(例如CNP)肽、片段及变体的医药组合物(包括无菌医药组合物)。C. CNP变体的合成及纯化在一些实施例中，本文所述的CNP变体藉由重组表达，使用此项技术中已知的某些技术(在某些实施例中)来产生。例如参看Sambrook，Fritsch及Maniatis，Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆实验手册)，第2版。冷泉湾实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)) ；DNA Cloning A Practical Approach (DNA 克隆实验方法)，第 I 及第 II 卷，D. N. Glover 编(1985)；及 Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学目前方法)，John Wiley&Sons, Inc. (1994)。
在某些实施例中，藉由重组方法产生本文所述的CNP变体，该重组方法包含将包含编码CNP变体多肽的第一多核苷酸连接至编码切割可切割肽或蛋白质的第二多核苷酸的宿主细胞在培养基中在使得由这些多核苷酸编码的融合多肽得以表达的条件下培养，其中该融合多肽包含CNP变体多肽直接连接至切割可切割肽或蛋白质或经由接头与其间接连接。在一些实施例中，用包含编码CNP变体多肽的多核苷酸连接至编码切割可切割肽或蛋白质的多核苷酸的表达载体来转化宿主细胞。在某些实施例中，融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。可自宿主细胞或培养基分离所表达的融合多肽，且可使经分离的融合多肽与切割切割剂接触以释放CNP变体。用以产生CNP变体的宿主细胞可为细菌、酵母、昆虫、非哺乳动物脊椎动物或哺乳动物细胞。细菌细胞包括(但不限于)大肠杆菌(E.coli)细胞株及菌株。大肠杆菌细胞株及菌株的非限制性实例包括BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 (DE3)pGro7、 ArcticExpress (DE3)、C41 [亦称作 C41 (DE3) ]、C43 [亦称作 C43 (DE3) ]、Origami B (DE3)、 Origami B (DE3) pLysS、KRX 及 I\mer (DE3)。在一实施例中，使用 BL21 (DE3)细胞来产生 CNP 变体及CNP融合蛋白。哺乳动物细胞包括(但不限于)仓鼠、猴、黑猩猩、犬、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔、绵羊及人类细胞。宿主细胞可为永生化细胞(细胞株)或非永生化(原生或次生)细胞，且可为多种细胞类型中的任一种，诸如(但不限于)成纤维细胞、角质细胞、上皮细胞(例如乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、卵巢细胞(例如中国仓鼠卵巢或CHO细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液的形成成分(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、软骨细胞及其它骨源性细胞，及此等体细胞类型的前体。在适于细胞生长、表达DNA或RNA及鉴别/ 选择表达CNP变体的细胞的条件下培养含有CNP变体DNA或RNA的宿主细胞。在一些实施例中，使宿主细胞在约10°C至约40°C，或约20°C至约40°C，或约30°C 至约40°C的温度下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞在约20°C、22°C、 25 °C ,28 30 °C、35°C或37 °C下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞在约 35°C或37°C下生长或培养一段时间。使编码CNP变体多肽(包括CNP融合蛋白)的重组多核苷酸于包含含有表达控制序列可操作地连接至待表达核苷酸序列的重组多核苷酸的表达载体中表达。表达载体包含足够用于表现的顺式作用组件；其它用于表达的组件可由宿主细胞或活体外表达系统供应。表达载体包括此项技术中已知的所有表达载体，包括(但不限于)黏质体、质体(例如裸质体或含于脂质体中的质体)及并有重组多核苷酸的病毒。经由转化或转染将表达载体插入适当宿主细胞中以便表达编码多肽的多核苷酸(例如参看Sambrook等人(同上文))。预期用于产生CNP变体(包括可切割CNP融合蛋白)的表达载体的非限制性实例包括 pjexpress、pjexpress401、pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、 pET-32a、pET-41a、pMAL、pMAL_c2X、pQE-30、pET-SUMO 及 pTYBll。特定构建体的表达可产生呈包涵体形式的可溶CNP变体(包括CNP融合蛋白)或不可溶CNP变体(包括CNP融合蛋白)。在一些实施例中，使用异丙基β -D-I-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导性载体来增强编码CNP变体或CNP融合蛋白的多核苷酸的表达。在一些实施例中，使宿主细胞在IPTG 存在下，在约10°C至约40 V，或约20 V至约40 V，或约30 V至约40 V的温度下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞在1 16存在下，在约201、221、251、281、301、35°C或37°C下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞，在ImM IPTG存在下，在约35°C或37°C下生长或培养一段时间。在其它实施例中，使宿主细胞与浓度为约0. 4mM至约2mM，或约0. 4mM至约1. 5mM, 或约0. 4mM至约ImM的IPTG—起培养。在某些实施例中，IPTG浓度为约0. 4,0. 5,0. 6,0. 7、 0. 8,0. 9、1、1. 1,1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9 或 2mM。在一实施例中，IPTG 浓度为约 ImM。在某些实施例中，本文所述的CNP变体重组表达为包含CNP变体多肽及可切割载体蛋白或可切割标签(例如肽标签)的融合蛋白，其中该融合蛋白包含CNP变体多肽直接连接至可切割载体蛋白或标签或经由接头与其间接连接。使用载体蛋白或标签有助于例如检测、分离及/或纯化融合蛋白。可切割载体蛋白及标签包括(但不限于)组氨酸(例如六His)标签；人类转录因子TAF12(TAF12)、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12 (C/A)、TAF12 (D/E)、TAF12 (4D/4E)、TAF12 (6D/6E)、TAF12 (10D/10E)、 TAF12 (C/A 及 D/E)、TAF12 (C/A 及 4D/4E)、TAF12 (C/A 及 6D/6E)、TAF12 (C/A 及 10D/10E)；酮类固醇异构酶(KSI)；麦芽糖结合蛋白(MBP) ；半乳糖苷酶(β-Gal)；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；硫氧还蛋白(Trx)；壳多糖结合域(CBD) ；ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-2突变体、ΒΜΡ-2 (C/A)； SUMO ；及其突变体及片段。表达构建体可表达包含CNP变体及载体蛋白或标签的融合蛋白。标签可为赋予融合蛋白适用特性的氨基酸序列。在一实施例中，标签为配位体结合域，其可用以藉由将融合蛋白施加至含有该配位体的分离介质来纯化融合蛋白。举例而言，可将包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)域的融合蛋白施加至含有连接有谷胱甘肽的分离介质的层析管柱。作为另一实例，可将包含麦芽糖结合蛋白(MBP)作为标签的融合蛋白施加至含有麦芽糖的分离介质。作为另一实例，可将包含聚组氨酸标签的融合蛋白施加至镍柱，藉此聚组氨酸标签螯合于镍柱有助于纯化融合蛋白。在另一实施例中，标签为配位体。举例而言，融合蛋白可包含谷胱甘肽作为标签且施加至含有连接有谷胱甘肽-S-转移酶的分离介质的层析管柱。适用于融合蛋白的载体蛋白及标签的非限制性实例包括(但不限于)人类转录因子 TAF12(TAF12)、酮类固醇异构酶(KSI)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、β -半乳糖苷酶(β-Gal)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(Trx)、壳多糖结合域(CBD)、BMP_2突变体(BMPM)、 SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白Α、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内葡聚糖酶A的纤维素结合域、外葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA, Flag、聚(His)、聚(Arg)、聚 (Asp)、聚(Gin)、聚(Phe)、聚(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体表位，及其突变体及片段。为产生目标CNP变体，载体蛋白或标签可藉助于化学切割、蛋白酶切割或切割蛋白质自切割自融合蛋白切割。例示性化学及蛋白水解切割切割剂(切割位点在括号中)包括(但不限于)甲酸(Asp-Pro)、溴化氰(CNBr) (Met-X)、羟胺(Asn-Gly)、因子 fe(IEGR-X) (SEQ ID NO :230)、肠激酶(DDDDK-X) (SEQ ID NO 231), ProTEV(EXXYXQ-G) (SEQ ID NO: 232)，及SUMO蛋白酶。由于特定种类化学切割的性质，因此使用甲酸来进行切割可产生 Pro-CNP, CNBr可产生Met经取代为Asn的CNP，且羟胺可产生Gly-CNP。或者，藉由使用不表达为融合蛋白的CNP变体的特定构建体(例如pET-21a-CNP)，可避免化学或蛋白酶切割。 pET-21a-CNP的表达可产生Met-CNP。或某些融合蛋白(例如含有内含肽CBD的融合蛋白)可经历自切割来产生CNP。在其它实施例中，融合蛋白在CNP变体与载体蛋白或标签(例如肽标签) 之间包含切割可切割肽接头。在某些实施例中，切割可切割肽接头选自Asp-Pro、 Asn-Gly、Met-X、Val-Asp-Asp-Arg (SEQ ID NO 233), Gly-Ser-Asp-Arg (SEQ ID NO: 234)、Ile-Thr-Asp-Arg(SEQ ID NO :235) , Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ ID NO :236)、 Ile-Glu-Gly-Arg-X(SEQ ID NO :230) , Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X (SEQ ID NO :231)、 Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly(SEQ ID NO :232), Ala-Phe-Leu-Gly-Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ ID NO 237)，及 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTCDDDDKHMD (pET_15b 接头)(SEQ ID NO :95)，其中 X 表示氨基酸。在一些实施例中，切割可切割肽接头系藉由选自由以下组成的群的切割切割剂切割钯、溴化氰(CNBr)、甲酸、羟胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、肠激酶(肠肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子)(a蛋白酶、枯草杆菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、变种枯草杆菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人类I^ace蛋白酶、胶原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皱胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、钙蛋白酶、木瓜凝乳酶、无花果酶(无花果蛋白酶)、菠萝酶(菠萝蛋白酶)、组织蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内切蛋白酶 Arg-C、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纤维蛋白溶酶。在某些实施例中，可切割载体蛋白、标签(例如肽标签)或肽接头系使用甲酸来切割以自融合蛋白释放CNP变体。在一些实施例中，甲酸浓度为约至约20%，或约至约15%，或约2%至约15%，或约至约10%，或约2%至约10%，或约至约5%，或约2%至约5%。在某些实施例中，甲酸浓度为约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%、11%、12%、13%、14%或15%。在某些实施例中，甲酸浓度为约2%、5%或10%。在其它实施例中，在甲酸存在下，在约20°C至约80°C，或约30°C至约75°C，或约 40°C至约75°C，或约50°C至约75°C，或约50 V至约70 V，或约55°C至约70°C，或约50 V至约60°C的温度下进行CNP融合蛋白切割。在一些实施例中，在甲酸存在下，在约20°C、22°C、 25°C、30°C、35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C或 80°C下进行切割。在某些实施例中，在甲酸存在下，在约501、551、601、651或701下进行切割。在某些实施例中，在甲酸存在下，在约55°C或70°C下进行切割。在其它实施例中，甲酸存在下CNP融合蛋白的切割进行约3小时至约48小时，或约5小时至约48小时，或约5小时至约36小时，或约5小时至约M小时，或约5小时至约 18小时，或约20小时至约M小时，或约6小时至约10小时的时段。在某些实施例中，甲酸存在下的切割进行约5小时、6小时、12小时、15小时、18小时、20小时或M小时。在一些实施例中，CNP融合蛋白的切割在约2 %、5 %或10 %甲酸存在下，在约55°C 下进行约20小时至约36小时，或在约60°C下进行约15小时至约M小时，或在约65°C下进行约10小时至约21小时，或在约70°C下进行约6小时至约18小时。在某些实施例中， CNP融合蛋白的切割在约2%甲酸存在下，在约55°C下进行约20小时至约M或36小时，或在约60°C下进行约15小时至约M小时，或在约65°C下进行约10小时至约18小时，或在约70°C下进行约6小时至约10小时。本文提供使用甲酸来切割CNP融合蛋白以得到高CNP变体产率的温和条件。本文所述使用甲酸来切割融合蛋白的条件亦适用于切割包含除CNP外的多肽或蛋白质的融合蛋白，其中这些融合蛋白含有Asp-Pro肽键。在其它实施例中，在CNP融合蛋白的化学切割(例如使用甲酸)或蛋白水解切割之前，先以缓冲液及/或去污剂处理可溶性CNP融合蛋白或CNP融合蛋白包涵体。缓冲液的非限制性实例包括B-PER II;经稀释B-PER II (例如1/20稀释度)；B-PER ;B_PER磷酸盐缓冲液；含有Tris的缓冲液(例如25mM Tris, pH 7. 5)；含有Tris及NaCl的缓冲液(例如25mM TrisU50mM NaCl, pH 7.9)；及PBS。在一实施例中，缓冲液为B-PER II。去污剂的非限制性实例包括辛基蔗糖、Triton X-100、Tween-20、NP-40及CA-630。去污剂可位于缓冲液中(例如，含去污剂的25mM Tris缓冲液(pH 7.5))。在某些实施例中，去污剂为 Triton X-100 或 CA-630。应了解，上述任何方法及条件可与上述任何其它方法及条件组合使用来产生本文所揭示的CNP变体。在其它实施例中，本文所述的CNP变体系使用肽合成器合成且根据此项技术中已知的方法，例如根据Atherton^SSkppardjSolid Phase Peptide Synthesis :a Practical Approach (固相肽合成实验方法)JRL Press (Oxford, England (1989))的方法进行纯化。肽可基于例如CNP的以下肽序列来合成=G1LSOi或R)GC6F7G8L(K或R或Nle或 6-0H-Nle)LDRIGSMSGLGC 2。例示性CNP变体包括(但不限于)类似物A(GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO :56)通过将 C6 的主链”-C =0”基团转化为”-CH2”基团来制得；类似物B (GLSKGC (N-Me-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 57 通过将 F7 的主链” -NH”基团转化为” -N-CH3"基团来制得；类似物E (GLSKGC (D-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO : 136)通过在 F7 使用 D-Phe来制得；类似物F(GLSKGCF(tBu-Gly)LKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO :58)通过在 G8 使用叔丁基-Gly来制得；类似物G(GLSKGC (3-Cl-Phe) GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 137)通过将氯原子添加至F7的苯环的间位来制得(类似变体可通过以Cl、F、Br、OH及/或CH3对W1W的苯环进行邻位、间位及/或对位取代来产生)；且类似物H (GLSKGC [NHCH2CH (Ph) CO] GLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO 59)通过在 F7 使用(士)-3-(氨基)-2-苯基丙酸来制得。具有例如氨基酸延伸、天然或非天然氨基酸或肽键等构物的取代，及/或与聚合物或疏水部分的偶联的CNP变体的实例包括(但不限于)类似物J C6-CH2-NH、N-Me-L9、N-Me-L20(SEQ ID NO :91)类似物K N-Me-L9、N-Me_L20(SEQ ID NO :92)类似物L N-Me-L9、N-Me-L11、N-Me-L20(SEQ ID NO :93)类似物M N-Me_L9、N-Me-Lll (SEQ ID NO :94)类似物Z K4R、F7Y(SEQ ID NO :95)类似物AAK4R、G8V (SEQ ID NO :96)
类似物ABK4R、G8S (SEQ ID NO 97)类似物ACK4R、G8T (SEQ ID NO 98)类似物ADK4R、L9T (SEQ ID NO 99)类似物AEK4R、G15R(SEQ ID NO :100)类似物AFK4R、G15Cit(SEQ ID NO :101)类似物AGK4R、M17V(SEQ ID NO :102)类似物AHK4R(SEQ ID NO :35)类似物AJK4R、L20V (SEQ ID NO 103)类似物AKK4R、L20t-Bu_Ala(SEQ ID NO :104)类似物ATG1E、K4E (SEQ ID NO 105)类似物AVG1E、K4E-戊酸(连接于 N 端)(SEQ ID NO 106)类似物AWG1E、K4E-庚酸(连接于 N 端)(SEQ ID NO 107)类似物AXCNP17 ( Δ N 端)(SEQ ID NO 2)类似物AYGANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)类似物AZR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 41)类似物 BBGlE-庚酸(连接于 N 端)(SEQ ID NO 108)类似物BCGlE-戊酸(连接于 N 端)(SEQ ID NO 109)类似物BFK4R、KlOCit (SEQ ID NO :110)类似物BGK4R、KlOQ (SEQ ID NO :111)类似物BHK4R、KlOR (SEQ ID NO :112)类似物BJK4R、Gl5N (SEQ ID NO 113)类似物BKK4R、G15S(SEQ ID NO :114)类似物BLCNP-37 (SEQ ID NO :60)CNP-53(SEQ ID NO 4)类似物CAAAWARLLQEHPNA-CNP22 (SEQ ID NO :61)类似物CBAAWARLLQEHPNAR-CNP22 (SEQ ID NO :62)类似物CCDLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (SEQ ID NO :63)类似物CDSPKMVQGSG-CNPI7-KVLRRH (N 端及 C 端 BNP 尾)(SEQ ID NO 68)类似物CEGERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (HSA-CNP22) (SEQ ID NO :81)类似物CFGQPREPQVYTLPPS-CNP22 (SEQ ID NO :79)PEG (24K) -CNP22PEG (20K) -CNP22PEG (5K) -CNP22PEG (2K) -CNP22PEG(2K) -CNP17PEG (IK)-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO :36)PEG(IK) -CNP22PE04- (PE012) 3 (分支)-CNP22PE012-CNP22
PE012-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO 36)PE024-GANRR-CNP22 (K4R) (SEQ ID NO 36)；及SEQ ID NO :1至6及；34至144，及其包含至多1、2、3、4或5个其它修饰的变体。在一实施例中，CNP变体经由在Cys6与Cys22之间形成二硫键来环化。Cys6可为半胱氨酸类似物，诸如高半胱氨酸或青霉胺。在另一实施例中，CNP变体可通过头至尾、侧链至侧链、侧链至头或侧链至尾形成的共价键来环化。在一实施例中，在位于或靠近肽的N 端的氨基酸与位于或靠近肽的C端的氨基酸(在此上下文中称作”末端”氨基酸)之间形成共价键。在另一实施例中，在两个末端氨基酸的侧链之间形成共价键。在另一实施例中，在一个末端氨基酸的侧链与另一末端氨基酸的末端基团之间，或在两个末端氨基酸的末端基团之间形成共价键。末端胺与末端羧基的头至尾环化可使用多种方法来进行，例如使用对硝基苯酯、 2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、叠氮化物法、混合酸酐法、HATU、碳二亚胺(例如DIC、EDC或 DCC)及催化剂(诸如 HOBt、HONSu 或 HoAt)，或树脂上环化(on-resin cyclization)。另外，环状结构可经由涉及CNP变体的氨基酸残基的侧链及/或末端氨基酸残基的桥联基团形成。桥联基团为允许肽的两个部分环化的化学部分。桥联基团的非限制性实例包括酰胺、硫醚、硫酯、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、磺酰胺及其类似物。此项技术中已知并入具有此等桥联基团的单元的多种方法。举例而言，可在N端氨基或侧链氨基与C端羧酸或侧链(例如赖氨酸或鸟氨酸的侧链，及谷氨酸或天冬氨酸的侧链)羧基之间形成内酰胺桥(亦即环状酰胺)。可在C端羧基或侧链羧基与半胱氨酸或半胱氨酸类似物的侧链硫醇基之间形成硫酯。或者，可藉由掺入羊毛硫氨酸(硫代二丙氨酸)残基以连接藉由硫醚键共价键合在一起的丙氨酸残基来形成交联。在另一方法中，诸如二羧酸(例如辛二酸(suberic acid/octanedioic acid))的交联剂可连接氨基酸侧链的官能基(诸如游离氨基、羟基及硫醇基)。亦可使用酶催化环化。举例而言，已报导可使用短杆菌酪肽(tyrocidine)合成酶的硫酯酶域来环化硫酯前体，可使用枯草杆菌蛋白突变体来环化肽羟乙酸苯丙氨酰基酰胺酯，且可使用抗体连接酶16G3来环化对硝基苯基酯。关于肽环化的回顾，请参看Davies， J. Peptide Sci.(肽科学杂志)，9 :471-501 (2003)，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，最终环化产物具有至少约70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、 96%、97%、98%或至少约99%的纯度。D.经化学修饰的CNP变体CNP22或其变体的化学修饰可可能赋予经修饰CNP肽以有利特性，诸如稳定性及半衰期增加及免疫原性降低(有关对治疗蛋白的化学修饰的一般论述，请参看 Wmrmazie (药物)，57(1) :5_29 (2002))。举例而言，使天然或合成的聚合或非聚合部分 (例如PEG)连接至CNP肽以将CNP肽的总质量增至本文一般描述的范围(例如约2. 6kDa 或2. 8kDa至约6kDa或7kDa的范围)可降低经修饰肽对外肽酶及/或内肽酶(例如 NEP)活体内切割的敏感性。除聚乙二醇化、糖基化及其它化学衍生化程序(例如藉由磷酸化、酰胺化、羧基化、乙酰化、甲基化及产生酸加成盐来进行修饰)外，酰胺、酯及N-酰基衍生物亦可潜在地遮蔽免疫原性区域及/或蛋白水解敏感区域Science (科学)，303 480-482(2004))ο化学修饰的实例包括(但不限于)用于改良稳定性及蛋白酶抗性且降低免疫原性的Bednarsaki的聚合物添力口法及Altus Corporation的交联法。Bednarsaki显示聚合物添加可改良蛋白质的温度稳定性(J. Am. Chem. Soc.(美国化学学报)，114(1) 378-380(199 )，且Altus Corporation发现戊二醛交联可改良酶稳定性。多肽的化学修饰可以非特异性方式(产生衍生物质的混合物)，或以位点特异性方式(例如基于野生型大分子反应性引导的衍生化，及/或使用定点突变诱发与化学修饰的组合的位点选择性修饰)，或者使用所表达蛋白质连接法来进行(Curr.Opin. Biotechnol.(生物技术目前观点)，I3 (4) =297-303 (2002)) 聚乙二醇化CNP变体在一实施例中，为增强稳定性(例如对NEP降解的抗性)，使CNP22或其变体(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的变体)偶联至亲水性天然或合成聚合物，以将经修饰 CNP肽的总质量增至约2. 6kDa或2. 8kDa至约4、5、6、7kDa或7kDa以上的范围。在某些实施例中，所添加的亲水性聚合物具有约0. 6,0. 8、1、1. 2,1. 4,1. 6,1. 8、2、2. 2,2. 4,2. 6,2. 8、 3,3. 2,3. 4,3. 6,3. 8、4、4· 2,4. 4,4. 6,4. 8kDa 或约 5kDa 的总质量。在一实施例中，亲水性聚合物具有水溶性，以便与其偶联的CNP肽在水性(例如生理)环境下不会沉淀出来。此外，亲水性聚合物具有生物兼容性，亦即不会在活体内引起损伤、毒性或免疫反应。亲水性聚合物可为分支或未分支聚合物。在一实施例中，亲水性聚合物未分支。CNP22或其变体可能与亲水性聚合物在各种位点偶联，包括(但不限于)(1)仅在N端；⑵仅在C端；(3)仅在内部位点(例如Lys4) ； (4)在N端与C端；(5)在N端及内部位点；及(6)在C端及内部位点。在一实施例中，CNP22或其变体仅在N端偶联至亲水性聚合物。在另一实施例中，仅在内部位点(例如Lys4)偶联。在另一实施例中，在N端及内部位点(例如Lys4)偶联。在又一实施例中，为达成更佳功能性，CNP肽不在环状域(对应于CNP22的Cys6至Cys22)内的位点(例如LyslO)偶联至亲水性聚合物。若与亲水性聚合物的偶联系基于与CNP肽上的反应性伯氨基形成键，则可藉由以侧链上不含反应性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(诸如Gly、Ser, Arg、Asn、Gin、Asp、Glu或瓜氨酸 (Cit))取代Lys4及/或LyslO来防止在内部位点(例如Lys4及/或LyslO)偶联。在一特定实施例中，Lys4及/或LyslO经Arg置换。在另一实施例中，LyslO未经Arg置换。亲水性聚合物的非限制性实例包括自带有羧酸的单体(例如甲基丙烯酸(MA) 及丙烯酸(AA))形成的聚合物；聚乙烯醇；自带有羟基的单体(例如甲基丙烯酸羟乙酯 (HEMA)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、羟丙基甲基丙烯酰胺，及甲基丙烯酸3-三甲基硅烷基丙酯(TMSPMA))形成的聚合物；聚环氧烷；聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)；聚(乙二醇) (PEG)；聚(丙二醇)；单C1-Cltl烷氧基-PEG(例如单甲氧基-PEG)；三氟乙磺酰基单甲氧基-PEG ；芳氧基-PEG ；PEG丙烯酸酯(PEGA) ；PEG甲基丙烯酸酯；PEG丙醛；双丁二酰亚氨基碳酸酯PEG ;2_甲基丙烯酰氧基乙基-磷酸胆碱(MPC)与N-乙烯基吡咯啶酮(VP)的共聚物；羟基官能性聚(N-乙烯基吡咯啶酮)(PVP) ；SIS-PEG(SIS为聚苯乙烯-聚异丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚物)；聚苯乙烯-PEG;聚异丁烯-PEG ；PCL-PEG(PCL为聚己内酯)； PLA-PEG(PLA为聚乳酸)；PMMA-PEG(PMMA为聚(甲基丙烯酸甲酯))；PDMS-PEG(PDMS为聚二甲基氧环己酮(polydimethyloxanone)) ；PVDF-PEG(PVDF 为聚偏二氟乙烯)；PLUR0NIC 界面活性剂(聚环氧丙烷-共-聚乙二醇) ’聚(伸丁二醇) ’聚(L-赖氨酸-g-乙二醇)(PLL-g-PEG)；聚(L-赖氨酸-g-透明质酸)(PLL-g-HA)；聚(L-赖氨酸-g-磷酰胆碱)(PLL-g-PC) ’聚(L-赖氨酸-g-乙烯基吡咯啶酮)(PLL-g-PVP)；聚(乙亚胺-g-乙二醇)(PEI-g-PEG)；聚(乙亚胺-g_透明质酸)(PEI-g-HA)；聚(乙亚胺-g-磷酰胆碱) (PEI-g-PC)；聚(乙亚胺-g-乙烯基吡咯啶酮)(PEI-g-PVP) ；PLL-共-HA、PLL-共-PC、 PLL-共-PVP、PEI-共-PEG、PEI-共-HA、PEI_ 共 _PC、PEI_ 共-PVP、纤维素及其衍生物(例如羟乙基纤维素)；聚葡萄糖；糊精；透明质酸及其衍生物(例如透明质酸钠)；弹性蛋白；壳聚糖；丙烯酸硫酸酯；丙烯酸磺酸酯；丙烯酸氨基苯磺酸酯；甲基丙烯酸硫酸酯；甲基丙烯酸磺酸酯；甲基丙烯酸氨基苯磺酸酯；其聚合物及共聚物；及其组合的聚合物及共聚物。在一特定实施例中，亲水性聚合物为聚(乙二醇)(PEG)，亦称聚(环氧乙烷) (PEO)。如本文中所用，术语”PEG”或”ΡΕ0”包括可用于衍生多肽的PEG的所有形式(分支及未分支)，包括(但不限于)单(C1-Cltl)烷氧基-PEG及芳氧基-PEG。在一实施例中，PEG-CNP偶联物包含式(CH2CH2O)n的PEG(或ΡΕ0)聚合物，其中η 为约6至约100的整数，且PEG聚合物为约0. 3kDa至约5kDa。在另一实施例中，η为约12 至约50的整数，且PEG聚合物为约0.6kDa至约2. 5kDa。在另一实施例中，η为约12至约 24，且PEG聚合物为约0. 6kDa至约1. 2kDa。在另一实施例中，PEG聚合物的末端羟基经非反应性基团封端。在一特定实施例中，封端基团为烷基，例如低级烷基，诸如甲基，以使PEG 聚合物以烷氧基终止。在一实施例中，PEG聚合物未分支。在另一实施例中，CNP22或其变体仅在N端偶联至PEG聚合物。PEG及PEO视其制备方式而可能包括具有分子量分布的分子，亦即，其可能具有多分散性。聚合制剂的大小/质量分布在统计学上可由其重量平均分子量(Mw)及其数目平均分子量(Mn)表征，其比率系称作多分散性指数(Mw/Mn)。Mw及Mn可藉由质谱法量测。偶联至大于1. 5kDa的PEG部分的PEG-CNP变体可因母体PEG分子的多分散性质而显示分子量范围。举例而言，在mPEGI (Sunbright ME-020HS, NOF Co.)的情况下，PEG分子的分子量分布于约1. 5kDa至约3kDa的范围内，多分散性指数为1. 036。相反，使用皮尔斯生物技术 (Pierce Biotechnology)(洛克福德，伊利诺斯州)的 MS (PEG)n 试剂(n = 4、8、12 或 24，表示为例如”ΡΕ012”或”ΡΕ0Μ”)偶联至CNP22或其变体的PEG具有单分散性，具有不连续链长及规定分子量。用于产生包含PEG部分的多肽的方法为此项技术中所已知(例如参看美国专利 5，824，784)。制备聚乙二醇化CNP肽的方法一般包含以下步骤(a)使CNP22或其变体与聚乙二醇化试剂在适于将PEG连接至CNP肽(例如在N端)的条件下反应，及(b)获得反应产物。因为对CNP肽进行聚乙二醇化可显著改变其与NPR-B的结合，所以可视PEG部分的大小及聚乙二醇化的位置而定，探索不同种类的PEG及聚乙二醇化反应条件。可用于对 CNP肽进行聚乙二醇化的化学包括使用甲氧基-PEG(0-[(N- 丁二酰亚氨基氧基羰基)-甲基]-0’-甲基聚乙二醇)的NHS酯对肽的反应性伯胺进行酰化。以甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA进行酰化产生消除初始伯胺的任何电荷的酰胺键。以符号”PE012”或”ΡΕ0Μ” 表示的PEG-CNP肽，以及以符号”PEG1K”、”PEG (”、”PEG ”或”PEG20K”表示的肽系经由肽上的伯氨基与经NHS酯活化、甲氧基封端的PEG试剂反应来进行聚乙二醇化。PEG-CNP变体亦可藉由其它方法，例如经由涉及肽上的伯氨基及PEG醛(诸如PEG-丙醛)或其单C1-Cltl 烷氧基或芳氧基衍生物的还原性胺化来制备(参看美国专利5，252，714)。不同于核糖体蛋白质合成，合成肽的合成系自C端进行至N端。因此，Boc-PEG(含有第三丁氧羰基(Boc))为一种将PEG连接至肽的C端的方法(R.B.Merrifield，J.Am. Chem. Soc.(美国化学学报)，85 (14) :2149-2154 (1963))。或者可采用Fmoc (弗基甲氧羰基)化学(E. Atherton 及 R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis :a Practical Approach (固相肽合成实验方法)，IRL Press (Oxford，England (1989))。制备PEG-CNP变体的本发明方法提供聚合物-蛋白质偶联物的实质上均质混合物。纯化之后，不连续PEG-CNP制剂对于生物特性的活体外及活体内测试足够纯。如本文中所表明，某些PEG-CNP变体显示对NEP切割的敏感性降低及实质上类似或更佳的功能性 (例如刺激cGMP产生)。如本文所述，使用适当聚乙二醇化试剂/CNP肽比率及反应条件进行的CNP22或其变体的聚乙二醇化反应提供PEG-CNP衍生物。聚乙二醇化的性质及程度可使用例如PAGE 及HPLC分析来测定。在某些实施例中，至少约50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或99 %的 CNP22或其变体在N端经单聚乙二醇化。为优化聚乙二醇化对CNP肽的生物特性的有利影响，可改变聚合物长度、构型(例如分支或线性)，及/或PEG部分的官能化(例如添加带负电基团)。针对NEP抗性、药物动力学及生物活性(例如结合NPR-B及刺激cGMP产生的能力)对聚乙二醇化CNP变体进行测试。可例如于活体外在基于大鼠软骨肉瘤细胞的软骨发育不全模型中，及于活体内在鼠类软骨发育不全动物模型中进一步测试显示获改良NEP抗性及CNP22的cGMP刺激活性的至少约50%的聚乙二醇化CNP变体。 E.使用CNP变体的方法、CNP变体的医药组合物，及给药途径使用CNP变体的方法骨相关病症成纤维细胞生长因子(FGF)在骨形成方面起重要作用，且FGF受体基因(FGFR 1、 2及3)的突变导致多种遗传性骨骼畸形(Curr. Biol.(目前生物学)，5 :500-507 (1995))。特别是，FGFR-3的活化突变造成长骨病症，包括软骨发育不全(人类遗传性侏儒症的最常见形式)(Nature (自然)，371 :252-254(1994) ；Cell (细胞)，78 :335_；342 (1994))，较轻度病症软骨发育低下(Ann. N. Y. Acad. Sci.(纽约科学年报),785 182-187 (1996))，及较严重及新生儿致死性第I型及第II型侏儒症性发育不全(TD) (Hum. Mol. Genet.(人分子遗传学)，5 :509-512(1996) ；Nat. Genet.(自然遗传学)，9 :321-3 (1995))。过度表达 FGF-2 且从而活化FGFR-3的小鼠模型显示长骨缩短及巨头畸形(Mol. Biol. Cell (分子生物学，细胞)，6 :1861-73(1995))。与此模型相符，缺乏FGFR-3的小鼠显示显著的骨骼过度生长与较宽生长板(Nature Genet.(自然遗传学)，12 :390-397 (1996))。使用CNP、NPR-B及NPR-C的互补实验表明肽配位体、相应受体与骨生长之间的联系。在转殖基因小鼠中藉由提高血浆浓度的CNP来活化NPR-B引起骨骼过度生长(Nat. Med.(自然医学)，10 :80-86 0004))，此在组织学上类似于FGFR-3基因敲除小鼠的生长板软骨的情形(Nat. Genet.，4 :390-397 (1996))。在NPR-C基因敲除小鼠中，应消除NPR-C 介导的CNP清除；与此预测相符，基因敲除动物显示延长的长骨及延长的椎骨与脊柱隆凸 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :7403-08 (1999))。相反，CNP基因敲除的小鼠因长骨及椎骨较短而矮化(表型在组织学上类似于软骨发育不全)，且因咬合异常及肺受小胸腔限制而致使死亡率增加(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 :4016-4021 (2001))。与所提出的 CNP 作为 NPR-B的活化剂的作用相符，NPR-B基因敲除小鼠与CNP基因敲除小鼠具有相同矮化骨骼表型及增加的死亡率(Proc. Natl. Acad. Sci USA, 101 17300-05 (2004))。此外，在软骨中具有活化FGFR-3的软骨发育不全的小鼠模型中，软骨细胞中CNP的靶向过度表达对抗侏儒症 Wasoda等人，Nat. Med.(自然医学)，10 :80-86 (2004))。另外，已显示CNP在调节软骨内骨生长及软骨细胞活性方面起作用，包括(但不限于)软骨细胞增殖及分化、抑制有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-I)激酶信号传导路径及促进软骨内骨化Wasoda等人， Nat. Med.(自然医学)，10 :80-86(2004)).此等结果表明CNP/NPR-B系统的活化为治疗人类软骨发育不全的潜在治疗策略。本文的CNP变体藉由刺激基质产生、使软骨细胞增殖及分化及增强长骨生长而适用于治疗患骨相关病症(诸如骨骼发育不良)的哺乳动物，包括人类。CNP反应性骨相关病症及骨骼发育不良的非限制性实例包括软骨发育不全、软骨发育低下、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不全、致死性软骨发育不全、成骨不全、软骨成长不全、斑点状软骨发育异常、同型合子软骨发育不全、斑点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死性低磷酸酯酶症、周产期致死型成骨不全、短肋骨综合征多指综合征、软骨发育低下、肢根型斑点状软骨发育异常、詹森型干骺端发育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia)、生HH本 ^ 勾 ^^良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita) > 骨发育不全症(atelosteogenesis)、骨畸形性发育不良(diastrophic dysplasia)、先天性短股骨、朗格型肢中部发育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部发育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、综合征罗比挠综合征(Robinow syndrome)、综合征莱茵哈特综合征(Reinhardt syndrome)、肢端发育不全(acrodysostosis)、周围性骨发育不全、克尼斯特发育不良(Kniest dysplasia)、纤维软骨发生(fibrochondrogenesis)、综合征罗伯茨综合征(Roberts syndrome)、肢端肢中发育不全、短肢畸形、莫基奥综合征(Morquio syndrome)、克尼斯特综合征(Kniest syndrome)、后生营养性发育不良(metatrophic dysplasia)及脊椎干骺端发育不良 (spondyloepimetaphyseal dysplasia)。此外，CNP变体适用于生长激素的辅助物或替代物以便治疗特发性身材矮小及其它骨骼发育不良。另外，CNP变体适用于治疗其它骨相关病状及病症，诸如佝偻病、低磷酸盐血症性佝偻病[包括X染色体连锁低磷酸盐血症性佝偻病(亦称为抗维生素D佝偻病)及常染色体显性低磷酸盐血症性佝偻病]，及软骨病[包括肿瘤诱发的软骨病(亦称为致癌软骨病或致癌低磷酸盐血性软骨病)]。本文的CNP变体亦可用以治疗骨关节炎。骨关节炎为关节软骨的退化性疾病且通常发生于老年人中。骨关节炎涉及软骨破坏及由关节组件退化所致的骨与软骨的增生性变化，其中该变化导致继发性关节炎(例如滑膜炎)。在骨关节炎中，作为软骨的功能性实体的细胞外基质蛋白质减少，且软骨细胞数目减少(Arth. Iiheum. 46 (8) 1986-1996 (2002)) 0 藉由促进基质产生、软骨细胞生长及分化，CNP变体适用于在患关节炎(包括骨关节炎)的个体中抗衡FGF-2的不当作用及增加基质合成，藉此治疗关节炎，包括骨关节炎。血管平滑肌病症
CNP及其它血管活性肽(包括ANP、BNP及尿舒血管素(urodilatin))具有血管扩张及利尿特性且在心血管内稳定中起重要作用(J. Cardiovasc. Pharmaco 1.(心血管药物学杂志)，117 =1600-06(1998) ；Kidney Int.(国际肾脏)，49 :1732-37(1996)； Am. J. Physiol.(美国生理学杂志)，275 :H1826_1833 (1998))。CNP广泛分布于心血管系统中，尤其以高浓度分布于血管内皮细胞中(J. Cardiovasc. Wiarmacol.(心血管药物学杂志)，117 :1600-06(1998))。CNP为血管平滑肌(尤其在冠状循环中)的有效松弛剂 (Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)205 :765-771 (1994))，且为平滑肌细胞增殖的抑制剂(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)177 :927-931 (1991))。尽管CNP的血管扩张作用的效力不如ANP强(约1 100) (Hypertens. Res.(高血压研究)，21 :7_13 (1998) ；Am. J. Physiol.(美国生理学杂志)，
275:L645-L652(1998))，但在发炎性心血管病理学中，CNP mRNA回应于剪切应力而增加(FEBS Lett. (FEBS 通信)，373 :108-110 (1995))，且 CNP 的血菜含量升高(Biochem. Biophys. Res. Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)198 1177-1182 (1994))。已显示 CNP经由抑制巨噬细胞浸润于兔的受损颈动脉中来抑制发炎(Circ.Res.(循环研究)， 91 :1063-1069^00 ),且经由NPR-B/cGMP依赖性路径直接抑制心脏成纤维细胞增殖 (Endocrinology (内分泌学)，144 :2279-2284 (2003)) CNP的心血管作用系经由NPR亚型NPR-B及NPR-C的活化来介导 (Endocrinology (内分泌学)，130 :229-239 (1992))，NPR-C 占活体内表达的 NPR 的 95% (Science (科学)，293 1657-1662 (2001))。CNP/NPR-B 路径在心血管系统中引起 cGMP (公认第二信使)升高。NPR-C的C端的37个氨基酸部分具有与异源三聚G蛋白Gi相互作用的共同序列(J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，274 17587-17592 (1999))，已显示该异源三聚G蛋白Gi调节腺苷酸环化酶及磷脂酶C活性(J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，
276:22064-70(2001) ；Am. J. Physiol.(美国生理学杂志)，278 :G974-980 (2000) J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，271 19324-19329 (1996)) CNP经由NPR-C的活化及G蛋白调节的内向性整流K+通道的开启来介导平滑肌超极化及松弛(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :1426-1431(2003)).同样，CNP在心脏成纤维细胞中具有重要抗增殖作用，且经由与 NPR-C相互作用使平滑肌细胞超极化来调节局部血液流动及全身血压(R. Rose及I Giles, J. Physiol.(生理学杂志)586 :353-366 (2008))。CNP22通过结合于血管平滑肌细胞上的NPR-B来刺激cGMP的产生，cGMP充当细胞内第二信使以最终使得血管松弛。基于CNP的降血压作用，本文的CNP变体适用于治疗高血压、充血性心脏衰竭、心原性水肿、肾水肿、肝原性水肿、急性及慢性肾功能不全等。另外， cGMP信号传导的活化抑制血管平滑肌细胞的生长。因此，本文的CNP变体可用以治疗由血管平滑肌细胞的异常生长所致的病状或疾病，包括(但不限于)再狭窄及动脉硬化。上述研究表明，CNP可为用于血管平滑肌松弛及重塑的潜在治疗候选物。CNP对于某些病症的药理作用部分地归因于血管保护作用而非血管扩张活性(Am. J. Respir. Crit. Care Med.(美国呼吸道重症监护医学杂志)，170 :1204-1211 (2004))。因此，本文的CNP变体适用于治疗CNP可具有血管保护作用的病状，例如血管平滑肌病症，该血管保护作用包括(但不限于)诱导平滑肌松弛及抑制巨噬细胞浸润于心脏组织中。在一实施例中，使用 CNP变体来治疗心脏衰竭，包括(但不限于)急性代偿失调性心脏衰竭及急性充血性心脏衰竭。在另一实施例中，使用CNP变体来治疗哮喘、心肌症及冠状动脉再狭窄(藉由增强平滑肌细胞松弛及减少平滑肌细胞增殖)。CNP变体的医药组合物在其它实施例中，本文提供医药组合物，其包含CNP变体及一或多种医药学上可接受的赋形剂、载体及/或稀释剂。在某些实施例中，这些组合物进一步包含一或多种其它生物活性剂(例如蛋白酶、受体酪氨酸激酶及/或清除受体NPR-C的抑制剂)。在一些实施例中，组合物包含纯度为至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%的所需CNP变体。在某些实施例中，组合物含有少于约10%、5%、 4^^3^^2^^1%或0.5%大分子污染物，诸如其它哺乳动物(例如人类)蛋白质及其它 CNP变体。赋形剂、载体及稀释剂的非限制性实例包括载体、液体、缓冲剂、等张剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、界面活性剂、乳化剂、湿润剂、佐剂等。组合物可含有液体(例如水、乙醇)；各种缓冲剂内容物(例如Tris-HCl、磷酸盐、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂)、 PH值及离子强度的稀释剂；去污剂及增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化剂(例如甲硫氨酸、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)；防腐剂(例如硫柳汞(Thimerosol)、苯甲醇、间甲酚)；及增积物质(bulking substance)(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖)。在此项技术中已知在医药组合物的制剂中使用赋形剂、稀释剂及载体；例如参看Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Remington 药典)，第 18 版，第 1435-1712 页,Mack Publishing Co. (Easton，Pennsylvania(1990))，其系以其全文引用的方式并入本文中。举例而言，载体包括(但不限于)稀释剂、载体及佐剂，以及植入运载体，及不与活性成分反应的惰性无毒固体或液体填充剂及囊封材料。载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水及乳液(例如油/水乳液)。载体可为含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其类似物)、植物油及其混合物的溶剂或分散介质。在一些实施例中，组合物为液体制剂。在某些实施例中，制剂包含浓度范围为约 0. lmg/ml 至约 20mg/ml，或约 0. 5mg/ml 至约 20mg/ml，或约 lmg/ml 至约 20mg/ml，或约 0. lmg/ml 至约 10mg/ml，或约 0. 5mg/ml 至约 10mg/ml，或约 lmg/ml 至约 10mg/ml 的 CNP 变体。在其它实施例中，组合物包含缓冲溶液或缓冲剂以维持含CNP的溶液或悬浮液的 PH值在所需范围内。缓冲溶液的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水及亨克氏缓冲盐水(Hank's buffered saline)。缓冲剂包括(但不限于)乙酸钠、磷酸钠及柠檬酸钠。亦可使用缓冲剂的混合物。在某些实施例中，缓冲剂为乙酸/乙酸盐或柠檬酸/柠檬酸盐。适用于组合物中的缓冲剂的量部分视所用特定缓冲剂及溶液或悬浮液的所需PH值而定。举例而言，乙酸盐为在PH 5下比在pH 6下更有效的pH值缓冲剂，因此在pH 5的溶液中可使用比PH 6的溶液中所用较少的乙酸盐。在一些实施例中，缓冲剂具有约IOmM 士 5mM 的浓度。在某些实施例中，组合物的PH值为约pH 3至约pH 7.5,或约pH 3. 5至约pH 7，或约pH 3. 5至约pH 6. 5，或约pH 4至约pH 6，或约pH 4至约pH 5，或为约pH 5.0 士 1.0。在其它实施例中，组合物含有等张调节剂以使得溶液或悬浮液等张且更兼容以便注射。等张剂的非限制性实例包括NaCl、葡聚糖、葡萄糖、丙三醇、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些实施例中，等张剂为NaCl。在某些实施例中，NaCl浓度为约160士20mM，或约
81140mM士 20mM，或约 120 士 20mM，或约 IOOmM士 20mM，或约 80mM士 20mM，或约 60mM士 20mM。在其它实施例中，组合物包含防腐剂。防腐剂包括(但不限于)间甲酚及苯甲醇。在某些实施例中，防腐剂浓度为约0.4% 士0.2%，或约士0.5%，或约1.5% 士0.5%，或约 2. 0% 士0. 5%。在其它实施例中，组合物含有抗吸附剂(例如以减轻CNP变体吸附至玻璃或塑料)。抗吸附剂包括(但不限于)苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些实施例中，抗吸附剂浓度为约0. 001 %至约0. 5%，或约0. 01 %至约0. 5%，或约0. 1 %至约1 %，或约0.5%至约1%，或约0.5%至约1. 5%，或约0.5%至约2%，或约1%至约2%。在其它实施例中，组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括丙三醇、甘油、硫甘油、甲硫氨酸及抗坏血酸及其盐。在一些实施例中，当稳定剂为硫甘油或抗坏血酸或其盐时，稳定剂浓度为约0. 至约1%。在其它实施例中，当稳定剂为甲硫氨酸时，稳定剂浓度为约0. 01 %至约0. 5 %，或约0. 01 %至约0. 2 %。在其它实施例中，当稳定剂为丙三醇时，稳定剂浓度为约5%至约100% (纯)。在其它实施例中，组合物含有抗氧化剂。例示性抗氧化剂包括(但不限于)甲硫氨酸及抗坏血酸。在某些实施例中，抗氧化剂与CNP变体的摩尔比为约0. 1 1至约15 1，或约1 1至约15 1，或约0.5 1至约10 1，或约1 1至约10 1，或约3 1至约 10 1。组合物中可使用医药学上可接受的盐，包括(但不限于)无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐)、有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐)，及胺盐(例如异丙胺、三甲胺、二环己胺、二乙醇胺)。医药学上可接受的盐的全面讨论可见于 Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Remington 药典)，第 18 版， Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania(1990))中。医药组合物可以各种形式给予，诸如锭剂、胶囊、颗粒剂、粉末、溶液、悬浮液、乳液、软膏及经皮贴片。组合物的剂型可据组合物的所需给予模式来调整。对于经口给予，组合物可采用例如锭剂或胶囊(包括软凝胶胶囊)的形式，或可为例如水性或非水性溶液、悬浮液或糖浆。供经口给予的锭剂及胶囊可包括一或多种常用赋形剂、稀释剂及载体，诸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米淀粉、糖精钠、滑石、纤维素、碳酸镁及润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酰反丁烯二酸钠)。必要时，可将调味剂、着色剂及/或甜味剂添加至固体及液体制剂中。用于经口制剂的其它可选成分包括(但不限于)防腐剂、悬浮剂及增稠剂。经口制剂亦可具有肠溶衣以保护CNP变体不受胃部的酸性环境影响。制备固体及液体剂型的方法为已知，或本领域技术人员将显而易见(例如参看上文所参考的Remington药典 (Remington 药典))。供非经肠给予的制剂可制备为例如液体溶液或悬浮液，制备为适于在注射之前溶解或悬浮于液体介质中的固体形式，或制备为乳液。举例而言，可根据此项技术中已知的技术，使用适合稀释剂、载体、溶剂(例如缓冲水溶液、林葛尔氏溶液(Ringer’ s solution), 等张氯化钠溶液)、分散剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂及其类似物来调配无菌可注射溶液及悬浮液。另外，可使用无菌不挥发性油、脂肪酸酯、多元醇及/或其它非活性成分。作为其它实例，供非经肠给予的制剂包括无菌可注射水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，及使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；及水性及非水性无菌悬浮液，其可含有悬浮剂及增稠剂。包含CNP变体的组合物亦可为冻干制剂。在某些实施例中，冻干制剂包含缓冲剂及膨胀剂，及视情况选用的抗氧化剂。例示性缓冲剂包括(但不限于)乙酸盐缓冲剂及柠檬酸盐缓冲剂。例示性膨胀剂包括(但不限于)甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚维酮(PVP K24).在某些实施例中，甘露糖醇的量为约3%至约10%，或约4%至约8%，或约4 %至约6 %。在某些实施例中，蔗糖的量为约6 %至约20 %，或约6 %至约15 %，或约 8%至约12%。例示性抗氧化剂包括(但不限于)甲硫氨酸及抗坏血酸。本文亦提供试剂盒，其含有例如包含液体(例如无菌可注射液体)制剂或固体 (例如冻干固体)制剂的瓶、小瓶、安瓿、管、药筒及/或针筒。这些试剂盒亦可含有医药学上可接受的载体或运载体(例如溶剂、溶液及/或缓冲液)以便将固体(例如冻干固体) 制剂复原成溶液或悬浮液以便给予(例如通过注射)，包括(但不限于)在针筒中复原冻干制剂以便注射或将浓缩物稀释至较低浓度。此外，可自例如包含含有CNP的组合物的无菌散剂、颗粒剂或锭剂制备临时注射溶液及悬浮液。试剂盒亦可包括分配装置，诸如喷雾器，或注射分配装置、笔式注射器、自动注射器、无针注射器、针筒及/或针。作为一非限制性实例，试剂盒可包括具有单腔室或双腔室的针筒。对于单腔室针筒，单腔室可含有备用于注射的液体CNP制剂，或固体(例如冻干固体)CNP制剂或CNP变体于相对较小量的适合溶剂系统(例如丙三醇)中的液体制剂，其可复原成溶液或悬浮液以便注射。对于双腔室针筒，一个腔室可含有医药学上可接受的载体或运载体(例如溶剂系统、溶液或缓冲液)，且另一腔室可含有固体(例如冻干固体)CNP制剂或CNP变体于相对较小量的适合溶剂系统(例如丙三醇)中的液体制剂，其可使用来自第一腔室的载体或运载体复原成溶液或悬浮液以便注射。作为另一实例，试剂盒可包括一或多个笔式注射器或自动注射器装置，及双腔室药筒。药筒的一个腔室可含有医药学上可接受的载体或运载体(例如溶剂系统、溶液或缓冲液)，且另一腔室可含有固体(例如冻干固体)CNP制剂或CNP变体于相对较小量的适合溶剂系统(例如丙三醇)中的液体制剂，其可使用来自第一腔室的载体或运载体复原成溶液或悬浮液以便注射。药筒可包含足以历经所需时段(例如1日、2日、3日、1周、2周、3 周、4周等)给药的量的CNP变体。可调节笔式注射器或自动注射器以自药筒给予所需量的 CNP制剂。另外，可将包含CNP变体的医药组合物调配为缓慢释放、控制释放或持续释放系统以便历经所需时段(诸如1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月)维持相对恒定的剂量浓度。如在此项技术中所已知，缓慢释放、控制释放及持续释放制剂可使用例如生物可降解的聚合系统{其可包含例如亲水性聚合物[例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)]}来制备，且可采用例如微粒、微球体或脂质体的形式。给药剂量及频率如本文中所用，术语活性剂(例如CNP变体)的”治疗有效量”指向患者提供治疗益处的量。该量可在个体之间不同及可视许多因素(包括患者的总体身体状况)而定。熟习此项技术者使用公开可得的材料及程序可容易地确定CNP变体的治疗有效量。举例而言，基于患有软骨发育不全的0-17岁儿童014名女性及189名男性)的生长图表 (其列出年龄别身高(height for age)、头围及体节生长(segmental growth))，用于疗法的CNP变体的量应得到可接受的生长速率(Horton WA等人，Standard growth curves for achondroplasia(软骨发育不全的标准生长曲线)，J. Pediatr.(儿科杂志)，93 435-8(1978))。⑶C图表可用以评估年龄别体重及身高别体重或年龄别BMI。亦可量测使用实质上较长疗程获得的次要结果。血清半衰期长于野生型CNP22的CNP变体可潜在地以低于CNP22的频率给予。特定个体的给药频率可视多种因素(包括所治疗的病症，及个体的状况及对疗法的反应)而变。在某些实施例中，约每日一次、每两日一次、每三日一次或每周一次给予个体含有CNP 变体的医药组合物。在一实施例中，为治疗骨相关病症(例如骨骼发育不良，包括软骨发育不全)，给予患者每日或每周剂量的CNP变体直至成人为止及/或贯穿成人期。本文所述的CNP变体可以治疗有效剂量给予患者以治疗、改善或预防骨相关病症 (例如骨骼发育不良，包括软骨发育不全)及CNP可提供血管保护作用的病状(例如血管平滑肌病症)。可于细胞培养物或实验动物中藉由标准药理学程序，诸如藉由测定LD5tl(对 50%群体致死的剂量)及ED5tl (在50%群体中治疗有效的剂量)来测定CNP变体的安全性及治疗功效。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数且其可以比率LD5tZED5tl形式表示。显示大治疗指数的活性剂通常较佳。获自细胞培养分析法及动物研究的数据可用以调配供人类使用的剂量范围。该剂量通常处于循环浓度(包括ED5tl)的范围内，其中毒性极小或最小。该剂量可视所用剂型及所用给药途径而在此范围内变化。治疗有效剂量可由细胞培养分析法及动物研究测定。在某些实施例中，本文所述的CNP变体系以约5或10nmol/kg至约300nmol/kg，或约20nmol/kg至约200nmol/kg范围内的剂量给予。在一些实施例中，以约5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、 170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、 750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量或治疗医师认为适当的其它剂量给予 CNP 变体。在其它实施例中，以约 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、 150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、 900、950或1000口8/1^或约 1,1. 25,1. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、 9、9. 5或10mg/kg的剂量，或治疗医师认为适当的其它剂量给予CNP变体。本文所述的CNP 变体的剂量可根据本文所述的给药频率/给药频率来给予，这些频率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。对于特定个体，给予/给予CNP变体的频率可视包括以下的多种因素而变化所治疗的病症、及个体的状况、及对疗法的反应。可以单次剂量或以每次给药多次剂量的形式给予CNP变体。在某些实施例中，以如下频率给予CNP变体单次剂量或多次剂量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每两周、每3周、每月、每6周、每2个月、每3个月，或治疗医师认为适当的频率。在一些实施例中，给予CNP变体以便留出生长期(例如软骨生成)，接着为恢复期 (例如骨生成)。举例而言，可静脉内、皮下，或藉由另一模式每日或每周多次给予CNP变体持续一段时间，接着为无治疗时期，接着重复该循环。在一些实施例中，初始治疗期(例如每日或每周多次给予CNP变体)持续3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、 10周、11周或12周。在一相关实施例中，无治疗时期持续3日、1周、2周、3周或4周。在某些实施例中，CNP变体的给药疗程为每日给药持续3日，接着3日不给药；或每日或每周多次给药持续1周，接着3日或1周不给药；或每日或每周多次给药持续2周，接着1或2 周不给药；或每日或每周多次给药持续3周，接着1、2或3周不给药；或每日或每周多次给药持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接着1、2、3或4周不给药。给药模式可以多种方式(诸如通过皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或鞘内注射)来给予个体CNP变体或包含其的医药组合物。在一实施例中，藉由一日一次单次皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或鞘内注射来给予CNP变体。亦可通过在疾病部位或其附近直接注射来给予CNP变体。此外，可通过在目标作用部位(例如异常骨或发育不全骨)植入储积器来给予CNP变体。或者，可于舌下方经舌下(例如舌下锭剂)或通过吸入肺中(例如吸入剂或气雾剂喷雾)、通过传递至鼻腔中(例如鼻内喷雾)、通过传递至眼内(例如滴眼剂)或通过经皮传递(例如藉助于皮肤贴片)来给予CNP变体。CNP变体亦可以微球体、微囊、脂质体(不带电或带电(例如阳离子型))、聚合微粒(例如聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液及其类似物的形式经口给予。另一给药方法通过渗透泵(例如Alzet泵)或微型泵(例如Alzet微型渗透泵) 来给予，这些泵允许控制、连续及/或缓释传递CNP变体或医药组合物持续预定时期。渗透泵或微型泵可植入目标部位(例如肢干的长骨、骨骺等)或目标部位附近的皮下。如上所说明，CNP变体可用以治疗由血管平滑肌细胞异常生长引起的病状或疾病，包括(但不限于)再狭窄及动脉硬化。为将CNP变体局部传递至患病身体血管(例如血管)，可借助植入于患病部位的医学装置(例如血管内支架)来传递CNP变体。在一实施例中，将CNP变体浸渍于安置于血管内支架上的聚合基质或聚合涂层内。在另一实施例中， CNP变体包含在形成于血管内支架内且由CNP变体可扩散穿过的多孔聚合膜或聚合层覆盖的储集器或通道内。如在此项技术中所已知，聚合基质、涂层、膜或层可包含至少一种生物可降解(例如亲水性)聚合物。在另一实施例中，CNP变体可含于血管内支架体中的微孔内。可自血管内支架通过爆发式释放、脉冲释放、控制释放或持续释放或其组合来传递CNP 变体。举例而言，血管内支架可依次以爆发式释放及持续释放的方式将CNP变体局部传递至患病部位。持续释放可持续多达约2周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年的时期。本领域技术人员将明白，CNP变体或其组合物亦可通过其它模式给予。CNP变体或其组合物的最有效给药模式的决定在本领域技术人员的技能范围内。CNP变体可以医药制剂形式给予，这些医药制剂适用于例如经口(包括颊内及舌下)、经直肠、经鼻、表面、经肺、经阴道或非经肠(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮下及静脉内)给予，或呈适于通过吸入或吹入给予的形式。视预定给药模式而定，医药制剂可呈固体、半固体或液体剂型，诸如锭剂、栓剂、丸剂、胶囊、散剂、液体、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、洗剂及其类似物。可以适于单次给予精确剂量的单位剂型提供制剂。这些制剂包含有效量的CNP变体，及一或多种医药学上可接受的赋形剂、载体及/或稀释剂，及视情况选用的一或多种其它生物活性剂。组合疗法在一实施例中，CNP变体可与一或多种适用于治疗、改善或预防CNP反应性病状或病症(诸如骨相关病症(例如骨骼发育不良)及血管平滑肌病症)的其它活性剂组合使用。其它活性剂可增强CNP变体的作用及/或除CNP变体的作用外亦发挥其它药理学作用。可与本文所述的CNP变体组合使用的活性剂的非限制性实例为其它利钠肽(例如BNP)，及肽酶及蛋白酶(例如NEP及弗林蛋白酶)、NPR-C及酪氨酸激酶(例如FGFR-3)的抑制剂(例如拮抗剂)。NEP抑制剂可通过防止CNP变体的NEP切割来延长变体的半衰期。NEP抑制剂的实例包括(但不限于)塞奥芬及坎沙曲。共同使用NPR-C抑制剂亦可经由抑制NPR-C对变体的清除来延长CNP变体的半衰期。NPR-C抑制剂的非限制性实例为片段reiPMDRIGRNPR(SEQ ID NO 82)，其将在目标部位(例如骨生长板)于reiPMDRIGRNPR-CNP22嵌合体(类似物 CZ) (SEQ ID NO 82)或包含CNP22的变体(例如相对于CNP22含有氨基酸取代、添加及/或缺失的变体)的类似嵌合体的蛋白水解切割后释放。共同使用酪氨酸激酶抑制剂可通过抑制酪氨酸激酶受体FGFR-3(—种软骨细胞及骨生长的负调节剂)来增强CNP的效果。酪氨酸激酶抑制剂的非限制性实例包括U. S. 6，329，375及6，344，459中所揭示者。为在组合疗法中达成适当治疗结果，一般将给予个体有效产生所需治疗结果(例如恢复骨生长)的组合量的CNP组合物与其它治疗剂。此方法可涉及同时给予CNP组合物与其它治疗剂。同时给予可藉由给予包括CNP变体与其它治疗剂的单一组合物或药理学蛋白质制剂来达成。或者，其它治疗剂可与CNP变体的药理学制剂(例如锭剂、注射液或饮齐U)大致在同时分别服用。亦可将CNP变体调配于适于摄取的食物(诸如核仁巧克力蛋糕 (brownies)、薄饼或蛋糕)中。在其它替代疗程中，给予CNP变体可在给予其它治疗剂之前或之后，间隔数分钟至数小时范围内的时间进行。在分别给予其它治疗剂及CNP组合物的实施例中，一般将确保CNP变体及其它治疗剂在彼此适当的时间内给予，以使CNP变体及其它治疗剂可对患者发挥协同或加成的有利作用。举例而言，可在其它治疗剂的约0. 5-6小时内(之前或之后) 给予CNP组合物。在一实施例中，CNP组合物在其它治疗剂的约1小时内(之前或之后)给予。鉴别及监测患者群体可建立鉴别适于CNP疗法的个体及确定指定患者对CNP疗法是否有反应的疗程。举例而言，对于治疗骨相关病症，可量测生长指标，诸如子宫内(in utero)及新生儿的长骨生长量测值，及骨生长生物标记(诸如CNP、cGMP、胶原蛋白II、骨钙化素及增殖细胞核抗原 (PCNA))的量测值。一种CNP信号传导标记为cGMP (鸟苷3’，5’环状单磷酸)。在CNP结合并活化其同源受体NPR-B之后，此细胞内信号传导分子的含量增加。可自CNP暴露后的细胞培养抽提物(活体外)、自CNP暴露后的骨外植体研究(离体)的条件培养基，及皮下、静脉内或经由此项技术中已知的其它给药途径给予CNP的数分钟内的血浆(活体内)量测提高的cGMP含量。亦可量测软骨及骨特异性分析物(或软骨及骨相关标记)来评估CNP功效。举例而言，切割的第II型胶原蛋白的片段为软骨更新的软骨特异性标记。第II型胶原蛋白为软骨的主要有机组分且在软骨更新之后，第II型胶原蛋白的片段(切割的胶原蛋白)释放于循环中，且随后分泌于尿中。软骨更新之后形成新骨。可量测的骨形成的骨特异性生物标记为第I型原胶原的N端前肽(PINP)。因为第I型胶原蛋白为骨基质中的主要有机组分，所以第I型胶原蛋白的合成为骨形成中的重要步骤。在胶原蛋白合成期间，前肽自原胶原分子释放且可在血清中检测到。另外，可量测第I型胶原蛋白的片段作为骨吸收标记。软骨及骨形成及生长的其它可能生物标记包括聚集蛋白聚糖硫酸软骨素(软骨更新的软骨特异性标记)、第II型胶原蛋白的前肽(软骨形成的软骨特异性标记)、碱性磷酸酶(骨特异性)及骨钙化素(骨形成的骨特异性标记)。可使用市售试剂盒，例如在来自功效/药效学活体内研究及来自离体研究的条件培养基的血清中量测软骨及骨相关生物标记。在一实施例中，在已给予CNP变体的个体中分析或量测至少一种骨或软骨相关生物标记的含量以监测CNP变体在活体内对骨及软骨形成及生长的作用。举例而言，至少一种骨或软骨相关生物标记的含量增加可表明给予CNP变体对骨生长具有积极作用且为适用于与CNP活性降低相关的骨骼发育不良及其它骨或软骨相关疾病或病症的治疗。例示性骨或软骨相关生物标记包括(但不限于):CNP(例如内源性含量的CNP)、cGMP、第II型胶原蛋白的前肽及其片段、第II型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、第 I型原胶原的前肽(PINP)及其片段、第I型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。在一实施例中，通过自将给予、正给予或已给予CNP变体的个体获得生物样品来量测生物标记。可使用此项技术中已知的技术来量测生物标记，这些技术包括(但不限于) 蛋白质印迹分析(Western Blot)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)及酶活性分析法。生物样品可为血液、血清、尿液或其它生物流体。本文的其它态样及细节将自以下实例显而易见，这些实例意欲说明而不具限制性。实施例实例1CNP变体的合成使用本文所述的方法制备CNP变体。在CNP22的野生型序列的各别氨基酸残基处，以天然或非天然氨基酸或肽模拟物进行取代，如表1_3(展示于实施例3中)中所示。在某些变体中，将额外氨基酸添加至完整野生型CNP22序列或野生型CNP22序列的一部分的N 末端及/或C末端(参看表3)。亦制备PEG (或ΡΕ0)部分偶联至CNP22或其变体的N端的CNP变体(参看实施例 3中所示的表4)。聚乙二醇化试剂可获自表5中所示的商业来源。表 5—丧货商产品名称名称MW(Da)聚乙二醇化试剂
Sunbright~^pfg90k ~CH3(CH2CH20)450-(CH2)5
N0F ME-200CSmPEG20K20，_ COO-NHS
SunbrightmPFG,K,000 CH3(CH2CH20)110-(CH2)5
N0F ME-050CSmPEG5K5，_ COO-NHS
(甲基-PEG12)[CH3(CH2CH20)12]3-(CH2
Pierce 3-PEG4-NHS； ^^' J2,400 CH20)4-NHC0(CH2)3-C00
酯3棚4-NHS
SunbrightmPFG2K2 000 CH3(CH2CH20)45-(CH2)5C
N0F ME-020HSmPEG2K2，000 00_NHS
SunbrightniPFG2K2 non CH3(CH2CH20)45-(CH2)5C
N0F ME-020CSmPEG2K2'000 OO-NHS
SunbrightmPFr,1K! nnn CH3(CH2CH20)23-C0(CH2)
NOF ME-OlOHSmPEG1K1^00 2COO-NHS
甲某
TV Z^A XTTTC广、…,ΟΠΛ CH3(CH2CH20)24-(CH2)2C
Pierce PEG24-NHSMS(PEG)241,200 ‘ v ’
酯
EZ连接的ρρ012φ物生物素
Pierce NHS-PEG12-^ J940 -(CH2CH20)12-(CH2)2C00-
生物素胃 NHS
Pierce Pmi2-NHSMS(PEG)12690 =^2Oi2O) G(Oi2)I
酉旨
EZ连接的生物素
Pierce NHS-PEG4-生PE04-生物素 590 -(CH2CH20)4-(CH2)2C0〇-物素 NHS 单(乳糖基酰
Pierce 氨基)LSS590
_单(丁二酰亚_
权利要求
1. 一种C型利钠肽(CNP)的变体，其系选自由以下组成的群GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO:146)；RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO:147)；VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50) (SEQ ID NO:148)；DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO :149)； TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO :150)； KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO 151)； SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO :152)； RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO :153)； AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO :154)； AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO :155)； WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO :156)； ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMS GLGC(CNP-41)(SEQ ID NO :157)； RLLQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO :158)； LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO :159)； LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO :160)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO 161)； HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO :162)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34) (SEQ ID NO 163)； NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO :164)； ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO :165)； RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO :166)； KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO :167)； YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO :168)； KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO :169)； GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO :170)； ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO :171)；NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO :172)； KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO :173)； KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO :174)； LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO :175)； SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO :176)； KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO :177)； GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO :178)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)]； PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)； MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP 27)(SEQ ID NO :193)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)] (SEQ ID NO :184)； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R)](SEQ ID NO :189)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4, 5,9R)](SEQ ID NO :194)； PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEG1K-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PEGlK-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEGlK-Pro-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :189)； PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Met-CNP27(K4,5,9R) ](SEQ ID NO :194)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE012-CNP27 (K4,5,9R, M22N) ] (SEQ ID NO :184)； PE012-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Pro-CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :189)； PE012-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE012-Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO :194)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :36)； PE024-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PE024-CNP27(K4,5,9R,M22N)](SEQ ID NO :184)； PE024-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Pro-CNP27(K4, 5, 9R) ](SEQ ID NO 189)；及PE024-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PE024-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO :194)。
2.一种医药组合物，其包含CNP变体，及医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
3.如权利要求2所述的组合物，其为冻干制剂。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述冻干制剂是用包含pH值为约4至约6的缓冲液的制剂制备的。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述缓冲液是柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液或乙酸/ 乙酸盐缓冲液。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其中该冻干制剂用进一步包含等张调节剂或膨胀剂的制剂制备。
7.如权利要求6所述的组合物，其中等张调节剂或膨胀剂选自甘露醇、蔗糖、山梨醇及其组合。
8.如权利要求4-7任一所述的组合物，其中该冻干制剂用进一步包含抗氧化剂的制剂制备。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述抗氧化剂选自甲硫氨酸、抗坏血酸、抗坏血酸的盐形式、硫甘油及其组合。
10.如权利要求2-9任一所述的组合物，其中该CNP变体是权利要求1所述的CNP变体。
11.一种如权利要求1所述的CNP变体或如权利要求2-10任一所述的药物组合物，用于治疗选自骨关节炎、低磷酸盐血症性佝偻病、软骨发育不全、软骨发育低下、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不全、致死性软骨发育不全、成骨不全、软骨成长不全、斑点状软骨发育异常、同型合子软骨发育不全、斑点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死性低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨发育低下、肢根型斑点状软骨发育异常、詹森型干骺端发育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia), 先天性椎体骨飯结构不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita)、骨发育不全症 (atelosteogenesis)、骨畸形性发育不良(diastrophic dysplasia)、先天性短股骨、朗格型肢中部发育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部发育不良 (Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、罗比接综合征(Robinow syndrome)、莱茵哈特综合征(Reinhardt syndrome)、肢端发育不全(acrodysostosis)、周围性骨发育不全、克尼斯特发育不良(Kniest dysplasia)、纤维软骨发生(f ibrochondrogenesis)、罗伯茨综合征(Roberts syndrome)、肢端肢中发育不全(acromesomelic dysplasia)、短肢畸形、莫基奥综合征(Morquio syndrome)、克尼斯特综合征(Kniest syndrome)、后生营养性发育不良 (metatrophic dysplasia) ^Wffi^FtliJiM^W^· E^ (spondyloepimetaphyseal dysplasia) 的骨相关病症或骨骼发育不良。
12.如权利要求11所述的CNP变体或药物组合物，其中该骨相关病症或骨骼发育不良为软骨发育不全。
13.一种如权利要求1所述的CNP变体或如权利要求2-10任一所述的药物组合物，用于治疗选自高血压、再狭窄、动脉硬化、急性代偿失调性心脏衰竭、充血性心脏衰竭、心原性水肿、肾水肿、肝原性水肿、急性肾功能不全及慢性肾功能不全的血管平滑肌病症。
14.一种重组产生CNP变体的方法，其包括使包含编码CNP变体多肽的第一多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的第二多核苷酸的宿主细胞，在培养基中，在可以让所述多核苷酸编码的融合多肽表达的条件下培养，其中该融合多肽包含该CNP变体多肽直接连接至该可切割肽或蛋白质或经由接头与其间接连接。
15.如权利要求14的方法，其中该宿主细胞经表达载体转化，该表达载体包含编码该 CNP变体多肽的多核苷酸连接至编码该可切割肽或蛋白质的该多核苷酸。
16.如权利要求14或15的方法，其中使用异丙基β-D-l-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)-诱导型载体来增强编码该融合多肽的该多核苷酸的表达。
17.如权利要求16所述的方法，其中在约20°C至约40°C的温度下，在约0.4mM至约 1.5mM IPTG存在下培养该宿主细胞一段时间。
18.如权利要求15-17任一所述的方法，其中该载体为质体。
19.如权利要求18的方法，其中该质体选自pjexpress、pjexpress401、 pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pMAL_c2X、 pQE-30、pET-SUMO及 pTYB11。
20.如权利要求14-19任一所述的方法，其中该可切割肽或蛋白质选自组胺酸标签、人类转录因子TAF12、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12 (C/ A)、TAF12 (D/E)、TAF12 (4D/4E)、TAF12 (6D/6E)、TAF12 (10D/10E)、TAF12 (C/A 及 D/E)、 TAF12(C/A 及 4D/4E)、TAF12 (C/A 及 6D/6E)、TAF12(C/A 及 10D/10E)、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域、BMP-2、 ΒΜΡ-2突变体、BMP-2 (C/A)，及其突变体及片段。
21.如权利要求20所述的方法，其中该可切割肽或蛋白质选自人类转录因子TAF12、 TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12 (C/A), TAF12 (D/E), TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A 及 D/E)、TAF12(C/A 及 4D/4E)、 TAF12 (C/A 及 6D/6E)及 TAF12 (C/A 及 10D/10E)。
22.如权利要求14-21任一所述的方法，其中用切割剂切割所述可切割肽或蛋白。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述切割剂选自甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割、因子叙、肠激酶、ProTEV和SUMO蛋白酶。
24.如权利要求14-23任一所述的方法，其特征在于，该宿主细胞为细菌。
25.如权利要求M的方法，其中该细菌宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。
26.如权利要求25所述的方法，其中该大肠杆菌细胞选自BL21、BL21(DE3)、 BL21 (DE3)pLysS、BL21 (DE3) pGro7、ArcticExpress (DE3)、C41 (DE3)、C43 (DE3)、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX 及 Tuner(DE3)。
27.如权利要求沈所述的方法，其中该大肠杆菌细胞为BL21(DE3)。
28.如权利要求14-27任一所述的方法，其中该融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。
29.如权利要求14- 任一所述的方法，其进一步包含自该宿主细胞或培养基分离该所表达的融合多肽。
30.如权利要求四所述的方法，其进一步包含使该经分离的融合多肽与选自由以下组成的群的切割剂接触甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割、因子)Ca、肠激酶、ftx)TEV 及SUMO蛋白酶。
31.如权利要求30所述的方法，其中该切割剂为甲酸。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中在约至约10%甲酸存在下，在约50°C至约70°C的温度下，由该经分离的融合多肽与切割剂接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中在甲酸存在下，进行该接触约5小时至约36小时。
34.如权利要求14-33任一所述的方法，其产生选自由以下组成的群的CNP变体R-CNP22 (K4R)(类似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；ER-CNP22 (K4R)(类似物 ΒΑ) (SEQ ID NO :39)； GANPR-CNP22 (K4R)(类似物 Cl) (SEQ ID NO 37)； GANQQ-CNP22 (K4R)(类似物 CH) (SEQ ID NO 69)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (类似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (类似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (类似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (类似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (类似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (类似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (类似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (类似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (类似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHS SGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(类似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物 CD) (SEQ ID NO :68)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)] (SEQ ID NO :184)； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :189)； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4, 5,9R) ](SEQ ID NO :194)； GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)； GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)； PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)；及 MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27) (SEQ ID NO :193)。
35.如权利要求14-34任一所述的方法，其不产生CNP-22或CNP-53。
36.一种根据如权利要求14-33任一所述的方法产生的CNP变体，其中该CNP变体选自R-CNP22 (K4R)(类似物 AZ) (SEQ ID NO 41)； ER-CNP22 (K4R)(类似物 BA) (SEQ ID NO 39)； GANPR-CNP22 (K4R)(类似物 Cl) (SEQ ID NO 37)； GANQQ-CNP22 (K4R)(类似物 CH) (SEQ ID NO 69)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (类似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (类似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (类似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (类似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (类似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (类似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (类似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (类似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (类似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(类似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物 CD) (SEQ ID NO :68)； PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4,5,9R)](SEQ ID NO :36)； GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4, 5，9R，M22N)]； PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4, 5，9R)]； MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met_CNP27(K4, 5，9R)]；GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSM SGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 180)；QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO :60)； QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO :182)； PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO :186)； MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO :192)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO :75)； GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO 181)； PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO :145)； MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO 191)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO :144)；GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO :183)；PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :188)；及MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO :193)。
37.一种包含表达载体的宿主细胞，该载体包含编码CNP变体多肽的第一多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的第二多核苷酸。
38.如权利要求37的宿主细胞，其中该可切割肽或蛋白质选自组胺酸标签、人类转录因子TAF12、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12(C/A)、 TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(1OD/10E)、TAF12(C/A 及 D/E)、TAF12(C/ A及4D/4E)、TAF12 (C/A及6D/6E)、TAF12 (C/A及10D/10E)、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-2突变体、BMP-2 (C/A)，及其突变体及片段。
39.如权利要求37或38所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌。
40.如权利要求39所述的宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是大肠杆菌。
41.如权利要求40的宿主细胞，其中所述大肠杆菌选自BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS、BL21 (DE3)pGro7、ArcticExpress (DE3)、C41 (DE3)、C43 (DE3)、Origami B (DE3)、 Origami B(DE3)pLysS、KRX 及 Tuner(DE3)。
42.如权利要求41所述的宿主细胞，其中所述大肠杆菌是BL21(DE3)。
43.如权利要求37-42任一所述的宿主细胞，其中所述载体是质粒。
44.如权利要求43的宿主细胞，其中所述质粒选自pJeXpreSS、pJeXpreSS401、 pjexpress404、pET_15b、pET_21a、pET_22b、pET_31b、pET_32a、pET_41a、pMAL、pMAL_c2X、 pQE-30、pET-SUMO及 pTYBll。
45.如权利要求37-44任一所述的宿主细胞，其中在细胞培养前用载体转化宿主细胞。
46.如权利要求37-45任一所述的宿主细胞，其中在适于表达由所述多核苷酸编码的融合多肽的条件下，于培养基中培养该宿主细胞，其中该融合多肽包含该CNP变体多肽直接连接至该可切割肽或蛋白质或经由接头与其间接连接。
47.如权利要求46的宿主细胞，其中该融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中从该宿主细胞或培养基分离该所表达的融合多肽。
49.如权利要求48所述的宿主细胞，其中使该经分离的融合多肽与选自由以下组成的群的切割剂接触甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割、因子fe、肠激酶、ftx)TEV及 SUMO蛋白酶。
50.如权利要求37-49任一所述的宿主细胞，其中该CNP变体多肽不是CNP-22或 CNP-53。
51.一种评估CNP肽或变体对个体中至少一种骨或软骨相关生物标记含量的影响的方法，其包括分析来自已给予CNP肽或变体的个体的生物样品中至少一种骨或软骨相关生物标记的该含量。
52.如权利要求51的方法，其进一步包含对该个体给予该CNP肽或变体，随后分析该至少一种骨或软骨相关生物标记的该含量。
53.一种治疗CNP反应性病状或病症的方法，其包括对个体给予CNP肽或变体，及监测该个体中至少一种骨或软骨相关生物标记的含量，其中该至少一种骨或软骨相关生物标记的该含量增加，表示该CNP肽或变体对该个体或该病状或病症具有治疗作用。
54.如权利要求53所述的方法，其进一步包括调整该CNP肽或变体的给药量或给药频率，其中i)若所述至少一种骨或软骨相关生物标记的所述含量低于目标含量，则增加该CNP肽或变体的给药量或给药频率；或 )若所述至少一种骨或软骨相关生物标记的所述含量高于目标含量，则降低所述 CNP肽或变体的给药量或给药频率。
55.如权利要求51-M任一所述的方法，其中所述至少一种骨或软骨相关生物标记选自CNP、cGMP、II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、1型原胶原的前肽(PINP)及其片段、I型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。
56.如权利要求51-55任一所述的方法，其中所述CNP肽或变体选自 R-CNP22 (K4R)(类似物 AZ) (SEQ ID NO 41)；GANRR-CNP22 (K4R)(类似物 AY) (SEQ ID NO 36)； AAWARLLQEHPNA-CNP22 (类似物 CA) (SEQ ID NO 61)； AAWARLLQEHPNAR-CNP22 (类似物 CB) (SEQ ID NO 62)； DLRVDTKSRAAWAR-CNP22 (类似物 CC) (SEQ ID NO 63)； GQPREPQVYTLPPS-CNP22 (类似物 CF) (SEQ ID NO 79)； GERAFKAWAVARLSQ-CNP22 (类似物 CE) (SEQ ID NO 81)； GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22 (类似物 CQ) (SEQ ID NO 76)； GQEHPNARIWKGANPK-CNP22 (类似物 CS) (SEQ ID NO 71)； GQEHPNARIWKGANQK-CNP22 (类似物 CT) (SEQ ID NO :130)； GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22 (类似物 CR) (SEQ ID NO 77)； GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22 (K4R)(类似物 CN) (SEQ ID NO 87)； SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物 CD) (SEQ ID NO :68)；GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO 179)；PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53) (SEQ ID NO 185)；MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO 190)；DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO 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57.如权利要求56所述的方法，其中所述CNP肽或变体不是CNP-22或CNP-53。
全文摘要
本申请公开文本提供一种C型利钠肽(CNP)的变体、包含CNP变体的医药组合物，及制造CNP变体的方法。这些CNP变体适用于治疗CNP反应性疾病的治疗剂，这些疾病包括(但不限于)骨相关病症，诸如骨骼发育不良(例如软骨发育不全)，及血管平滑肌病症(例如再狭窄及动脉硬化)。
文档编号G01N33/53GK102481330SQ201080023189
公开日2012年5月30日申请日期2010年5月20日优先权日2009年5月20日
发明者A·O·奥克哈马菲, C·P·普赖斯, D·J·文特, M·C·维拉德, S·卡斯蒂略, 美佳·青柳-史考伯, 龙世农申请人:生物马林药物股份有限公司

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
技术研发人员：D·J·文特;美佳·青柳-史考伯;龙世农;M·C·维拉德;S·卡斯蒂略;A·O·奥克哈马菲;C·P·普赖斯
技术所有人：生物马林药物股份有限公司
我是此专利的发明人

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