专利名称：编码氨基肽醇的重组体dna分子及其在制备抗蠕虫感染疫苗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用重组体技术制备保护抗原以用作在控制由蠕虫寄生虫引起的疾病中的抗蠕虫剂和保护免疫原。
蠕虫寄生虫引起广范围的疾病，并且对家畜的侵染(当其发生时会导致减少产率，甚至动物死亡)具有重大的经济意义。因此，例如摄血线虫Haemonchus(血矛属)感染反刍动物的胃肠器官系统内衬，造成贫血和重量减轻，如果不治疗，常常导致死亡。类似地被相关非摄血线虫Ostertagia(奥氏属)感染的动物不能茁壮成长，如不治疗可能死亡。其他属有重要经济意义的蠕虫包括Trichostrongylus(毛圆属)和Nematodirus(细颈属)(它们在各种动物中引起肠炎)以及吸虫。
由诸如钩虫(例如Necator(板口属)，Ancylostoma(钩口属)Uncinaria(钩虫属)和Bunostomum(仰口线虫属)等种属)和吸虫(例如Fascipla(片形属)，Paramphistomum(同盘属)及Dicrocoelium(双腔属))及其亲缘种属这样的线虫也会引起麻烦，它们除对反刍动物和家养观赏动物外，还感染人类，经常导致毁灭性的结果。
当前对蠕虫寄生虫的控制主要依靠使用结合放牧管理的抗蠕虫药物。然而，这些方法有一系列缺点，即经常服用药物和放牧管理往往不能实践应用，抗药蠕虫种属普遍地愈益增加。
因而在这一领域需要一种有效的抗蠕虫疫苗并且近年来在该领域已集中做了许多努力。但是，至今尚没有对主要蠕虫种属，特别是对反刍动物胃肠线虫，如Haemonchus和Ostertagia的市场上可得到的分子或亚单位疫苗。
用由Haemonchus分离的新型蛋白得到了迄今最有希望的结果，它们作为保护抗原不仅具有抗Haemonchus，而且具有抗其他范围蠕虫的潜力，特别是在H.contortus肠腔表面发现的蛋白质成对物H11OD显示了具有在绵羊中抗haemonchosis(血矛线虫病)的保护免疫性。
如由SDS-PAGE所确定的，并且在WO88/00835和WO90/11086中所公开的，来自H.contortus的H11OD在还原或非还原条件下具有近似分子量为1104道尔顿(Kd)。本文所用的术语“H110D”是指WO88/00835和WO90/11086中所定义的蛋白质成对物H110D。最近，在其他蠕虫种属，例如Necator americanus中也显示了相应的蛋白质。
在WO88/00835中已公开了一系列纯化H110D的方法，它们足以表征该蛋白质，并可以按比例增加使能以实验和商业上的有用量制备该蛋白质。然而，需要一种改进的和方便的来源，由该来源不仅制备H110D，而且也制备相关的抗原蛋白质，特别需要一种基于重组体DNA技术和在适当地转换的原核或真核有机体中表达这些蛋白质的方法。
本发明力求提供这样一种改进的工艺。已进行了对来自Haemonchus contortus的H110D的cDNA的序列测定并已发现预测的氨基酸序列呈现出与一族整合膜氨基肽酶(系统名称α-氨基酰肽水解酶(微粒体))同源。
哺乳动物的整合膜氨基肽酶位于某些组织中，例如在肠的微绒毛刷状缘，和肾上。它们在肾中的作用尚不清楚，但在肠中，它们的功能是分解作为消化的最终产物的小肽(为检查参见Kenny & Maroux，1982;Kenny & Turner，1987;Noren et al.，1986;Semenza，1986)。
从而，本发明的一个方面提供了核酸分子，这些分子含有一种或多种编码基本上相应于图2，3，4或5中所示全部或一部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)的蠕虫氨基肽酶或其抗原部分的核苷酸序列或基本上与任意所述序列同源或杂交的蠕虫氨基肽酶编码序列。
因而，本发明的核酸可以是单或双链DNA，cDNA或RNA。
在种之间的不同品系蠕虫之间，在蠕虫生活周期的不同阶段之间(例如，在幼虫和成虫阶段)，在不同地区来源的相似品系之间，以及在相同蠕虫内均可以产生氨基肽酶编码核苷酸序列的变异。这些变异也包括在本发明的范围之内。
本文所用的“基本上同源”包括这样的序列，它们具有约50%或更多，例如60%或更多的序列等同性，以及还有功能上等同的等位变异体以及被单或多碱基替换、附加和/或缺失所修饰的有关序列。“功能上等同”是指这样的核酸序列，它们编码具有类似免疫反应的(即产生抗蠕虫的宿主保护抗体)氨基肽酶活性的多肽。
与图2，3，4或5所示的序列(由SEQ ID NOS1-15组成)或上述定义的任意基本上同源或功能上等同的序列杂交的核酸分子也包括在本发明的范围内。本文所用的“杂交”定义为在无强度条件下(室温下6×SSC/50%甲酰胺)结合并在低强度条件下(2×SSC，室温，更佳为2×SSC，42℃)或较高强度条件下，例如2×SSC，65℃洗涤的那些序列(此处SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，PH7.2)。
例如，通过位点取向诱变，随机诱变，或酶分裂和/或连接核酸制备这些衍生物相关序列的方法，如同例如通过杂交测定这样修饰的核酸是否与主题序列显著同源的方法一样在现有技术中是公知的。
因而，本发明提供的核酸分子能够使以迄今不能获得的量制得重组体氨基肽酶，或其致免疫片段，从而可以开发抗蠕虫疫苗。
这样，本发明的另一方面，提供了核酸分子，它们含有一种或多种编码一种或多种能产生抗蠕虫寄生虫保护抗体的多肽的核苷酸序列，这些序列结合一个或多个来自如图2，3，4或5中所示氨基肽酶编码序列(由SEQ ID NOS1-15组成)的抗原决定基编码区。
本发明也提供了合成多肽，它们包括基本上相应于图2，3，4或5所示之全部或一部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)构成一种氨基肽酶或其抗原部分的一种或多种氨基酸序列，或除相应于蛋白质成对物H110D的合成多肽，或其相应于任意WO90/11086中所公开的各个多肽序列的合成多肽以外的一种功能上等同的变异体。
另一方面观察，本发明也提供了合成多肽，它们包括基本上相应于图2，3，4或5中所示全部或一部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)构成一种氨基肽酶或其抗原部分的一种氨基酸序列或其基本上没有其他Haemonchus contortus组分的功能上等同的变异体。
本发明还提供了刺激人体或非人类动物中抗蠕虫寄生虫免疫应答的疫苗组合物，该组合物含有至少一种上面定义的合成多肽，同时含有可药用的载体。
WO90/11086公开了一系列通过蛋白水解消化或化学裂解蛋白质成对物H110D而得到的多肽或部分多肽序列，列出如下(a) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu GluPhe(b) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser(c) Met Gly/Phe Asn Phe Lys Ile Glu/Val Thr/GluAla Gly(d) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Lys Asp/Ala Thr/LysLeu - Ile Thr(e) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe Val(f) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val(g) Met Gly Phe Pro Leu Val Thr Val Glu AlaPhe Tyr(h) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu GlnAla Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro(i) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala GluAsn/Leu Leu Asn/Gly(j) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn(k) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp -Ile - - - Lys Gly(l) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala PheAsp Asp Ile Thr Tyr - - Gly Pro Ser(m) Lys - Glu Glu Thr Glu Ile Phe Asn Met(n) Lys - - - Pro Phe Asn/Asp Ile Glu AlaLeu(o) Asp Gln Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys(p) Met Gly Tyr Pro Val Val Lys Val Glu GluPhe -Ala Thr Ala Leu(q) Met Gly Phe Pro Val Leu Thr Val Glu Ser -Tyr - Thr(r) Met Glu/Phe Asn Phe Leu Ile Glu/Val Thr/GluAla Gly - Ile Thr(s) Met Gly Phe Leu Val Thr Val Glu Ala PheTyr - Thr Ser
(t) Met Lys Thr Pro Glu Phe Ala Val/Leu GlnAla Phe/Thr Ala Thr Ser/Gly Phe Pro(u) Met Lys Pro/Glu Thr/Val Leu Asp/Ala Thr/LysLeu - Ile Thr - Gly(v) Met Leu Ala Leu Asp Tyr His Ser - Phe ValGly (w) Met Leu Ala Glu/Tyr Asp Gln/Ala Glu Asp Val(x) Lys His/Tyr Asn/Val Ser Pro Ala Ala GluAsn/Leu Leu Asn/Gly(y) Lys - Thr Ser Val Ala Glu Ala Phe Asn(z) Lys Ala Ala Glu Val Ala Glu Ala Phe Asp -Ile - - - Lys Gly(aa) Lys Ala Val Glu Val/Pro Ala Glu Ala PheAsp Asp Ile Thr Tyr - - Gly Pro Ser(bb) Lys - Glu Gln Thr Glu Ile Phe Asn Met(cc) Lys - - - Pro Phe Asn/Asp Ile GluAla Leu(dd) Asp Gln Ala Phe Ser Thr Asp Ala Lys或是由Phe/Gly形式，其中前三个字码代表基于信号强度最可能正确的氨基酸，或是由问号表示出不确定因素;符号“-”表示未知残基。
在WO09/11086中分开的特定单个氨基酸序列不要求保护。
本文所用术语“多肽”包括全长蛋白，以及短肽序列两者。
以上有关多肽氨基酸序列所用的“功能上等同”定义的多肽涉及或衍生于上述多肽序列，这些序列中的氨基酸序列已被单或多个氨基酸取代、附加或缺失而修饰，以及还涉及或衍生于那些其中氨基酸已被化学修饰，包括糖基化或脱糖基化，但它们仍保持保护抗原(免疫原)活性的序列。这些功能上等同的变异体可以作为天然生物变异产生或可以利用已知技术制备，例如可以利用位点取向诱变、随机诱变、或酶分裂和/或氨基酸连接的已知技术制备功能上等同的重组体多肽。
通常本发明的合成多肽代表了保护抗原序列。本文所用的术语“保护抗原”定义能够产生宿主保护(免疫原)免疫应答，即通过宿主导致产生免疫效应物、抗体或不能繁殖的，破坏、抑制或杀死寄生虫的细胞并从而保护宿主免受临床或无症状的疾病并避免减少繁殖力的应答。这样一种保护免疫应答可以通过产生能抑制寄生虫代谢功能的抗体，导致发育障碍，产卵不足和/或死亡而普遍显示出来。
本发明这一方面的合成多肽可通过在宿主细胞中表达来制备，该宿主细胞含有具有大致上如上所述操作连接于一表达控制序列的核苷酸序列的重组体DNA分子或含有具有这种重组体DNA分子的重组体DNA克隆媒介或载体。换言之，这些多肽可通过将本发明的裸露的DNA分子直接注入宿主细胞中而被表达。
这样表达的合成多肽可以是一种含有显示全部或一部分氨基肽酶免疫原性部分的融合多肽以及一种用融合于其中的重组体分子DNA编码的附加多肽。例如，制备一种融合蛋白，该蛋白包含与如β-半乳糖苷酶、磷酸酶、谷胱甘肽-S-转移酶、脲酶、乙型肝炎核心抗原(Francis et al.，1989)等的一种蛋白偶联的本发明的合成氨基肽酶或其他多肽，可能是合乎要求的。大多数融合蛋白是通过表达其中两种编码序列已与相中解读密码连接在一起的重组体基因而形成。另一方面，多肽可通过化学手段离体连接。本发明包括了所有这些氨基肽酶编码核酸分子和其分别的氨基酸序列的融合或杂交衍生物。这些合适的重组体DNA和多肽表达技术公开在例如Sambrook et al.，1989中。另一方面，合成多肽可以通过化学手段制备，如公知的Merrifield固相合成工艺。
本发明的另一方面包括使用如上所定义的核酸分子或合成肽或多肽，以制备刺激人体或非人类，较佳的哺乳动物中抗蠕虫寄生虫感染免疫应答的疫苗组合物。
另一方面考虑，本发明还提供了一种刺激人体或非人类，较佳是哺乳动物中抗蠕虫寄生虫感染的免疫应答的方法，该方法包括给所述动物施用一种含有一种或多种被如上所述核苷酸序列编码的多肽的疫苗组合物。
按照本发明，疫苗组合物可以通过疫苗生产的现有技术中公知的方法制备。传统的疫苗配方可以含有一种或多种本发明的合成多肽，合适时同时含有一种或多种适宜的佐剂，例如氢氧化铝、皂草苷、QuilA、或其更纯的形式，胞壁酰二肽、矿物油、或Novasomes，同时有一种或多种可药用的载体或稀释剂。合适的载体包括液体介质，如适于用作将肽或多肽引入患者的媒介的盐水溶液。可以包括另外的组分，如防腐剂。
另一种疫苗配方可以含有一种病毒或宿主细胞，例如在其中已插入本发明核酸分子(例如DNA分子)的一种微生物(例如，牛痘病毒、腺病毒、沙门氏菌属(Salmonella))以刺激直接对由插入的核酸分子所编码的多肽的免疫应答。
疫苗组合物的施用可以通过任意常规的方法进行，例如口服或肠胃外，如通过肌肉注射给药，任选地每隔一段时间，例如在7-28日间隔中二次注射。
如上所述，在图2，3，4或5中所描绘的核苷酸序列的氨基酸的转译显示了与一族整合膜氨基肽酶序列同源，这可通过利用图2，3，4或5中所示的序列转译，检索基因计算机组序列(GeneticsComputer Group Sequence)分析软件包(1991年11月文本7.01(Devereux et al.，1984))中可得到的各种数据而被测定。二种这样的比较示于图6。
利用一系列已知的技术和表达体系，包括在原核细胞，(如大肠杆菌(E.coli))和在真核细胞(如酵母)或杆状病毒-昆虫细胞系或在转化哺乳动物细胞中以及在转基因的动物和植物中表达，可以完成如上所述的本发明氨基肽酶编码序列的表达。特别有利的是，可以利用转基因的线虫系，如在Fire，(1986);Fire et al.，(1989);Spieth et al.，(1988);Han et al.，(1990)中所述的线虫Caenorhabditis系表达该核苷酸序列。
本发明的又一方面提供了一种制备如上所述的合成多肽的方法，该方法包括培养含有上述核酸分子的真核和原核细胞，在此条件下表达所述的多肽，并回收这样制得的所述多肽。
因而，本发明的再一方面包括了含有本发明核苷酸序列的克隆和表达载体。这些表达载体包括合适的控制序列，例如在与本发明核酸分子匹配的读码中连接的转译(例如起始和终止密码)和转录控制要素(例如，启动子-操纵基因区域、核蛋白体结合位点、末端终止序列)。
本发明的载体可以包括现有技术中公知的和文献记载的技术中的质粒和病毒(包括噬菌体病毒和真核病毒两者)，并可以在许多不同的表达体系中表达，这也是在现有技术中公知和文献记载的。如上所述的合适的病毒载体包括杆状病毒属以及还有腺病毒和牛痘病毒。在现有技术公开有许多其他病毒载体。
已知有许多技术并可以用于将这些载体引入表达的原核或真核细胞中，或引入种系或体细胞中以形成转基因的动物。在文献中充分公开了适当的转化或转染技术。
含有上述本发明核酸分子的转化或转染真核或原核宿主细胞或转基因生物体构成了本发明的又一方面。
通常真核表达体系，特别是线虫表达体系具有这样的优点，能进行转译后处理，尤其是在转基因线虫体系的情况下能发生糖基化作用，可以期待有相应于在天然蛋白中发现的糖基化作用。这代表本发明的一个重要方面，因为在许多场合对重组体蛋白来说需要转译后处理，以表达最佳生物活性。
哺乳动物细胞表达体系也具有一系列优点。哺乳动物宿主细胞能提供抗原的天然形式和保护性抗原决定基的良好再生性，因为真核表达体系导致比可以产生需要重折叠并具有不良再生性天然形式的不溶性蛋白的E.coli更为相似的糖基化模式、二硫化物结合和其他转译后修饰。此外，哺乳动物的糖基化不大可能会诱导由保护抗蛋白应答分散出的免疫应答。从而，为了保护人类和家畜，较佳的是使用人类或动物成纤维细胞或骨髓细胞系，如HeLa-一种人类细胞系;BHK-幼仓鼠肾细胞;VERO，一种猴肾细胞系;FR3T3，Fisher大鼠成纤维细胞;NIH3T3，一种小鼠成纤维细胞系;C127I，一种小鼠乳汁肿瘤细胞系;CV-1，非洲绿猴肾成纤维细胞;3T6，小鼠胚胎成纤维细胞;L细胞，一种小鼠细胞系;CHO，一种中国仓鼠卵巢细胞系;NOS NSI，SP2和其他小鼠骨髓瘤细胞系和大鼠骨髓瘤细胞系，如YB2/0和Y3。
适用于不同种类哺乳动物细胞系的载体在现有技术中是公知的。通常这些载体包含可操作连接于编码抗原或其片段的核苷酸序列的启动子和/或强化因子。合适的启动子包括CV40早期或晚期启动子，例如PSVL载体、细胞肥大病毒(CMV)启动子、小鼠金属硫因I启动子和小鼠乳汁肿瘤病毒长末端重复。载体较佳是包括一种合适的标志，如二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合成酶的基因。这些类型的载体公开在WO86/05807，WO87/04462，WO89/01036和WO89/10404中。
可以使用标准技术，例如使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、Polybrene(C13H30Br2N2)x、原生质体融合、脂质体、直接微量注射、基因炮或电穿孔进行宿主细胞的转染。较佳的是后述的技术，利用电穿孔转染哺乳动物细胞系的方法为Andreason et al.，1980，所述。通常，线型DNA比环状DNA更易引入。
在蛋白H110D的情况下，已发现具有一种独特和异常的糖基化模式，这被认为有助于免疫活性，因为迄今由Haemonchus所得到的对H110D的许多单克隆抗体识别可能在发育有用的疫苗中是重要的糖类抗原决定基。
已经具体证实了如下由Haemonchus对H110D的糖基化模式ⅰ.约65%低聚糖为N-连接的，剩余部分为O-连接的;
ⅱ.N-连接的低聚糖的主要部分(例如约48%)为配位种类;
ⅲ.基本上全部(例如大于95%)低聚糖是不带电的;
ⅳ.组成的单糖相对摩尔含量为N-乙酰半乳糖胺1.0，岩藻糖3.6，半乳糖4.1，葡萄糖4.4，甘露糖6.2以及N-乙酰氨基葡糖5.2;
ⅴ.主要低聚糖(特定的低聚糖D)以外的低聚糖基本上是抗被广范围的外糖苷酶(例如，α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-D-木糖苷酶、β-D-N-乙酰氨基葡糖苷酶)所降解的。
这些低聚糖以及含有它们的糖蛋白构成了本发明的又一方面。
Haemonchus H110D糖蛋白的低聚糖D是N-连接类型并具有一种由被α-1，3键和α-1，2键连接到甘露糖(N-乙酰氨基葡萄糖)2核心上的二个岩藻糖残基组成的新结构。
从而，本发明的另一方面提供了如下结构的一种低聚糖
以及更具体的如下结构
特别是当连接到一个蛋白上，例如诸如蠕虫氨基肽酶或其抗原片段的重组体蛋白上时，或当用于产生特别是对非常年幼的动物免疫接种的抗个体基因型抗原时如此。
动物糖蛋白通常具有岩藻糖α-1，6键，而本发明低聚糖的岩藻糖α-1，3键是一种异常的特征。
现在具体参考Haemonchus contortus的蛋白H110D更详细地说明本发明。然而，通过许多技术，如组织化学和DNA杂交，已在其他寄生虫种属中观察到了H110D等同物。据认为，H110D蛋白是一种多基因复合物并且此外编码它的核苷酸序列可以显示蠕虫的不同品系和不同生活周期阶段之间的序列变异。此外，可以存在可在不同阶段，或在不同品系中区别表达的多酶形式(同功酶)。在本研究中，由cDNA克隆和通过自不同来源，并在H.contortus生活周期的不同寄生阶段的重组体DNA技术由相应于H110D基因的mRNA得到的PCR产物测定了DNA序列，并从而测定了预计的氨基酸序列。
cDNA和PCR产物的定序可以使我们能鉴别三种密切相关的H110D序列，本文将它们标示为H11-1(SEQ ID NO19)、H11-2(SEQ ID NO20)和H11-3(SEQ ID NO21)。H11-1包括三个连接的和重叠的序列，cDNA克隆AustB1(SEQ ID NO6)、PCR产物A-648(SEQ ID NO9)和在3′端的PCR产物014-178(SEQ ID NO12);H11-2包括PCR产物A-650和2.5kb(SEQ ID NOS分别为10和7);H11-3包括PCR产物3.5Kb和A-649(SEQ ID NOS分别为8和11)。单个定序的cDNA和PCR产物克隆以及H11-1、-2、和-3之间的特殊关系概括在
图1中并详细示于图3，4和5。
如具体由图2，3，4和5可见(包括SEQ ID NOS1-15和19-21)以及如表1中所概括的，已观察到由cDNA克隆和PCR产物得到的序列中的区别和变异。
表1通过转译图2所示核苷酸序列得到 推导氨基酸序列的同源现象。
%相似性 %同一性H11-1:H11-2 77 63H11-1:H11-3 79 65H11-2:H11-3 82 69可将这些区别归因于不同的mRNA(多基因属的)。此外，变异可能是由于，至少部分由于在不同的生活周期阶段或在地区来源不同的品系中存在的H110D编码序列或mRNA的不同变异体。
表2另外显示了在相应的预期氨基酸序列和二种公开的哺乳动物氨基肽酶序列之间同一性和相似性的程度。
表2.H110D氨基酸序列与大鼠氨基肽酶M(ApM)和小鼠氨基肽酶A(ApA)的同源现象。
%相似性 %同一性H11-1:ApM 55 32H11-1:ApA 55 31H11-2:ApM 52 31H11-2:ApA 54 31H11-3:ApM 53 32H11-3:ApA 52 30图1示出了定序的H.contortus H110D cDNA和PCR产物克隆及其关系和沿H110DmRNA的相对位置的染色体图谱。
图2示出了标示为H11-3(SEQ ID NO21，由克隆的PCR产物SEQ ID NOS8和11以及cDNA克隆MIAUS，SEQ ID NO5衍生)、H11-2(SEQ ID NO20，由克隆的PCR产物SEQ ID NO7和10衍生)以及H11-1(SEQ ID NO19，由克隆的PCR产物SEQ ID NOS9和12以及cDNA克隆AustB1，SEQ ID NO6衍生)的H110D核苷酸序列;
图3示出了有cDNA克隆M1和M1AUS(SEQ ID NOS1和5)顺序的序列H11-3(SEQ ID NO21)(示于图2);
图4示出了序列H11-2(SEQ ID NO20，示于图2)和cDNA克隆B2(SEQ ID NO4)顺序;
图5示出了标示为H11-1(SEQ ID NO19)的序列和cDNA B1A和Aust B1(SEQ ID NOS分别为2和6)的顺序;
图6示出了a)由图2所示DNA序列H11-1、H11-2和H11-3衍生的预测的氨基酸序列(SEQ ID NOS22，23和24);bⅰ)和bⅱ)分别示出了与大鼠微粒体氨基肽酶M(Watt et al.，1989)和小鼠微粒体氨基肽酶A(Wu et al.，1990)的公开的氨基酸序列比较的H11-3的预测的氨基酸序列;完全相同的被包围在方框中，破折号表示为使比较的序列之间最大程度等同而引入的空间。使用常规的氨基酸单字码。在序列上方的水平线指明了横跨膜区的位置而星号表示锌结合型(motif)的位置。相似的程度示于表1和2。
图7示出了由如前所述的H110D的CNBr和Lys-C片段(国际专利申请WO90/11086和如早先所分别列出的多肽序列(a)、(b)、(e)、(k)和(aa))得到的氨基酸序列顺序(标为PepA、PepB、PepC、PepD和PepE)以及三个在通过转译a)H11-1，b)H11-2和c)H11-3被弹性蛋白酶或嗜热菌蛋白酶消化后由H110D得到的新的序列(SEQ ID NOS16、17和18)。
在本发明的又一个方面中，还提供了包含一种或多种核酸序列的核酸分子，这些序列基本上相应于或基本上是互补于一种或多种选自下列的克隆序列M1、B1A、B1A-3′、B2、M1AUS、AustB1、014-015(2.5PCR)、014-872(3.5PCR克隆2)、A-648(B1的5′端)、A650(2.5PCR的5′端)、A-649(3.5PCR的5′端)、014-178(AustB1克隆2的3′端)、014-178(AustB1克隆3和6的3′端)、014-872(3.5PCR克隆10)和014-872(3.5PCR克隆19)、H11-1、H11-2和H11-3、SEQ ID NOS分别示于图2，3，4和5中的1-15及19-21、或基本上与任意所述序列同源或与任意所述序列杂交的序列。
如上所述，上述不同克隆序列与已知序列的计算机数据库对照，显示出与微粒体氨基肽酶族基本上同源(EC.3.4.11.-)。用H110D蛋白及其细馏分进行的酶活性和抑制因子研究证实了该蛋白实际上是微粒体氨基肽酶(α-氨酰基肽水解酶(微粒体))。这些研究还表明，显示了氨基肽酶A式和氨基肽酶M式两种活性，并且H110D成对物的每一种组分各自显示出酶活性。
也进行了对H110D蛋白水解消化的研究。利用弹性蛋白酶，发现H110D可以部分地分裂，形成两部分，洗涤剂可溶部分(属于膜)和水溶性部分(标示为H11S)。H11S以可以还原成两种组分的蛋白二聚物形式存在。有意义的是，发现了只有氨基肽酶M式活性与水溶性H11S部分有关，而氨基肽酶A式活性仅与洗涤剂可溶部分有关。
以下实施例，参照如下的另外附图，提供了得到示于图1-7中所示序列测定研究的详细说明图8示出了用由潜在的H110D克隆洗脱的亲合提纯抗体探测的在Haemonchus contortus成虫的洗涤剂提取物中存在的整合膜蛋白的Western印迹;a)由对该提取物的抗血清识别的Haemonchus洗涤剂提取物中的抗原;b)由如在a)中所示的对洗涤剂提取物的印迹重复试验的条纹洗脱的抗体证实了洗脱步骤的成绩;c)与表达蛋白的克隆M1结合的如b)中的抗体强烈地识别110kd区域(较尖锐的带位于约205Kd处);d)当使用非重组体以吸附血清时，没有抗体结合;
图9示出了由11，15和23天大的Haemonchus contortus提纯的mRNA的Northern印迹，该印迹用以下克隆探测得a)cDNA克隆M1(SEQ ID NO1);b)cDNA克隆M1 AUS(SEQ ID NO5);c)cDNA克隆B1A(SEQ ID NO2和3);d)cDNA克隆AustB1(SEQ ID NO6);e)克隆的PCR产物014-872(3.5-2，SEQ ID NO8);以及f)克隆的PCR产物014-015(SEQ ID NO7)。数字11，15和23表示由其中得到mRNA的Haemonchus的年龄;
图10示出了用cDNA克隆M1AUS(SEQ ID NO5)、B1A(SEQ ID NOS2和3)以及AustB1(SEQ ID NO6)和PCR产物014-872(3.5-2，SEQ ID NO8)及014-015(SEQ ID NO7)探测的Haemonchus contortus基因组DNA的Southern印迹;a)这些印迹以中等强度洗涤，b)这些印迹以高强度洗涤;对每次探测，轨迹1含有HindⅢ λDNA的消化液作为标志或呈空白，轨迹2和3分别含有Haemonchus基因组DNA的EcoRⅠ和HindⅢ的消化液;
图11示出了用对电泳提纯的H110D(H110DE)的亲合提纯抗体探测的重组体GST-M1和GST-B1A融合蛋白的Western印迹;
图12亦示出了用对ConA H110D和对重组体GST-M1和GST-B1A融合蛋白的抗血清探测的ConA H110D抗原的Western印迹;
图13示出了a)在ConA H110D于MonoQ柱上经离子交换色谱分离得到的馏分中分析H110D蛋白和氨基肽酶活性的结果;
b)图13a)中所示馏分的SDS-PAGE;
图14示出了a)在自由流动等电聚焦实验中获得馏分的PH值;
b)在还原14a)中馏分条件下的SDS-PAGE，该馏分的馏分6中发现H110D成对物的下带而在馏分16中发现上带，并在介中的馏分中具有不等量的各带;
c)用ⅰ)标为TS3/19.7的单克隆抗体及ⅱ)亲合提纯的多克隆抗M1抗体探测的14b)中所示馏分的Western印迹;对比抗体未给出可测出的反应;
图15示出了a)在另一自由流动等电聚集实验中得到馏分时的pH值;b)在还原来自酶分析中所用的15a)的馏分条件下的SDS-PAGE，该馏分中，在馏分4-6中发现H110D成对物的下带而在馏分16-18中发现上带，并在介中的馏分中具有不等量的各带;c)示于15b)中的馏分的微粒体氨基肽酶比活性;
图16示出了通过接种来自H110D的分离的上部(U)、下部(L)、重组的(U+L)和中间成对物(D)带对绵羊的保护;a)寄生虫卵的产量，以卵数/克粪便表示，b)相对于对比物的死后虫负荷;
图17示出了通过接种经用弹性蛋白酶和H11A(剩余的洗涤剂可溶的H110D)消化而由H110D得到的水溶性片段(H11S)对绵羊的保护。a)虫卵产量，以卵数/克粪便表示;b)相对于对比物c)死后虫负荷;
图18示出了通过接种了不同保护程度H110D的各个绵羊的血清表现的Aⅰ)、Bⅰ)氨基肽酶M式和Aⅱ)、Bⅱ)氨基肽酶A式之H110D活性抑制间的关系实例，该保护程度由Aⅰ、ⅱ)的死后虫负荷减少%和Bⅰ、ⅱ)的粪便卵数减少%测算;□表示抗H11OD，■表示抗马铁蛋白对比物;
图19示出了在成虫Haemonchus contortus中氨基肽酶活性的组织化学定位化-即Haemonchus contortus雌性成虫的冻结切片亮显微图显示了仅与肠(ⅰ)的微绒毛(mv)有关的氨基肽酶活性(在这些黑白照片中以暗带(标以箭头的)出现的红色反应产物)。无任何其他组织(例如，表皮(c)、下皮(h)、生殖器官系统(gt)、壁肌肉(Wm))显示出活性。在a)中，基质是L-亮氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺，在b)中，基质为L-谷氨酸α-(4-甲氧基-β-萘酰胺);
图20示出了3.5PCR产物(克隆2)(SEQ IS NO8)被亚克隆入杆状病毒表达载体pBlueBaⅡ
的染色体图谱;
图21示出了用抗H110D抗体探测的由感染杆状病毒昆虫Spodoptera frugiperdn(sf)9得到的提取物的Western印迹。两种克隆的斑点，P3A和P4A表达全长免疫阳性H110D(箭头所指)，而对比则不表达。
实例方法U.K.λGT11库的构成mRNA分离液氮预冷研钵和研杵，将液氮中速冻UK源的成熟Haemonchus Contortus(0.5g)研磨。在含0.5%W/V Sarkosyl(商品名，N-取代谷氨酸)和0.7%W/V的2-巯基乙醇的25mM柠檬酸钠中用10体积4M盐酸胍将RNA自研磨体中萃取，随后采用Chomczynski和Sacchi方法(1987)用酚和氯仿萃取。根据Maniatis等人所述方法(1982)采用亲合色谱法(两次)在低dT纤维素上由此制备信使RNA(mRNA)，并采用兔网状细胞溶胞产物药盒和得自Amersham International pLc的35S-甲硫氨酸通过离体转译来评估质量。检测直至120kd的多肽。
制备互补DNA按照Gubler & Hoffman的方法(1983)，用随机活化和禽类逆转录酶由1μgmRNA合成第一链互补DNA(cDNA)，并采取用RNase H和E.coli DNA聚合酶I的置换反应和随后用T4DNA聚合酶修复3′悬突体来合成第二链。自1μgmRNA产出的双链(ds)cDNA近400ng。在1%琼脂糖凝胶中以电泳法随后用放射自显影法检测ds cDNA。该ds cDNA的尺寸范围为0.2-9.4千碱基(Kb)，主要在0.5-2.3Kb范围内。
λgt11中cDNA的克隆采用如制造商说明所述的Amersham cDNA克隆体系(药盒号RPN1280，Amersham International plc)和离体包封萃取液(药盒号N334，Amersham International plc)以及EcoRⅠ衔接低聚核苷酸(5′GGAATTCC)方式用无尺寸选择的cDNA在λgt11中建库。在有异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴，4-氯，3-吲哚基β-D-半乳糖苷(X-gal)的存在下将所得库铺置于E.coli菌株Y1090上，在该条件下，重组体λgt11呈明亮(“白”)斑点，而野生型非重组体λgt11呈蓝色斑点。该库含90%白斑且克隆效率计为4×107噬斑形成单位(pfu)/μgcDNA，此时的库滴定度为2×106噬斑形成单位/ml。对随机采集的20个重组体的DNA分析表明平均插入物尺寸为0.51Kb。不过，因一个克隆有3.5Kb的插入物而使这一平均值失真。主要部分的插入物大于300碱基对(bp)。然后将此由UK蠕虫mRNA衍生的未放大的λgt11库免疫筛选。
制备抗体探针对整合膜蛋白的抗血清自成熟Haeminchus contortus(UK源)中将肠解剖并将其在PH7.4的含1mM乙二胺四乙酸(EDTA)和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)的冰冷却磷酸盐缓冲盐水(PBS)中搅均。用一微驱管(microfuge)将均浆离心10分钟并使沉积片再悬浮在含0.1%v/v Tween20(Tween为商标)的相同缓冲液中。再离心分离后，将沉积片再悬浮于含2%v/vTriton X-100的相同缓冲液中并于4℃萃取2小时。将此萃取液进行如上的离心分离，得到含整合膜蛋白(IMP)的上清液。
通过在第0、7、11和15周分别得到的50，50，120和130μg的IPM以肌内注射方式将弗洛因德全佐剂(FCA)中的IPM对羊进行超免疫。最后一次注射的六周以后收集血清，并将其标记为血清EE-068。
通过Haeminchus contortus净化提取制备整合膜蛋白在5-10体积含1mM EDTA和1mM PMSF的PBS中均化蠕虫来制备萃取液。在4℃将悬浮液在10000xg下离心分离20分钟并如上所述将沉积片在含0.1%v/v Tween20的相同缓冲剂中洗涤，然后用5体积2%v/v Triton X-100萃取。将上清液在100000xg下再离心分离1小时，并将所得的富集H110D但含其它IMP的上清液用于Western印迹实验和用来制备不变性H110D(如下)。
制备H110D和亲合纯化抗-H110DN对富集H110D的萃取液在ConA-琼脂糖上做亲合色谱分离随后在MonoQ上做离子交换色谱分离(如WO88/00835和WO90/11086所述)。将纯化的在FCA中的H110D肌肉注入羊羔。每三周给药3剂，每剂量100μg。最后一次注射的四周之后由羊羔内收集的血清以将其吸收到含纯化的H110D的分离柱上的方式进行亲合纯化，该H110D已被偶联到溴化氰活化的琼脂糖上。H110D与琼脂糖的偶联，抗血清的结合以及抗-H110D抗体的洗脱皆按照Pharmacia提供的方法来进行。将这些亲合纯化抗体标示为抗-H110D。“N”使这些抗体区别于标示为抗-H110D的那些产生变性的电泳纯化的H110D。
Western印迹采用标准步骤(Johnstone等，1982)进行Western印迹。
克隆的分离和表征U.K.λgt11库的免疫筛选用来免疫筛选该库的方法基本如Bowtell等人(1986)所述。使用之前，通过用溶胞产物和E.coli Y1090全细胞吸收使该血清(EE-068)排除抗-E.coli抗体。将该库以每90mm直径平板103pfu的密度铺置于E.coli Y1090细胞上。用浸渗IPTG的硝化纤维素过滤器铺盖平板并培育过夜。用TBST(50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.05%v/v Tween20)洗涤过滤器，之后在含5%v/v马血清的TBST中保护2小时。加入血清EE-068，该血清已用含5%v/v马血清的TBST稀释成1∶200，轻摇过滤器培育4小时。于TBST中再次洗涤滤器，然后与结合辣根过氧化酶(HRP)的马体抗羊IgG一起培育2小时，该IgG已用含5%v/v马血清的TBST稀释成1∶500。(在马中产生对绵羊IgG的抗血清，是在绵羊IgG琼脂糖柱上用亲合色谱法提纯抗绵羊IgG，并用Nakane & Kawaoi方法(1974)将该抗体结合于HRP)。在TBST中再洗涤滤器并用0.6mg/ml 3，3′-二氨基联苯胺(DAB)和0.1%v/v过氧化氢检测阳性斑点。采集25个假定阳性点并用如上所述的亲合纯化的抗-H110DN再筛选。第二次筛选之后仍有5个重组体呈阳性，并带有给出最强信号的标示为M1的克隆。
在重组体噬菌体上亲合提纯抗体通过分别铺置103pfu抗体阳性的λ克隆或非重组体gt11阴性对比噬菌体的方式在E.coli Y1090菌苔上制备有细胞流动的平板。该菌苔在42℃保温4小时后覆盖以浸渗了IPTG的滤器再于37℃保温过夜。将该滤器自平板上取下并在其用5%v/v马血清保护1小时之前将其先在TBST中洗涤。而后将该滤器用1∶100稀释度的抗血清EE-068培养6小时，后用TBST彻底漂洗。两次使用2ml洗脱缓冲液(5mM甘氨酸，500mM NaCl，0.2%Tween20，PH2.3)，每次经2-3分钟将结合抗体自滤器上洗脱，加入200μl 1M Tris-HCl(PH7.4)中和，以1∶200稀释再用于免疫筛选富集H110D萃取物的Western印迹试验。
M1克隆的DNA定序按照Maniatis等(1982)所述的方法将λDNA从M1克隆分离出。用凝胶电泳法将含300bp M1片段的2.38Kb KpnI-SstI片段分离、用-GENECLEAN药盒(Stratagene)(GENECLEN为BI0101的注册商标)将其提纯并亚克隆入pBluescriptII SK+(Stratagene)。用相同方法将EcoRI片段提纯并将其再亚克隆入相同载体。
采集M13正向和反向两种引物并用T7序列分析药盒(Pharmacia，U.K.)确定M1插入物的核苷酸序列。
制备澳大利亚λGT11和λZAP cDNA库mRNA分离将在液氮中速冻的5g成熟Haemonchus contortus(澳大利亚Mcmaster感性品系)在液氮中研磨并采用Cordingley等人的方法(1983)用热苯酚萃取RNA。全部RNA的产量为10.35mg。用Maniatis等所述的方法(1982)通过在低聚dT纤维素上进行亲合色谱分离(二次序贯提纯)将1.3mg该RNA用来制备mRNA。mRNA产量为21.6μg。按照提供者的说明，mRNA的质量是在35S-甲硫氨酸(Amersham)存在下通过在兔网状细胞溶胞产物中离体转译来评估的。当采用在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳法和随后的荧光照相术演示时，获得的转译产物具有包括尺寸大于200Kd的明显分辨的带区。
cDNA的合成和库的制备按照制造商的说明用得自Amersham International plc的cDNA合成药盒以低聚dT或随机引物引发方式将1μgmRNA用来制备cDNA。得到115mg双链(ds)cDNA。如Amersham cDNA组的说明所述在碱性琼脂糖凝胶上用32P-标记DNA的电泳法来检测cDNA的质量。cDNA的尺寸(与New England Biolabs的λ-HindⅢ标志比较)从150bp至＞10Kb，大多数产物尺寸范围在0.6-5Kb。汇集低聚的dT引发的及随机引发的ds cDNAs并将其连接到已用γ-32P-ATP标记的多余的EcoRI8节衔接物(5′GGAATTCC 3′New England Biolabs，Catalogue No.1018)和T4多核苷酸激酶上。衔接的cDNA被EcoRI消化而多余的衔接物按Maniatis等所述的方法(1982)以琼脂糖4B(Pharmacia)色谱法分离去除。将分离柱中的馏分分两级汇集，一级含大于2Kb的cDNA而另一级含小于2Kb的cDNA。然后将每一汇集体分别地连接到1μg已切去EcoRI的磷酸酯酶化的λZapⅡ臂上(Stratagene)并用Gigapack Gold(Stratagene，注册商标)分别包封。大尺寸cDNA产生1.3×105个重组体而小尺寸cDNA产生1.4×105个重组体;将其汇合得到一个2.7×105的库。以2×104pfu/(135mm平板)的密度在XLI-Blue细胞(Stratagene)上铺置而将λZap库放大。该放大库的滴定度为7×107pfu/ml。
如上所述用另外2μgmRNA制备cDNA，不同的是只用低聚dT作为引物。ds cDNA产量为740ng。在加入EcoRI衔接物之前，如Maniatis等所述(1982)将此cDNA用EcoRI甲基化酶处理，在这一情况下使用12节衔接物(5′CCGGAATTCCGG 3′New England Biolabs，Catalogue No.1019)。用EcoRⅠ消化衔接的cDNA之后，将Sapharos 4B柱上所有含cDNA的馏分汇合并连接于2μg已切去EcoRI的磷酸酶化的λgt11臂(Stratagene)上。将该消化混合体分为两份并用两份Gigapack Gold(Stratagene)包封;使其汇合产生一7×106pfu的λgt11库。在ST9细胞上以5×105pfu/(135mm平盘)的密度铺置来放大该库。放大的λgt11库的滴定度为4.5×1011pfu/ml。
用H110D的抗血清筛选澳大利亚λgt11库用H110D蛋白(UK源)给绵羊注射产生了抗血清，该蛋白在于SDS中电泳处理后已经过聚丙烯酰胺电洗脱，此过程按下面方法进行将按WO88/00835和WO90/11086中所述制备的ConA H110D在SDS聚丙烯酰胺凝胶(Laemmli 1970)上电泳处理来获得电洗脱的H110D。电泳之后，将含H110D的聚丙烯酰胺凝胶区域切取，置于一电洗脱器(Atto)并以10瓦功率进行洗脱3小时。将电洗脱的H110D(标为H110D)在Centriprep10(Amicon)上浓缩并将PD10柱(Pharmacia)上的缓冲剂变换为50mM碳酸氢铵/0.07%SDS，混以辅剂后注射入绵羊。用硫酸铵将免疫球蛋白自血清中沉淀(Johnstone and Thorpe，1982)。在磷酸盐缓冲盐水中以60mg/ml的浓度再悬浮沉淀的抗体，透析磷酸盐缓冲盐水并以1∶10的稀释度稀释于含5%w/v低脂奶粉的Tris缓冲盐水(TBS)中。将10mg ConA H110D制成0.5%SDS，加热至100℃3分钟后将其置于硝化纤维素滤器上干燥。用含0.2%v/v Tween20和0.5%Triton X-100(TBSTT)的TBS洗涤，随后使该滤器于室温下用H110D抗体培养1-2小时。用TBSTT将滤器洗2小时后，用3ml PH2.6的含0.1M甘氨酸，0.15M NaCl的溶液将结合抗体洗脱2分钟并添加75μl PH8.0的1.5M Tris立即将PH调至中性。如前所述将这些标示为抗-H110DE的亲合提纯抗体用于筛选5×105pfu的澳大利亚λgt11cDNA库。
将衍生于澳大利亚Haemonchus contortus的λgt11库的5×105个重组体免疫筛选并采集出三个阳性体。进一步筛选之后，该重组体中的两个仍呈阳性，将其标示为B1A和B2。
B1A和B2克隆的定序用EcoRI消化这两个克隆，B1A产生一近500bp的单个插入物而B2产出3个片段，B2A(约400bp)、B2B(约100bp)和B2C(约100bp)。将它们亚克隆入pBluescript SK+(Stratagene)并用Sequenase2.0药盒(United States Biochemicals)定序。
克隆M1和B1A的表达用pGEX载体(Smith and Johnson 1088)在E.coli中表达M1(SEQ ID NO1)和B1A(SEQ ID NOS2和3)插入物。该载体在Schistosoma japonicum谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的C-末端表达蛋白。将M1和B1A EcoRI插入物连接于已切去EcoRI的磷酸酯酶化pGEX1上，并按Maniatis等所述的方法(1982)将其转化成E.coli菌株JM101。自每一转化过程采集8个子代，在37℃下经6小时生长2ml培养物。加入IPTG来诱导融合蛋白合成，继续培养过夜。经离心处理收取细胞，在样品缓冲剂(Laemmli，1974)中煮沸使细胞破裂，并用SDS-PAGE法和用Western印迹法分析该萃取物，其中所使用的亲合纯化的羊抗体是专门针对SDS-变性H110D成对物的(抗H110DE，见前文)。结合的抗体的检测用碱性磷酸酯酶结合的兔体抗绵羊IgG碱性磷酸酯酶结合体(Jackson Immunoresearch)，随后用5-溴，4-氯，3-吲哚基磷酸酯(BCIP)和氮蓝四唑(NBR)显色。如前所述使免疫阳性克隆培养物生长并被诱导再经声处理而破裂。将声处理物经离心处理分为可溶性和不溶性组分(Sorvall RC-2B离心机，HS4转子，7000rpm，30分钟，4℃)。经声处理将不溶性沉积片再悬浮于8M脲中，并用SDS-PAGE检验组分试样。发现融合蛋白处于不溶性内含体组分中。用每份制备品给两只绵羊接种三次，每剂150μg融合蛋白，在Freunds佐剂中注射。作阳性对比的绵羊用天然ConA H110D蛋白免疫，而阴性对比的绵羊用源于E.coli的加溶蛋白免疫，该E.coli含pGEX载体而没有Haemonchus插入物。用Western印迹对取自接种绵羊的血清分析H110D。
经DNA与M1和B1A插入物的杂交筛选澳大利亚λZAP库用EcoRI消化M1和B1A质粒DNAs(在pBluescript中克隆)并将该插入物在10%琼脂糖凝胶的TBE(tris-borate-EDTA;89mM三硼酸盐、89mM硼酸、2mMEDTA，PH近8.3)缓冲剂中电泳分离，随后用GENECLEAN药盒提纯。重复该分离和提纯过程以避免探针与质粒DNA序列混杂使后者杂交成λZAP序列，产生不合格的背景水平。按照制造商的说明，用Promega Biotech的Nick Translation药盒以α-32P-DCTP来标记提纯的插入DNAs。用自转柱色谱法(Maniatis等，1982)将标记的DNA与未结合标记物分离。八个135mm的λZAP库平板以105pfu/平板的密度铺置，且斑点集取物在硝化纤维素滤器上演示(Manitis等，1982)。在真空烘箱内于80℃烘2小时后，使滤器预杂交2小时，然后在42℃杂交过夜(如后面Southern Blot分析一节中所述)。用M1探针筛选四个滤器再用B1A探针筛选四个滤器。将滤器在含0.5%SDS的2×SSC中洗涤两次，一次在含0.5%SDS的1×SSC中且一次在含0.5%SDS的0.5×SSC中，均在50℃下进行，并做放射自显影。采出可能为阳性的斑点并用探针再筛选。由证实的阳性物(M1杂交克隆标示为M1AUS而B1A杂交克隆标示为AustB1)制备高滴定度噬菌体原种并按照该λZAP制造商的说明规则(Stratagene)将克隆夺回进入pBLUESCRIPT，其中用BB4作为宿主E.coli菌株。经碱性溶菌作用(Maniatis等，1982)制备所得子代的质粒DNA微制品(Minipreps)并将其用RcoRI消化。用琼脂糖凝胶电泳法分析该消化液。
M1AUS插入物的定序按照制造商的说明，采用“美国生物化学品”变体2.0 Sequenase药盒在提纯的pBLUESCRIPT质粒DNA上进行DNA定序。用载体序列端点的引物来引发第一定序反应。用由这些反应所得的定序数据来设定第二对引物且由第二组引物产生的数据设定第三对引物。以此方式由5′和3′两端“沿序行进”地对DNA定序。
AustB1插入物的定序如对M1AUS插入物的定序所述，用Sequenase 2.0T7聚合酶(USB Biochemicals)进行这个定序。
聚合酶链反应制备cDNA按对成熟UK蠕虫所述的方法制备注射U.K.H.contortus11天后的mRNA，取其1μg在经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水中与T7连接引物(5′GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3′)混合，然后加热至65℃过5分钟，立即置于冰上。加入氢氧化甲基汞至28.6mM的最终浓度，并将混合体于室温保温3分钟。加入2-巯基乙醇至14.2mM的最终浓度，再将混合体置于冰上。为合成cDNA，加入RNAse Guard(Pharmacia)至1单位/μl，Reuerse Transcriptase缓冲剂(Life Sciences)至1倍浓度，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各至1mM以及AMV Reverse Transcriptase(Life Sciences)至2单位/μl(均以最终浓度给出)。使反应在41℃培育75分钟，然后用苯酚和氯仿萃取并以自转柱色谱法提纯(Maniatis等，1982)。将提纯的反应混合物稀释2.5倍并于4℃储存。
用M1AUS-特种引物做cDNA的PCR放大用Programmable Thermal Cycler(M.J.Research Inc.)进行PCR反应。在100μl反应体积中，反应混合物含有1μl稀cDNA(取自如上所述制备的250μl稀cDNA)，25pmol第一链T17-连接引物，25pmol第二链放大引物(或基于M1AUS序列(SEQ ID NO5)的865-884位置(5′ACGGGTGTTCGGTTTCCGTAT3′)或基于该序列30-49位置(5′GCTGAATCTAACTCCAATCC3′))，1xTaq缓冲剂(Northumbria Biologicals Ltd)和各0.5mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，且用40μl矿物油覆盖以防蒸发。然后将此混合物在热循环器中热至95℃过2分钟再保持在72℃。在72℃时加入2单位Taq聚合酶(Northumbria Biologicals Ltd)并使之与其他反应剂缓慢混合。然后在该热循环器中进行下述程序步骤步骤1在50℃退火5分钟步骤2在72℃伸展40分钟步骤3在94℃变性40秒步骤4在50℃退火2分钟步骤5在72℃伸展3分钟步骤6步骤3-5循环39次步骤7在72℃最后伸展15分钟步骤8保持于4℃这些条件均由Frohman等(1988)建立。
PCR产物的克隆用电泳法在琼脂糖凝胶中将PCR产物自上述反应中分离出。将约2.5和3.5kb的DNA带在玻璃纤维(Whatman)上电洗脱，用酚萃取并以G50色谱法(Pharmacia)提纯(Sambrook等，1989)。按照制造商的说明将提纯的DNA连接于pT7Blue T-载体(Novagene)。
2.5kb和3.5kb PCR产物的定序采用于M1AUC的定序一节中所述的“低核苷酸行进”技术用Sequenase2.0药盒(US Biochemicals)进行DNA定序。
5′端的聚合酶链反应制备第一链cDNA将按对成熟蠕虫所述的制备法取自11日龄的经注射UKHaemonchus contortus制得的1μgmRNA与恒定引物(5′AAIGAAAGCGGATGGCTTGATGC3′)混合，该引物自AustB1的保留区和2.5kb PCR与3.5kb PCR产物(SEQ ID NOS各为6、7和8)中设定。将该混合物热至65℃5分钟，置于冰上并加入氢氧化甲基汞至28.6mM的浓度。使该混合物于室温下培育5分钟，然后加入2-巯基乙醇至14.2mM的最终浓度再将此混合物置于冰上。在20mM Tris/HCl PH8.4、50mM KCl、2.5mM MgCl2100μg/ml BSA、0.5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP的最终浓度下用5′RACE系的试剂制备第一链DNA。加入200单位Superscript Reverse Transcriptase并使反应在42℃下培育30分钟，而后于55℃加热5分钟。加入RNAse H至最终浓度100单位/ml，并使反应在55℃下培育10分钟然后置于冰上。经过Glassmax自转分离柱(Gibco/BRL)提纯cDNA并将其在-20℃储存。
C-结尾的cDNA将 1/5 第一链cDNA在70℃加热5分钟然后于冰上速冷1分钟。加入5′RACE系(Gibco/BRL)的试剂至最终浓度为10mM Tris/HCl pH8.4、25mM KCl、1.25mM MgCl、50μg/ml BSA、0.2mMdCTP。加入500单位/ml Terminal转移酶并使反应在37℃培育10分钟，然后在70℃加热15分钟再在冰上储存。
用AustB1、2.5kb PCR和3.5kb PCR特种引物做PCR放大在一可控程序的热循环器(M.J.Research Inc.)中进行PCR反应。对3′端使用三个引物之一个。
1.2.5kb PCR产物的特种引物基于位置374-394(5′TGTTGTGGCTAATTTCGTCCA3′)2.3.5kb产物的特种引物基于位置1210-1229(5′CACTTIAGTTATCTGACCAG3′)。
3.cDNA克隆AustB1的特种引物基于位置357-377(5′GACCATCGCTGATGAAGTCGG3′)。对该反应的5′端用普通‘固着引物’(5′<CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG3′)。每一反应混合物含4μl(50μlC-结尾cDNA中的)C-尾cDNA，25pMol适宜的两种引物，1xTaq聚合酶缓冲剂(Boehrinyer/Mannheim)和各0.5mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，其最终体积达100μl。用50μl矿物油将此混合物覆盖并于热循环器中热至95℃保持2分钟。加入0.6单位Taq聚合酶时使反应混合物保持在80℃，然后进行下面的程序1.在50℃退火5分钟2.在72℃伸展10分钟3.在94℃变性45秒4.在50℃退火1分钟5.在72℃伸展2.5分钟6.将3-5循环39次7.在72℃伸展15分钟8.保持在4℃。
5′PCR产物的克隆在琼脂糖凝胶上经电泳处理将PCR产物分离并切取近1.3kb的期望尺寸的区带，用GENECLEAN药盒将DNA提纯并按照制造商的说明将其连接到PT7Blue T-Vector(Novagene)中。
AUSTB1的3′产物的聚合酶链反应所用的第一链cDNA为与M1AUS引物一同使用时所述的cDNA产物。取自AustB1(SEQ ID NO6)中1414-1435(5′TCTTGAAGAAATGAAAAAGCTT3′)的特种引物与用于M1AUS PCR的T17连接引物一起使用，使反应在热循环器(M.J.Research Inc)中进行。该反应混合物由25pMol的每个引物、2μlcDNA、1xTaq聚合酶缓冲剂(Boehringer Mannheim)、0.5mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP组成，共100μl。将其用50μl矿物油覆盖并热至95℃持续2分钟。加入0.6μlTaq聚合酶并按与前述5′PCR相同的程序周期运行。
3′产物的克隆和定序在琼脂糖凝胶上用电泳法分离PCR的产物并切取1.3kb期望尺寸的区带，用GENECLEAN药盒提纯DNA并按制造商的说明将其绑连接到PCR-Script(Stratagene)中。
已克隆的PCR产物的定序按制造商的说明用Sequenase 2.0药盒(United States Biochemical)定序PCR克隆的DNA。用低核苷酸引物自5′和3′两端在克隆的DNA上“沿序行进”。
全部DNA序列分析用GCG(Genetics Computer Group)序列分析软件包(Devereux等，1984)分析序列。
NORTHERN和SOUTHERN印迹分析制备Northern印迹基本如Maniatis等所述(1982)在甲醛凝胶中做印迹。在65℃用含17.5%v/v甲醛和50%v/v甲酰胺的MOPS缓冲剂(20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸、PH7.0、8mM乙酸钠，1mM EDTA)处理mRNA样品(取自11-、15-和23-日龄成熟的H.contortus)15分钟，并于冰上冷却。在MOPS缓冲剂中电泳处理凝胶，并按Sambrook等所述(1989)经毛细管转移而印迹于Duralon膜上。
Southern印迹的制备将2g已于液氮中速冻的成熟Haemonchus contortus在液氮中研成细粉。将该粉末缓慢加入25ml溶解缓冲剂(0.05M Tris-HCl，PH8，0.1M EDTA，1%w/v Sarkosyl，0.05mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim)并于65℃保温2小时。然后用1体积酚加氯仿将该悬浮液萃取两次，用2体积氯仿萃取两次再乙醇沉淀。将沉淀的基因组DNA在4℃下于置于摇台上的20ml Tris，EDTA缓冲剂(TE，PH8)中再悬浮过夜，然后经更换两次的1升TE透析。在37℃用最终浓度为20μg/ml的不含DNase的RNase A Type 1(Sigma)保温1小时来去除RNA，随后如前所述用酚-氯仿萃取一次，用氯仿萃取一次，再乙醇沉淀。用70%v/v乙醇洗涤两次沉淀的基因组DNA沉积片，并如前所述将其于1ml TE中再悬浮。
在37℃用EcoRI或Hin dⅢ(每一消化液含25μg DNA)使基因组DNA消化过夜，然后将其在Tris-乙酸乙酯缓冲剂中的1%琼脂糖凝胶上以5μg/(径迹)电泳处理。按Maniatis等所述(1982)通过用毛细管转移至Hybond-N膜上(AmershamInternational)使该凝胶Southern印迹。按制造商的推荐用紫外光将DNA固着在膜上。
制备探针用EcoR1消化含M1AUS、B1A或AustB1插入物的pBLUESCRIPT质粒。用BamH1消化含3.5kb PCR产物插入物的pT 7Blue质粒并用BamH1和XbaI消化含2.5kb PCR产物插入物的pT7Blue质粒。电泳处理消化液，回收插入物并在λZAP库筛选条件下如前所述经断口转译以α-32P-dCTP放射性标记该插入物。
杂交条件用于Southern印迹将膜切成条状并如前所述在28℃下于杂交缓冲剂中预杂交3小时。在28℃下使基因组DNA Southern印迹条过夜杂交于每一上述探针，在室温(24℃)洗涤两次再于42℃洗涤两次，洗涤均在含0.1%w/v SDS的2xSSC(适中强度)中进行，再放射自显影。随着放射自显影显色后，将条带以高强度液(0.1x SSC，0.1%w/v SDS，65℃)再洗涤并再次进行放射自显影。
用于Northern印迹探针M1，M1AUS和B1A(各为SEQ ID NOS1、5和2)用M1插入物首次探测取自11、15和23日龄Haemonchus contortus的mRNA Northern印迹。将滤器在42℃下于含5xDenhardt′s
、0.5%SDS(十二烷基硫酸钠)、10%硫酸葡聚糖、0.1mg/ml鲑睾丸DNA和50%去离子甲酰胺的2xSSC(20xSSC＝3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.2)中预杂交2小时。向探针的杂交是在42℃下于相同的缓冲剂中过夜进行。将滤器在含0.5%SDS和50%甲酰胺的2xSSC中洗涤两次，共30分钟;再在2xSSC中洗两次，共30分钟。第一组洗涤在42℃进行且其余洗涤在37℃进行。放射自显影后经在煮沸的0.1%SDS中洗涤，将免疫印迹剥离并再次进行放射自显影以确保去除探针。然后用M1AUS插入物探测相同印迹、洗涤并放射自显影。将该印迹再次剥离并检查直到后来用B1A插入物探测为清澈。再次剥离之后如下所述探测印迹。
探针AustB1、2.5kb和3.5kb PCR产物(SEQ ID NOS6、7和8)。
如在Southern印迹杂交时所述，采用适中的强度条件使Northern印迹与AustB1插入物杂交。放射自显影后按膜制造商的说明(Amersham)用沸态的0.1% SDS将印迹剥离，然后用2.5kb PCR插入物(克隆2)探测，再剥离并用3.5kb PCR(克隆2)插入物探测。
消化H110D及测试酶活性制备H110D按照WO88/00835及WO90/11086中所述的方法制备天然H110D(H110DN)。
制备H110D的弹性蛋白酶片段(H11S)
将成熟Haemonchus在10体积的冰冷PBS/0.02%叠氮化钠中均化，然后在13000rpm下离心处理20分钟。将沉积片于10体积PBS/叠氮化物中再悬浮、再均化并重复离心处理。在50mM MOPS PH7.4的缓冲剂(每0.17g蠕虫悬浮需用体积为1ml)中再悬浮并于37℃预热30分钟之后将沉积片物质用弹性蛋白酶(800μl/20ml悬浮液1mg/ml在1mM HC1/2mMCa2+中配制的新鲜储液)消化1小时。加入3，4-二氯异香豆素(300μl DMSO中的10mM储液/20ml消化液)中止消化。将混合物在13000rpm下离心处理20分钟并将沉积片物质保留。将上清液以100000g，超离心分离1小时20分钟。将所得上清液用于ConA柱并得到结合馏分。为进行分析，使这一馏分流经SDS-聚丙烯酰胺凝胶并电泳转移至聚二氟乙烯膜(Immobilon-P，MiUipore)上，用考马斯蓝(Coomassie Blue)略微着色，切取105kb区带并在气相氨基酸序列分析仪内分析。对接种研究来说，要经过浓缩再加至Superose12(Pharmacia)凝胶过滤柱并收集具有氨肽酶活性的馏分来进一步提纯这个ConA结合馏分。
H110D的嗜热菌蛋白酶消化作用经电洗脱方式将H110D成对物自8%预配制的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中提纯而得到H110DE，如WO90/11086所述，且通过在仅高于200kb下运行(当在SDS-PAGE上重新运行时在110kb下产出特征成对物)的二聚体洗脱获得H110DE。将H110DE溶液浓缩至200μl，加入氯化钙至5mM并将混合物温热至37℃。以0.1μg嗜热菌蛋白酶/1μg H110DE的比率加入新制备的1mg/ml嗜热菌蛋白酶(在1mMHCl、2mM CaCL2中)溶液。将该混合物于37℃保温120分钟然后加入5μl 0.5M EDTA中止反应。
经过15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳处理来分离蛋白质片段，并用电泳法将其转移至聚二氟乙烯膜上(Immobilon-P，Millipore)。用考马斯蓝着色后切取最强的分离带并在气相氨基酸序列分析仪中对其序列分析。
制备集聚氨肽酶A活性的H110D馏分(H11A)将处理弹性酶之后以17000g离心处理20分钟而获得的沉积片状物于4℃下在PBS中再悬浮，并经离心分离再沉积，然后于含1%Tween的PBS/叠氮化物中再悬浮并(伴随搅拌)搁置1小时。将悬浮液以17000g离心分离20分钟并排除上清液。用含1%Thesit的PBS/叠氮化物重复萃取沉积片。将以17000g离心处理20分钟后的上清液合并，并以1000000g超离心分离1小时20分。将该上清液加到ConA亲合分离柱(Affigel，Biorad)并洗脱结合物，再用离子交换色谱法在MonoQ柱上进一步分级。
酶活性的测定通过在溶液中用L-亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、α-谷氨酸和赖氨酸对硝基酰苯胺(pNA)测定说明了在H110D制品中α-氨基酰肽水解酶(微粒体)氨基肽酶活性的特征。所有氨基酸对硝基酰苯胺底物(除α-谷氨酸外)均由Sigma，Poole，Dorset UK得到，α-谷氨酸则来自Fluka，Dorset UK。选择已知分别为哺乳动物氨基肽酶-M(ApM)和-A(ApA)、底物的单一疏水(亮氨酸-或苯丙氨酸-)和带电的(α-谷氨酸-)氨基酸pNA以测定酶抑制剂和血清抑制对H110D氨基肽酶活性的作用。
(a)微量培养板测定将Micro-ELISA培养板的井各用250μl PH7的50mM HEPES或是MOPS加1-10μl待测的馏分充填。然后在每井加入10μl 25mM氨基酸对硝基酰苯胺底物之前将培养板在37℃预保温10分钟。然后用ELISA板读数器测量在405nm处的定时零位光密度(OD)，然后将这些培养板在37℃下保温15-30分钟。之后按前述取最终OD读数并计算每分钟每毫克蛋白的OD变化。
(b)抑制剂灵敏度酶测定所用的方法如上述(a)，所不同的是将抑制剂加入到250μl缓冲剂加10μl浓度为1mg/ml的ConA H110D中，并且在加入底物之前(亮氨酸-pNA或α-谷氨酸-pNA)要在37℃预保温10分钟。按下式计算抑制百分比(X-Y)/(X) ×100＝抑制百分比。
其中X＝未加入抑制剂的酶的△OD/分，Y＝酶加抑制剂的△OD/分。分别试验用不同酶类抑制的九个化合物Amastatin、Bestatin(金属蛋白酶·氨基肽酶)、1，10菲咯啉、EDTA(金属蛋白酶)、phosphoramidon(金属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶)、Aprotinin(丝氨酸蛋白酶)、Pepstatin(天冬氨酸蛋白酶)、PMSF(丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶)和E64(半胱氨酸蛋白酶)。Amastatin、Bestatin、1，10菲咯啉、PMSF和Pepstatin从Sigma，Dorset UK得到。其他全部抑制剂来自Boehringer-Mannheim。每种抑制剂以等于或大于Boehringer-Mannheim推荐的最大浓度使用。
(c)酶的抗血清抑制测定按上述(a)进行测定，不同的是设置两个ELISA培养板。在一个板上将每井有10μlConA H110D(1mg/ml)加10μl取自各绵羊的抗血清在37℃预保温15分钟。第二个板，每井装有250μlHEPES/碳酸氢盐缓冲剂加10μl苯丙氨酸-pNA或者α-谷氨酸-pNA底物也在37℃预保温15分钟。然后用多级移液管将ConA H110D-血清混合物加到第二个板上的缓冲剂-底物混合物中。测定△OD/分。为了对比，用上述(b)中公式计算抑制百分比，其中X代表井的平均△OD/分，井内含有酶加来自阳性对照绵羊的血清(接种马脾脏铁蛋白的)，Y＝井的△OD/分，井内含有酶加来自用H110D接种的个体绵羊的血清。为了对比(图18)，利用上述(b)的公式计算保护百分比，其中X或为每克的平均粪便卵排出量或为对照的平均虫负荷，而Y既可为实验期间每克粪便排出量又可为用H110D接种的个体绵羊的虫负荷。
通过组织化学对酶活性的测定通过Nachlas等人(1957)，Nakane等人(1974)和Lojda等人(1980)的方法，使用L-亮氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺和L-谷氨酸α-4-甲氧基-β-萘酰胺作为底物，在10μm Haemonchus contortus成虫的冻结切片上展示了氨基肽酶活性。
在真核杆状病毒属-昆虫细胞体系中重组体H110D的表达表达质粒的构成上述3.5K PCR片段是在一个低聚dT接合体(它含有SalI位点)和低聚872之间通过放大产生的，它代表的碱基号在M1AUS序列中是′S30-49，并被克隆入pT7Blue载体。克隆pT73.5-2是从载体多衔接物BamHI位点在其5′端定位，并用HindⅢ、XbaI和SalI位点在3′端定位。在5′端序列是BamHI ＊！-低872-！-3.5K-5'GG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATC C 3'Leu Asn Leu Thr Pro Ile星号表示用于克隆入P7Blue载体的3′dT/dA悬突体。
按照Maniatis等人的方法(1982)，用HindⅢ(在3.5K基因3′端载体多衔接物序列中的单一位点)消化3.5PCR克隆2，而使用DNA聚合酶I(Klenow片段)将脱氧核苷酸充填末端。BamHI衔接物(5′CGGATCCG3′，New England Biolabs Catalog no.1021)连接到在钝园末端上，并选择具有一个可使全长H110D基因序列被切割成BamHI片段的额外BamHI位点的克隆。BamHI片段通过在0.6%w/v tris-乙酸盐缓冲剂的琼脂糖凝胶上电泳分离，随后用GENECLEAN(BIO101)纯化;这一步骤进行两次。然后将该纯化的片段连接到切去BamHI的，磷酸酶化的pBlue BacII(Invitrogen Corp)上，并通过用NheI和XbaI消化测定在正确取向上载有该片段的克隆(即从位于杆状病毒属多角启动子的控制下的3.5PCR克隆2的5′端)。生成的质粒用BamHI部分消化，末端如前述方式填充。加入一种含有ATG(5′CCCATGGG3′;New England Biolabs Catalog no.1040)的NcoI衔接物并连接该混合物。在3.5PCR克隆2的5′端BamHI位点而不是在3′位点具有连接衔接物的克隆用NcoI消化来测定。得到的质粒称作pBB3.5-2(N)，被描绘在图19中。
这一构建导致在3.5PCR克隆2插入物的5′端上一个读码内ATG的插入，以促使转译。环绕这个起始ATG的序列是BamHI-NcoI联接-BamHI-＊！-低872-！-5'GGATCCCC ATG GGG ATC CGA TTG CTG AAT CTA ACT CCA ATCC..
Met Gly Ile Arg Leu Leu Asn Leu Thr Pro Ile...
表达的蛋白将失去相应H110D序列的氨基酸2-9，并将有3个紧随ATG衔接物序列的氨基酸。
含H110D序列重组体杆状病毒的产生按生产商提供的规程使用线性Autographica californica核多角体病毒(ACNPV)DNA和阳离子脂质体(Invitrogen Corp.transfection module)将质粒pBB3.5-2(N)转染λSpodoptera frugiperda(Sf9)细胞(可由Invitrogen Corp.得到)。这些细胞在添加有胎牛血清(CSL Ltd;于56℃热减活45分钟)和抗生素(青霉素/链霉素，庆大霉素;CSL Ltd)的TC-100培养基(SIGMA)中培养。还使用在3.5PCR克隆2序列的3′端插入ATG的pBB3.5-2(N)质粒进行对照转染。通过算入在琼脂糖覆盖层中以所建议的含量的X-gal，根据pBlue BacⅡ载体也可编码E.coli β-半乳糖苷酶(β-gal)选择重组体斑点。选择出蓝色斑点，并将其再进行二次斑点纯化，在这一时间后，感染的单细胞层显示出不含有野生型病毒的迹象(这些可通过核多角体的存在而证实)。纯化的病毒被称为3.5-2-P2A，-P3A和-P4A，使用前要通过Sf9细胞的两个序列感染来增强。自对照转染的斑点纯化后称为3.5-2-rev。在重组体在重组体杆状病毒感染的昆虫细胞中H110D表达的分析评定用下列病毒感染Sf9细胞(25cm2瓶中有1×106个细胞)的单细胞层3.5-2病毒、野生型(wt)病毒、表达β-gal的对照病毒，或者不感染。于26℃生长四天后，通过轻轻摇动使单细胞层分离，通过离心分离(2000rpm，10分钟)回收细胞，通过冷冻-解冻三个周期使细胞滤片破裂。将溶胞产物重新悬浮在500μlPBS中并通过微井分析测定25μl等分试样的ApM活性。
将15μl上述溶胞产物的等分试样(相当于3×104个细胞)在7.5%SDS-聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳。然后将一份胶用Comassie blue染色以评定表达的程度。其他的胶进行Western印迹分析。用抗-H110DN(如前所述的)来探查印迹。
结果免疫阳性的克隆分析在克隆M1上纯化的抗体亲合力分析制备对5种抗体阳性克隆之中的每一种特定的亲和提纯抗体，并用它来探测富集H110D提取物的Western印迹。如图8所示，所有5种克隆显然都识别H110D成对物。然而，与λgt11的阴性对照印迹(图8e)相比较，与克隆M1的反应得到最强的信号(图8d)。因此这个克隆被进一步研究。
用克隆M1的Northern印迹分析图9显示了用M1插入物探查的Haemonchus contortus mRNA的Northern印迹分析。在约3.5Kb处识别单一mRNA带。这就具有足够尺寸以便对大约110Kd的蛋白编码。
克隆M1的序列分析用EcoRI限制性消化DNA的分析显示出M1插入是在大约300bp处。将M1片段的DNA序列测定(SEQ ID NO1)并示于图3。该片段包括具有一种在3号碱基处起始的开放读码的295bP。
用克隆B1A的Northern印迹分析图9c显示了用B1A插入物探查Haemonchus contortus mRNA的Northern印迹分析。至于M1，在大约3.5Kb处单一的mRNA带也被识别。
克隆B1A和B2的定序将B1A的克隆定序(SEQ ID NOS2和3)，完全的序列(SEQ ID NO2)和H11-1(SEQ ID NO19)及AustB1(SEQ ID NO6)列成一行示于图5。插入物是484bp.且从第一个碱基起有完全的ORF。用EcoRI由消化所得的B2的三个片段被定序，B2的完全序列是581bp。它与H11-2列成一行示于图4。该序列有一个从位置3到213bp的ORF，与2.5KbPCR的产物序列(SEQ ID NO7)匹配的终止密码子和未转译区。
M1和B1A在E.coli中的表达当亚克隆入一个GST表达载体时，得到的克隆对M1表达38-40Kd融合蛋白，而对B1A表达45kd融合蛋白。上述这些克隆，考虑到谷胱甘肽-S-转移酶的分子量，与这些插入物的预料的大小相一致。两种融合蛋白与对H110DE的亲和提纯抗体在Western印迹上有非常强烈的反应(图11)。这些融合蛋白以不溶性包裹体形式表达。用M1-GST和B1A融合蛋白接种的绵羊中用M1-GST和B1A融合蛋白接种的绵羊中的抗体应答通过对H110D制品的Western印迹分析试验了来自注射融合蛋白绵羊的抗血清。GST-M1和GST-B1A两者增加了专门识别H110D成对物的抗体(图12)。来自阴性对照绵羊的血清不能识别这种H110D成对物。
分离及表征通过用M1或B1A插入物DNA杂交选择的克隆杂交到M1探针上的确认的阴性克隆被称为M1 AUS(SEQ ID NO5)，而杂交到B1A上的克隆被称为AustB1(SEQ ID NO6)。用EcoRI纯化质粒DNA的限制性消化表明插入物大小对M1AUS为约900bp，对AustB1为约1.6kb。如图9b)和9d)所示，在Northern印迹上，被杂交到同样大小的mRNA(大约3.5kb)上的M1AUS和AustB1如同M1和B1A一样。
M1AUS的序列分析M1AUS片段的完全定序可用合成的低聚核苷酸从两端的任一端沿DNA“行走”的方式来实现。所得序列的分析展现了M1AUS插入物是948bp，如图3所示。该序列(SEQ ID NO5)由一个ATG开始(ATG对蛋氨酸编码)，并遍及其整长度有一个开放读码(ORF)。该序列是比在5′端的M1序列更长的19个碱基对，以及比在3′端更长的634bp。为两个克隆(碱基20至314)共有的序列是相同的，只不过在第三个密码子位置上有两个核苷酸差别。将所有可能的读码与各种基本数据比较表明，在1号碱基处由ATG开始的读码与微粒体氨基肽酶族的成员一起共为同源。
AustB1的序列AustB1片段的完全定序可用合成的低聚核苷酸由任一端起沿DNA“行走”来进行。DNA序列(SEQ ID NO6)示于图5。该克隆是1689bp长，并从残基2起有一个ORF。这一序列构成了如图1所示的部分H11-1。这一序列的氨基酸转译表明了氨基肽酶的锌结合位点型的特征。
用M1AUS引物对H110DmRNAs PCR的cDNA的PCR放大使用含有连接物序列的低聚-dT作为引物由Haemonchus contortus mRNA合成cDNA以便于随后的克隆和对DNA的操作。然后，使用以865-885位置为基的合成低聚核苷酸作为5′端引物通过PCR将这一cDNA用于放大M1AUS序列。约2.5Kb的PCR片段被放大。根据已知的mRNA尺寸及哺乳动物氨基肽酶cDNA序列，这近似地是该片段的预期尺寸。
使用靠近M1AUS5′端的引物(30-49碱基)进行第二组PCR反应。在琼脂糖凝胶上检测到四个带。最大的是在3.5kb处，和PCR产生的预料尺寸相符。
来自M1AUS引物的2.5kb和3.5kb PCR产物的克隆和定序将2.5kb和3.5kb的PCR产物克隆，称为2.5PCR(SEQ ID NO7)和3.5PCR(SEQ ID NOS8，14和15，分别针对克隆号为2，10和19)。在Northern印迹上，2.5PCR和3.5PCR(克隆2，3.5PCR-2)以与M1、B1A、M1AUS和AustB1相同的模式(与用以得到mRNA的Haemonchus年龄有关)与大约3.5kb的mRNA杂交(图9e，f)。
以“低聚核苷酸行走”方式进行克隆的完全定序。如图1所示，2.5kb产物的序列是H11-2(SEQ ID NO20)的部分。3.5kb的序列是H11-3(SEQ ID NO21)的主要部分。这两个序列的氨基酸转译(图6所示)包含微粒体氨基肽酶的锌结合型His Glu Xaa Xaa His Xaa Trp(HEXXHXW)的特征。
5′端PCR克隆的定序使用与cDNA克隆AustB12.5PCR和3.5PCR中保存的序列(SEQ ID NO6，7和8)匹配的，与自5′端约1.3kb这些序列的mRNA杂交的引物合成cDNA。这些cDNA在5′端是C-收尾，然后与5′端的普通Anchor(A)引物和3′端的三个对序列AustB1，2.5PCR和3.5PCR克隆2(SEQ ID NOS6，7，8)中每一种特定的引物进行PCR反应。反应各得到预定尺寸的产物，正好在1.3kb之中分别是1301bp(SEQ ID NO9)，1280bp(SEQ ID NO10)和1292(SEQ ID NO11)。所有三种序列在5′端都有未转译区(图2)。全部以相同的已知为Spliced Leader SequenceI(SLI)的22bp序列(5′GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG3′)开始并存在于线虫广泛变种的未转译5′区中(Huang等人，1990)。在SEQ ID NO9和10中，SLI序列紧靠在起始ATG之前，在SEQ ID NO11中，在SLI和起始ATG之间有13bp。所有三种序列都有完全的ORFs。
AustB13′端PCR克隆的定序使用与AustB1(SEQ ID NO6)中1414-1438位置相匹配的特定引物，PCR产物得到如预测的约1.3kb的带。该克隆带的定序产生了序列SEQ ID NOS12和13。它们得到来自1-615bp的ORF和一个基本上未转译的区域。
克隆PCR产物的序列分析图2示出了上述称为H11-1，H11-2和H11-3序列的复合物。图6a示出了由这些复合物预测的氨基酸序列。通过与由CNBr和蛋白水解分裂片段的Edman降解测定的氨基酸的匹配物基本上证实了所存在的DNA序列的预测转译的真实性(图7)。这样，H11S(SEQ ID NO16)的29残基N-末端序列的27残基与来自列基61-90的H11-2相匹配(图7b)。由于H11-3在位置90有天门冬氨酰酶(N)以及H11-1在位置86有亮氨酸(L)(与H11-2中的位置78一致)，所以位置78的缬氨酸(V)和位置90的甘氨酸(G)的匹配物是H11-2的特征。H11SN-末端氨基酸序列的两个残基并不与该处存在的三种H110D序列的任一种相匹配。对在残基540-555的区域中分别与H11-2和H11-1非常相似但有差别的序列PepA和B(如前WO90/11086中所述)的严格匹配物要特别注意。与此相似，在残基450-470区域中，PepD是一种H11-2的严格匹配物，但相似而又有区别的Pep更接近与H11-3匹配。例如，在图6b中，将全长序列(H11-3)之一的转译氨基酸序列与哺乳动物微粒体氨基肽酶的两个序列进行比较。通过将相同的氨基酸加以方框的方法来表示H110D转译与这些氨基肽酶的同源现象。
微粒体氨基肽酶的特征要点是EXXHXW，它起锌结合位点的作用(Jongeneel等人，1989;Vallee等人，1990);这在图6中以星号表示。这一种在H11-1，H11-2和H11-3转译中所存在的序列保存在所有的微粒体氨基肽酶中。为哺乳动物和Haemonchus微粒体氨基肽酶所共有的其他特色是存在一个相对短的细胞内区域，与N-末端和整个潜在的糖基位点相邻的单一横跨膜序列。H11-1，H11-2和H11-3与哺乳动物微粒体氨基肽酶同源的程度(52%-55%的相似性和30-32%的相同性)示于表2。
Southern印迹分析图10示出了用各种H110D cDNA克隆和PCR产物所探查的H.contortus基因组DNA Southern印迹的结果。所有探查都显示了杂交的多重带;这是多基因族的特征。正如所期待的那样，B1A和AustB1如M1AUS和3.5kb PCR一样相互之间具有相似的杂交模式。然而，即使在中等强度的条件下(图10A)，这些模式相互之间也有明显的不同，而且也与用2.5kb PCR探针所观察到的模式不同，反映出这三种cDNA之间不同的同源程度。
与H110D有关的氨基肽酶活性的证明发现微粒体氨基肽酶的活性与含H110D的那些馏分有关，这些馏分是来自超离心分离Thesit提取物的上清液、ConA结合馏分(ConA H110D)以及在MonoQ柱上通过离子交换色谱分离得到的含H110D的馏分(表3)。随着H110D纯度的增加，所有被测底物的比活性增加。
哺乳动物氨基肽酶抑制剂对H110D氨基肽酶活性的作用以供应商(Boehringer Mannheim)所推荐的浓度向ConA H110D加入抑制剂bestatin(它抑制哺乳动物微粒体氨基肽酶)对亮氨酸-对硝基酰苯胺的活性减少约70%。在蛋白酶抑制剂范围内进行一系列实验以测试活性抑制情况。这些并非对金属蛋白酶或氨基肽酶特定的抑制剂对反应速率没有任何抑制作用。已知能影响金属蛋白酶或氨基肽酶的抑制剂确能对反应速率产生作用，如表4所示。最好的抑制剂是5mM菲咯啉。
表4 使用各种蛋白酶对H110D氨基肽酶的抑制作用
1哺乳动物氨基肽酶-A底物2哺乳动物氨基肽酶-B底物H110D的细分馏图13a示出了有关由在MonoQ柱上离子交换色谱分离而来的馏分的活性分布情况，图13b为馏分的SDS-PAGE。
此外，酶的活性与通过再循环自由流动等电聚焦方法而分离的H110D细馏分有关(图14和15)。在pI值较低时(PH4.5)，这些细馏分仅包含SDS-PAGE上看到的构成H110D成对物的较大的带，而在较高值时(pH6.5)，它们仅包含构成H110D成对物较小的带。中间的馏分包含这两种谱带。使用Pharmacia SMARTR仪器在MonoQ上通过离子交换色谱分离也能以单独的馏分得到这种较小的带。所有这些细馏分与针对在由λgt11克隆M1所表达的蛋白质上亲和纯化的H110D的绵羊抗体结合，而由没有插入的的λgt11上所洗脱的抗体不发生结合作用(图14c)。所有的细馏分与标示为TS3/19.7的小鼠单克隆抗体结合(图14c)，这些抗体也与由克隆M1所表达的重组体蛋白质结合。所有这些细馏分都表现出微粒体氨基肽酶活性(图15C)，尽管这种活性在最高和最低pI值时所得到的馏分中较低。这种较低的活性被认为是由于降低的蛋白质浓度，在细分馏过程中pH值的极端值作用或者是为最大活性的较大或较小谱带的存在的需要所致。
接种分离的H110D组分通过自由流动等电子聚焦或者离子交换色谱分离得到分离的较高和较低谱带，如在以下实验中所举例说明的，当给绵羊注射时诱导保护性抗体的生成，以此作为下列实验的范例。30只约六月龄绵羊分成5组，每组6只，以使每组在绵羊的重量范围方面匹配。如Munn等人(1992)和Tavernor等人(1992a，b)所述的，以3份相等的剂量给每只羊注射，在54天中共注射150μg蛋白质。给L组绵羊注射H110D成对物的较低(较小)带，给U组绵羊注射较高的带，给U+L组注射重组的较高和较低带，给D组注射通过在中等pH值下自由流动等电聚焦而得到的两种(未分离的)带，而作为对照的是(C)组马脾铁蛋白(一种抗原性非相关蛋白)。在第三次注射以后3个星期用10000个感染幼虫激惹绵羊，并且在感染后29-31天结束实验。实验结果总结在图16中。注射任何一种细馏分在整个实验期间减少寄生虫卵排出量大约90%，并且减少总虫数63-84%，所有这一切都表明与采用非参数统计分析的对照组相比有显著的差别(p＜0.05)。雌虫数目的减少(70%-88%)比雄虫数目的减少要多，而且不论是雌虫还是雄虫，数量的减少都是明显的(p＜0.05)(除去用重组的较高和较低带注射绵羊，雄虫的数目减少，此时p＜0.07以外)。
接种H11S和H11A通过用弹性蛋白酶处理由天然分子可以获得平截的水溶性形式的H110D(H11S;它保持了其酶活性)。这种形式被发现主要含有ApM状的酶活性，而被消化的弹性蛋白酶片状沉淀的Thesit提取物(H11A)富集了ApA状活性(见表5)。
表5 比率氨基肽酶-M:氨基肽酶-A(亮氨酸-pNA) (α-谷氨酸-pNA)H11OD 1.44:1H11S 26.0:1H11A 0.48:1下列实验表明，用H11S或H11A对绵羊接种可以对Haemonchus激惹或感染产生保护。将大约8月龄的18只绵羊分成3组，每组6只以使每组在绵羊的重量范围方面匹配。在23天期间内如Munn等人(1992)和Tavernor等人(1992a，b)所述以两次相同的剂量提供总量为100μg的蛋白质注射每只绵羊，A组中的绵羊注射H11A，S组中的绵羊注射H11S，而C组绵羊注射马脾铁蛋白(一种抗原上非相关蛋白)以作为一种阴性对照物。在第二次注射后25天用10000个感染幼虫激惹绵羊，并且在感染后34-36天结束实验。图17总结了实验的结果。注射H11S在整个实验期间减少寄生虫卵排出量89%，减少总的幼虫数目76%。注射H11A在整个实验期间减少寄生虫卵排出量98%，减少幼虫总数84%。这些结果表明，与采用非参数统计分析的对照相比有明显的差别(p＜0.05)。
抗体对H110D氨基肽酶活性的抑制作用用从注射了含H110D馏分的个体绵羊中得到的或者从对照绵羊中得到的血清对含有H110D的溶液进行培养。然后采用苯丙氨酸和α-谷氨酸pNAs作为底物对溶液的氨基肽酶活性进行分析。活性的抑制程度与由从其中得到的血清的个体绵羊所显示的保护水平相关(参见图18)。
酶活性的定位对Haemonchus contortus成虫的冻结切片进行氨基肽酶活性的测定，如图19所示，氨基肽酶的活性定位于肠腔表面。在这个位置上亦明显地发现了H110D蛋白质。
利用真核杆状病毒昆虫细胞体系表达H110D(3.5PCR克隆2)氨基肽酶活性在昆虫细胞中的表达收集感染细胞，并使用苯基丙氨酸-，亮氨酸-，蛋氨酸-以及赖氨酸-pNAs作为底物对其氨基肽酶活性进行分析。通过观察，昆虫细胞具有对连接赖氨酸的酰胺键有显著选择性的氨基肽酶活性，使得该分析复杂化。然而，含有表达H110D的细胞提取物以亮氨酸-，蛋氨酸-，和苯基丙氨酸-pNAs这样较佳的顺序另又裂开。
表达的H110D(3.5PCR克隆2)蛋白质的分子量和免疫反应性将感染的或对照细胞提取物样品在7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，而后用Coomassie Blue染色。3.5-2-P3A和3.5-2-P4A感染细胞的溶胞产物都有和H110D，110kd同样尺寸的带，它直接在共表达的分子量为120kd的β-gal下面迁移。在任何阴性对照溶胞产物中不存在这一110kb带(也不在P2A溶胞产物中，它不表达酶活性)。
以完全相同的凝胶作Western印迹分析，并用抗H110DN探查(图21)。对于3.5-2-P3A和3.5-2-P4A所表达的110kb带以及含有ConA H110D的对照印迹中天然H110D成对物都得到非常强烈的特定的阳性免疫反应，而在任何阴性对照印迹中未观察到反应。
权利要求
1.包含一种或多种编码蠕虫氨基肽酶或其抗原部分的核苷酸序列的核酸分子，所述序列基本上相应于全部或一部分图2、3、4或5中所示的核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)，或者编码基本上与任意所述序列同源或与任意所述序列杂交的蠕虫氨基肽酶的序列。
2.包含一种或多种编码能够提高抗蠕虫寄生虫保护性抗体的多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述序列结合了一个或多个抗原决定基编码区，该区来自图2、3、4或5中所示氨基肽酶编码序列(由SEQ ID NOS1-15组成)。
3.包含一种或多种核苷酸序列的核酸分子，所述序列基本上相应于或基本上互补于选自如下克隆序列的一种或多种序列克隆M1、B1A、B1A3′、B2、B1AUS、AustB1、014-015(2.5PCR)、014-872(3.5PCR克隆2)、A-648(B1的5′端)、A-650(2.5PCR的5′端)、A-649(3.5PCR的5′端)、014-178(AustB1克隆2的3′端)、014-178(AustB1克隆3和6的3′端)、014-872(3.5PCR克隆10)和014-872(3.5PCR克隆19)、H11-1、H11-2和H11-3，SEQ ID NOS1-15和19-21，上述序列分别示于图2、3、4和5中，或基本上与任意所述序列同源或与所述序列杂交的序列。
4.一种表达或克隆载体，所述载体包含权利要求1-3中任一项所定义的核酸分子。
5.一种原核或真核细胞，或者转基因的生物，它们含有权利要求1-3中任一项所定义的核酸分子。
6.合成的多肽，所述多肽包含构成一种氨基肽酶或其抗原部分的一种氨基酸序列，所述序列基本上相应于图2、3、4或5所示的全部或部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)，或其相应于蛋白成对物H110D的合成多肽以外的功能等同的变异体，或者是相应于公开在WO90/11086中任一个体多肽序列的合成多肽。
7.合成的多肽，所述多肽包含构成一种氨基肽酶或其抗原部分的一种氨基酸序列，该序列基本上相应于图2、3、4或5所示全部或部分核苷酸序列(SEQ ID NOS1-15)，或其基本上无其他Haemonchus contortus组分的功能上等同的变异体。
8.权利要求6或7的以融合多肽形式的合成多肽，该多肽包含一种与权利要求6或7所定义的所述氨基酸融合的附加多肽。
9.一种制备权利要求6-8中任一项所定义的合成多肽的方法，所述方法包括在所述多肽得以表达的条件下，将含有权利要求1-3任一项所定义的核酸分子的原核或真核细胞进行培养，从而回收制得的所述多肽。
10.一种能在人体或非人类动物中刺激抗蠕虫寄生虫免疫应答的疫苗组合物，所述组合物含有至少一种权利要求6-8中任一项所定义的合成多肽，或在其中已插入权利要求1-3中任一项所定义的核酸分子的病毒或宿主细胞，以刺激被插入的核酸分子编码的多肽的免疫应答，以及一种可药用的载体。
11.一种权利要求1-3中任一项所定义的核酸分子或权利要求6-8中任一项所定义的合成多肽制备一种刺激人体或非人类动物中抗蠕虫寄生虫免疫应答的疫苗组合物的用途。
12.一种刺激人体或非人类动物中抗蠕虫寄生虫免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求10所定义的疫苗组合物向所述动物给药。
13.一种低聚糖，该糖具有下述结构
14.权利要求13的低聚糖，该糖具有下述结构
15.权利要求13或14的低聚糖，所述低聚糖与权利要求6-8中任一项所定义的合成多肽相联接。
全文摘要
本发明提供含有编码蠕虫氨基肽酶核苷酸序列的核酸分子，及其抗原片段和功能上等同的变异体，将它们制成疫苗用于抗蠕虫寄生虫的用途，以及被这些序列编码的合成多肽。
文档编号C07K19/00GK1084563SQ9310708
公开日1994年3月30日 申请日期1993年5月8日 优先权日1992年5月8日
发明者M·格哈姆, T·S·史密斯, E·A·牧恩, D·P·诺克斯, J·J·奥利弗, S·E·牛顿 申请人:农产品研究委员会