一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及具有k脯氨酸-4-居基化酶 活性的蛋白、编码该蛋白的基因和包含该酶或其编码基因的基因工程菌W及它们在生产反 式-4-居基-k脯氨酸中的应用。
【背景技术】
[0002] 反式-4-居基-k脯氨酸（Trans-4-Hy化O巧-kproline, 4HP)是一种具有独特生 理活性的氨基酸，易溶于水。医药方面，4HP作为原料可用于合成碳青霉帰类抗生素、消炎 药、抗肿瘤、降压药及新型胃药等。化妆品方面，由于4HP具有抗氧化和抗福射等作用，许多 高级化妆品中都添加4HP W期延缓衰老。动物饲料方面，添加4HP可防止营养不良现象。 4HP还可W应用于香味料及抗氧化、防腐和保鲜剂等。
[0003] 反式-4-居基-k脯氨酸可W通过k脯氨酸-4-居基化酶催化k脯氨 酸居基化来生产，目前用于生产心脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌巧.coli)等，但是送些菌都没有编码k脯氨 酸-4-居基化酶的基因。因此，挖掘能够在k脯氨酸生产菌中表达并具有高效催化活性的 k脯氨酸-4-居基化酶是实现反式-4-居基-k脯氨酸工业生产的关键。 「00041
[0005] k脯氨酸-4-居基化酶的催化反应
[0006] 日本协和发酵公司通过筛选得到一株脯氨酸4-居基化酶酶活最高的指抱囊 菌，并命名为指抱囊菌RH1，测序获得脯氨酸4-居基化酶基因序列（CN96190335);将指 抱囊菌RHl脯氨酸4-居基化酶基因进行密码子优化后置于一个强启动子的调控下，导 入到大肠杆菌中，添加外源k脯氨酸，在发酵罐中转化10化后，反式-4-居基-心脯 氨酸的积累量达到41g/l，转化效率只有87 % (Shibasaki，Takeshi, Hideo Mori, and Akio Oz曰ki. "Enzym曰tic production of tr曰ns-4-hydroxy-L-proline by regio-曰nd stereospecific hydroxyl曰tion of L-proline. "Bioscience, biotechnology,曰nd biochemistry 64. 4(2000) :746-750)。为了进一步降低反式-4-居基-k脯氨酸的生产 成本，日本协和发酵公司又将密码子改造的指抱囊菌RHl脯氨酸4-居基化酶基因导入到 k脯氨酸生产菌中，在W葡萄糖为底物的发酵培养基中培养9化后反式-4-居基-k脯 氨酸产量达到25g/l，发酵过程k脯氨酸最高积累量达到7. 8g/l，初步实现了居脯氨 酸的从头合成（CN97117929. 8 和 Shibasaki,Takeshi 等，"Construction of a novel hydroxyproline-producing recombinant<i〉Escherichia coli</i〉by introducing 曰 proline 4-hydroxyl曰se gene. "Journ曰I of bioscience 曰nd bioengineering 90. 5(2000):522-525)〇
[0007] 然而，目前报道的具有工业应用前景的k脯氨酸-4-居基化酶只有来源于指抱囊 菌RHl的脯氨酸4-居基化酶。指抱囊菌属于放线菌，是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌， 指抱囊菌RHl脯氨酸4-居基化酶基因的GC含量为74 %，并且含有大肠杆菌稀有密码子。因 此，指抱囊菌的野生型k脯氨酸-4-居基化酶在原核生物，例如大肠杆菌中重组表达时主 要W没有活性或活性很低的包涵体形式存在，经过密码子优化后的突变型k脯氨酸-4-居 基化酶在表达量和催化性能上依然较差。
[0008] 因此，本领域急需能够在反式-4-居基-k脯氨酸生产菌株中高效表达且具有 高催化性能的新型k脯氨酸-4-居基化酶，从而有助于提升从葡萄糖生产反式-4-居 基-心脯氨酸的水平。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种新型k脯氨酸-4-居基化酶，该新型k脯氨酸-4-居 基化酶能够在反式-4-居基-k脯氨酸生产菌株中高效表达且具有高催化性能。
[0010] 在第一方面，本发明提供一种用于催化k脯氨酸产生反式-4-居基-k脯氨酸的 k脯氨酸-4-居基化酶，所述k脯氨酸-4-居基化酶为W下蛋白：
[0011] (a)氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白；或
[001引 化）由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添 加而形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[001引在具体的实施方式中，化）所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经 过1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的取代、缺失或添 加而形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[0014] 在具体的实施方式中，化）所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经 过1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形 成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[001引在具体的实施方式中，化）所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的 C末端和/或N末端添加或缺失1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个 氨基酸残基而形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[0016] 在优选的实施方式中，本发明提供一种用于催化心脯氨酸产生反式-4-居 基-k脯氨酸的k脯氨酸-4-居基化酶，所述k脯氨酸-4-居基化酶为氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白。
[0017] 在具体的实施方式中，所述蛋白在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutami 州m)、大肠杆菌化coli)、黄色短杆菌度revibacterium fIavum)、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽抱杆菌度acillus subtilis)中表达。
[0018] 在具体的实施方式中，所述蛋白在大肠杆菌巧.coli)中表达。
[0019] 在第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码本发明第一方面 所述蛋白的核巧酸序列。
[0020] 在具体的实施方式中，所述表达载体包含SEQ ID N0:2所示核巧酸序列。
[0021] 在第H方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述 的表达载体，或基因组上整合有编码本发明第一方面所述蛋白的核巧酸序列，或基因组上 整合有SEQ ID NO:2所示核巧酸序列。
[0022] 在具体的实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glu tami州m)、大肠杆菌化coli)、黄色短杆菌度revibacterium flavum)、粘质沙雷氏 菌（Serratia marcescens)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽抱杆菌 (Bacillus subtilis)。
[0023] 在优选的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌巧.coli)。
[0024] 在优选的实施方式中，所述宿主细胞中不受心脯氨酸反馈抑制或心脯 氨酸反馈抑制减弱的谷氨酸激酶（Glutamate-5-kinase)和谷氨酸半醒脱氨酶 (Glutamate-semialdehyde dehy化Ogenase)的活性增强。
[0025] 在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的蛋白或本发明第二方面所述的 表达载体或本发明第H方面所述宿主细胞的用途，用于催化k脯氨酸产生反式-4-居 基-k脯氨酸及其衍生物。
[0026] 在第五方面，本发明提供一种生产反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物的方法，所 述方法包括W下步骤：
[0027] 1)利用本发明第H方面所述的宿主细胞或本发明第一方面所述的蛋白进行发酵 或转化，从而产生反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物；和
[0028] 2)从1)的体系中获得反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物。
[0029] 在具体的实施方式中，所述生产反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物的方法是W k脯氨酸为前体生产反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物。
[0030] 在具体的实施方式中，所述生产反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物的方法是W 葡萄糖或淀粉等糖类水解的葡萄糖为前体生产反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物。
[0031] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0032] 图1显示了本发明克隆的基因在大肠杆菌中表达后的蛋白电泳图；其中，1为大肠 杆菌化21 (pET21a)无目的蛋白表达的对照，2为大肠杆菌化21 (pSWl)表达目的蛋白。
[003引 图2显示了本发明的pSW2和pSW3质粒的构建图谱。
【具体实施方式】
[0034] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现了一种新型心脯氨酸-4-居基化 酶及其编码基因，该基因的GC%含量适中，可W在基因工程菌中可溶性表达并维持高催化 活性。在此基础上完成了本发明。
[0035] k脯氨酸-4-居基化酶
[0036] 本文所用的术语"k脯氨酸-4-居基化酶"或"本发明的k脯氨酸-4-居基化酶" 或"本发明的酶"具有相同的意义，在本文可W互换使用，均是指具有催化k脯氨酸产生反 式-4-居基-k脯氨酸活性的蛋白。在具体的实施方式中，本发明的k脯氨酸-4-居基化 酶表示氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID NO:2所示。
[0037] 本文所用的术语"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物 质，原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核巧酸和多肤是没有分离 纯化的，但同样的多聚核巧酸或多肤如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离 纯化的。因此，本文所用