一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种可应用于临床级的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(MSC)是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。它首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织中分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。
[0003]作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制，分离过程简单等特点。而骨髓来源的MSC取材难，细胞增殖和分化能力受供体年龄限制，异体移植存在免疫排斥强等缺点，所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。最近有研究发现，人绒毛膜间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，不会发生免疫排斥反应，无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。
[0004]绒毛膜来源于孕妇产后的胎盘组织，具有一定的弹性，易于从胎盘组织中剥离，因此绒毛膜被公认为是间充质干细胞来源之一。
[0005]现有技术中，制备绒毛膜间充质干细胞的方法存在的不足之处:
目前，绒毛膜间充质干细胞的分离方法有组织块培养法和酶消化法两种，应用较多的分离方法是酶消化法，酶消化法具有分离培养周期短等优点，但酶消化法所利用的酶种类繁多，多数利用胰酶和胶原酶分步处理的消化方法，耗时长，步骤繁琐，消化过程中还会对细胞造成较大伤害，使细胞活力减弱，而且分离过程中使用了多种酶和血清，引入了多种外源物质，对间充质干细胞应用于临床造成阻碍。组织块培养法获得的间充质干细胞具有细胞纯度高，细胞活力强等优点，但分离成功率低，培养周期长，而且培养中加入胎牛血清等动物源性成分，增加了培养成本，也引入了外源动物蛋白，使培养的细胞不利于临床应用。在绒毛膜剥离过程中不会去除附着在绒毛膜上的毛细血管，使得分离获得的细胞种类复杂，参杂了许多内皮细胞和血细胞，影响间充质干细胞的正常生长过程。胎盘采集及绒毛膜分离的现有技术还缺少有效减少污染的措施，防污染措施作用有限，原代培养污染率高，缺少从源头开始减少污染的方法，目前在培养环节添加抗生素只能在培养过程中抑制污染菌繁殖，不能有效减少污染;培养体系中一直添加抗生素，不利于绒毛膜干细胞的临床应用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药技术领域亟需解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种细胞均一、稳定、细胞活性好、培养周期短、可应用于临床的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤:
步骤(I)，人胎盘组织的采集:人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪防止污染，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8°C环境中，使胎盘组织处于一个低渗、低温的缓冲环境中，保持组织中间充质干细胞的活性；
所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；
步骤(2)，绒毛膜组织的剥离:在无菌环境下，将步骤(I)得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；
步骤(3)，绒毛膜组织的洗涤与消毒:先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤(2)得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，接着依次用含有100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液和甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液，达到即有效防止污染又清除抗生素的残留；
步骤(4)，绒毛膜组织的剪碎:将经步骤(3)清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，使间充质干细胞处于温和的环境中，按照每1g绒毛膜组织加入l-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成Imm3大小的组织块；
步骤(5)，人绒毛膜间充质干细胞原代培养:将步骤(4)得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，使组织块牢固的贴于培养瓶底部，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%C02,37 °C的细胞培养箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；
步骤(6)，人绒毛膜间充质干细胞传代培养:待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基(即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是I: 5)，以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%C02、37 °C的细胞培养箱中培养；
培养过程中注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或PH值不符时应及时进行补充或更换新的上述无血清培养基；
步骤(7)，人绒毛膜间充质干细胞的冻存:当步骤(6)培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用(即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是1:5)，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中；
步骤(8)，冻存细胞缓慢降温:将步骤(7)得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-80 V冰箱过夜放置，第二天转入-196 °C液氮罐中长期储存；
步骤(9)，冻存细胞的复苏:从步骤(8)的液氮罐中取出冻存管后，置于37°C水浴锅中迅速融化，1200-1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%C02、37°C细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%C02、37 °C细胞培养箱继续培养。
[0008]作为本发明进一步的方案:步骤(I)所述的暂存于2_8°C环境中的时间不能超过24h0
[0009]作为本发明进一步的方案:步骤(7)所述的冻存保护剂为DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液。
[0010]作为本发明进一步的方案:步骤(7)所述的将重悬溶液置于冻存管中时，采用规格为2ml的冻存管，每个冻存管中加入重悬溶液1.5-1.8ml。
[0011]作为本发明进一步的方案:步骤(6)和步骤(7)中用重组细胞胰酶溶液消化细胞前，先用PBS清洗细胞以除去培养基。
[0012]本发明所有的培养过程中，应注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或PH值不符时应及时进行补充或更换新的上述无血清培养基。
[0013]本发明使用重组细胞胰酶溶液消化细胞的时候，重组细胞胰酶溶液的用量没有具体限制，只要能完成消化即可，具体可根据重组细胞胰酶溶液的说明书和实际情况(细胞的数量及培养瓶等)来确定。
[0014]本发明加入培养基重悬细胞时，培养基的加入量没有具体限制，只要能重悬细胞即可，具体可根据实际情况中细胞的数量及培养瓶的大小来确定。
[0015]本发明中用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基也可自行配制，将间充质干细胞无血清培养基、二甲基亚砜和右旋糖酐按体积比为8:1:1，混匀，即得。
[0016]本发明绒毛膜清洗采用了青霉素、链霉素、甲硝唑注射液，对分娩过程中带有霉菌、细菌的绒毛膜处理非常有效，可大大减少因霉菌、细菌污染造成的间充质干细胞分离培养不合格的几率。
[0017]本发明采用组织块培养法，不使用血清，未引入外源动物蛋白，使培养的细胞更利于临床应用。
[0018]本发明的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，具有如下优势:
1)避免污染，从采集到分离层层把关有效减少霉菌、细菌的污染几率；
2)明确绒毛膜取材要求:剪取脐带周围附近的绒毛膜层，并彻底去除绒毛膜下层的毛细血管，获得活性较好、种类单一的间充质干细胞；
3)采用组织贴壁法:分离过程中不使用胰酶和胶原酶进行消化，对间充质干细胞无损伤，细胞活性较好，操作过程中节约了酶消化时间，耗时短、操作流程简单，相比于酶消化法，每次分离可节约50%的时间；
4)使用间充质干细胞无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞可按此方法从PO代