一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于厮带血造血干细胞扩增的培养体系 及其应用。
【背景技术】
[0002] 造血干细胞移植是治疗白血病和淋己瘤等恶性肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾 病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的最有效治疗方法之一。骨髓中造血干细胞 (服C)数量较低，移植后难W在患者体内有效进行造血重建，送也成为HSC临床应用的一个 瓶颈，而且约有30-40%的患者由于找不到相同HLA配型的供者而失去了治疗的机会，厮带 血（umbilical cord blood, UCB)是除骨髓和外周血干细胞外的另一种重要造血干细胞来 源，它的优点是采集不影响供者、受巨细胞病毒（CMV)和邸病毒污染机会小、移植后急慢性 移植物抗宿主病（GVHD)发生率低于成年供者的骨髓移植、可W建立厮带血库，随时提供移 植所需要的HLA相合的干细胞。尽管UCB具有诸多优点。但是由于一份厮带血所含的细胞 数有限，送大大限制了其在临床的广泛应用。体外扩增是解决UCB送一缺陷的重要方法，因 而优化UCB造血干/祖细胞化SPCs)的体外扩增方案极为迫切。
【发明内容】
[0003] 基于上述原因，申请人为克服现有技术的不足，提供一种更好地提高造血干细胞 在体外的生长速度和扩增效率W及CD34+CD45RA、CD34+LKS、CD34 LKS的比例的培养体系。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种通过在体外培养厮带血细胞的体系中加 入不同的细胞因子和小分子化合物，从而能够更好地提高造血干细胞在体外的生长速度和 扩增效率 W及 CD：M+CD45RA、CD：M+LKS、CD：M LKS 的比例。
[0005] 本发明通过下述技术方案实现的。
[0006] 一种用于厮带血造血干细胞扩增的培养体系，该培养体系包括AIM-V培养基、 SCF、Flt-3L，G-CSF，比-3, StemRegenin(SRl)，UM171，血小板裂解液。
[0007] 其特征在于各种细胞因子的组合和小分子化合物的联合应用。
[0008] 所述的用于厮带血造血干细胞扩增的培养体系，各组分的含量如下：
[0009]
[0010] 所述血小板裂解液的制备过程；采集的厮带血40~150ml W 2:1比例缓慢加入盛 有淋己分离液的50ml离必管中，在4~25度温度下，1500-3000巧m，离必10-20min，上层 为富含血小板血浆，采血袋或采血管中采用肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的45~ 50%。富含血小板的血浆放置于-80度超低温冰箱冻存，12-24h后迅速取出放置25-37度 水浴中复苏，如此反复2-5次。于4-25度W 2000~5000巧m离必10-30min，取上清液， 0. 22 U m过滤，W 0. 2-0. 5%的浓度添加到厮带血造血干细胞扩增体系中。
[0011] 其中化合物SRl和UM171的组合，浓度分别为IOO-1000 nM和lO-lOOnM。
[001引所述的用于厮带血造血干细胞扩增的培养体系，其中Angiopoietin-Uke protein 3 的添加，浓度为 30-200ng/mL。
[0013] SCF是一种作用于最早期造血干/祖细胞的造血细胞因子，在维持造血细胞存活， 促进造血细胞增殖和分化，调控各系造血细胞的生长发育中起着重要作用，而其它造血细 胞因子如G-CSF、Flt-化等都是作用于较晚期或晚期定向增殖分化的细胞。SCF单独作用 刺激造血细胞增殖和促进克隆形成能力都微弱，而与其它细胞因子有明显协同促进造血功 能等作用。
[0014] 1993年化Od等首先提出富血小板血浆，并发现富血小板血浆含丰富的血小板，其 数目比全血高3倍W上。血小板中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子PDGF-AB， 转化生长因子目TGF-0，类膜岛素生长因子IGF,表皮生长因子EGF，血管内皮生长因子 VEGF等，分泌后可促进细胞的分裂和增殖、增加胶原的合成、激发血管长入和诱导细胞分 化，本发明采用血小板裂解液培养造血干细胞，不仅为造血干细胞的生长提供了生长环境， 降低了培养体系中所需细胞因子的用量，也降低了使用FBS给临床应用带来的风险。
[0015] 嘿岭衍生物StemRegenin (SRl)化合物被认为可在体外促进服PC扩增。在体外培 养人厮带血来源CD34+细胞时加入SRl及细胞因子SCF、TP0、Flt化、IL-6共培养5周后，与 相应对照组相比，CD34+细胞增加了 47倍，相同条件下培养人外周血来源CD34+细胞3周即 可使CD34+细胞增加73倍。而一旦去除了 SRl后，细胞则迅速发生分化。通过集落形成实 验表明，加入SRl培养后可显著提高各系细胞集落形成单位（CFU)形成。另外，值得注意的 是，SRl仅对人、猴、狗来源的HSPC发挥作用，而对小鼠来源HSPC无扩增作用，提示SRl的 作用机制可能存在种属特异性。将用送种方法扩增的CD34+细胞植人免疫缺鼠体内，发现 NOD-SCID重建细胞（SRC)增加了 17倍，并且均可保持多系细胞长期重建能力。送也是现有 小分子化合物中体外扩增HSPC效果最为显著的小分子化合物。
[0016] 近期研究表明，SRl可抑制细胞色素 P4501B1 (CYPlBl)和香姪受体抑制物（AHRR) 的表达，两者在转录水平均受到芳香姪受体（AhR)的调节，证明SRl可能作为一种枯抗剂作 用于AhR信号通路。芳姪受体（AhR)枯抗剂和配体兴奋剂可促进人厮带血细胞体外扩增， 送些细胞移植入免疫缺陷型小鼠体内后，小鼠的重建造血能力可维持16周。
[0017] SRl的分子结构式：
[0018]
[0019] 与嘿岭衍生物类似，研究发现了一个化学相关的小分子家族嚼巧剛巧分子UM171， 它们可W在免疫缺陷型小鼠体内扩增造血干细胞，并维持重建造血功能长达6个月，此化 合物可独立抑制芳姪受体，从而更大限度地是造血干细胞发挥再生潜能。
[0020] 嚼巧剛巧UM171的分子结构式如下：
[0021]
[0022] 造血干祖细胞可细分为免疫表型为CD34 LKS的长期造血重建的干细胞化T-服C)、 免疫表型为CD34+LKS的短期造血重建的干细胞（ST-服C)和免疫表型为LKS-的祖细胞。服C 不表达各系特异性抗原Lin,包括B-G-M-T等度细胞分化抗原B220、粒细胞分化抗原Gr-I、 单核细胞分化抗原Mac-UT细胞分化抗原CD4和CD8)，但高水平表达Sca-I和C-kit，简称 LKS(Lin-Sca-l+-C-kit+)。服C功能在移植模型中可W得到证实，CD34 LKS在经照射处理 的小鼠体内能重建长期造血，具备干细胞自我更新的特性，其自我更新能力可保持于整个 生命过程。CD34+LKS在造血发育过程中更成熟，自我更新能力只能维持约数周的时间。因 此，在维护和扩增长期造血干细胞化T-HSCs)时，大量扩增此种祖细胞具有很好的发展前 景。不幸的是，多数扩增系统提供的数据显示，W长期造血干细胞化T-HSCs)的丢失来获取 祖细胞的扩增，送样就增加了晚期移植失败的风险。
[0023] 血管生成素样蛋白（ANGPTL)是近年来发现的一类新的分泌性糖蛋白。虽然 ANGP化与血管生成素（Ang)在组成上具有一定的同源性，也具有相似的结构域，但在功 能上与Ang又有明显的不同。已有大量研究数据证实，在Sca-rCD45+造血干细胞体外培 养过程中，血管生成素样蛋白An甜tl3的添加，不仅能够显著刺激长期再生造血干细胞 (LT-服C)的增殖，还对短期造血干细胞（ST-服C)的增殖有一定的作用。
[0024] 本发明所述AIM-V培养基购自life technology公司，所述SCF购自peprotech 公司，所述Flt-：3L购自peprotech公司，所述G-CSF购自peprotech公司，所述IL-3购自 口巧1'〇16油公司，所述5161111?6旨6]1；[]1(51?1)购自美国36116。4公司，所述刪171由加拿大蒙特 利尔大学Guy Sauvageau教授实验室赠予，所述ANGPTL3购自P巧；TOtech公司。
[0025] 本发明提供的血小板裂解物的制备及使用方法具有W下特点；（1)本发明提供的 方法制备的培养基不需要添加 FBS，亦可支持造血干细胞的扩增培养，在临床应用时降低 了异体血清带来的过敏反应或变态反应。（2)血小板裂解后不仅释放存在于血小板内部 的生长因子，而且去除了细胞结构并降低了免疫原性，为异体移植提供了条件，具有比富 小板血浆更为广阔的前景。血小板裂解物中含有多种生长因子，如TGF、IGF、PDGF、VEGF、 FGF等，更能支持造血干细胞的生长，降低了扩增造血干细胞所需要的细胞因子的用量的 1/2~-1/3。（3)本发明制备的血小板裂解液的制备方法不同于常规的制备，节省了操作步 骤，分离效率更高。
[0026] 本发明为了提高扩增体系中CD34+LKS、CD34 LKS的比例，添加了血管生成素样蛋 白 3(Angiopoietin-l;Lke protein 3)，浓度为 30-200ng/mL。
[0027] 本发明为了提高扩增体系中CD34+CD45RA的比例及扩增倍数，添加了小分子化合 物SRl和UM171的组合，浓度分别为IOO-1000 nM和lO-lOOnM。
[0028] SCF 即为 stem cell factor,干细胞生长因子；Flt-3L 即为 FMS-Iike tyrosine kinase 31 igand, FMS 样酪氨酸激酶 3 配体；G-CSF 即为 Granuloc}fte colony-stimulating factor,粒细胞集落细胞刺激因子；比-3即为Interleukin 3,白介素-3 ;SR1即为 StemRegenin-I,嘿岭霉素衍生物，是一种小分子杂环化合物；UM171是一种嚼巧剛巧分 子，被命名为UM-171;Angiopoietin-l化e protein 3为血管样生成蛋白3;PDGF-AB即 为Platelet-derived growth factor-AB,血小板衍生生长因子AB ;TGF-目即为转化生 长因子目，Transforming growth factor beta ;VEGF即为血管内皮生长因子，Vas州Iar endothelial growth factor ;IGF 即为类膜岛素生长因子，Insulin-Uke growth factor; EGF 即为表皮生长因子，Epidermal growth factor。
【附图说明】
[0029] 1、图1是本发明培养体系与传统培养体系扩增培养造血干细胞CD34+CD45RA的 比例变化曲线。其中横坐标代表天数，纵坐标代表CD34+CD45RA-细胞的百分比； ……代表本发明培养系统，代表传统培养系统。
[0030] 图2是本发明培养体系与传统培养体系扩增培养造血干细胞CD34+LKS细胞的百 分比变化情况。其中横坐标代表不同天数，分别为第4天、第12天、第15天，纵坐标代表 CD34+LSK细胞的百分比；□代表本发明培养系统，踩代表传统培养系统。
[0031] 图3本发明培养体系与传统培养体系扩增培养造血干细胞CD34 LKS细胞的百分 比变化情况。其中其中横坐标代表不同天数，分别为第4天、第12天、第15天，纵坐标代表 CD34 LSK细胞的百分比；□代表本发明培养系统，湯.代表传统培养系统。
[0032] 图4本发明培养体系与传