一种从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒，由A液和B液组成，其中A液：0.2-0.5mmol/L人身皂苷，15-25%羟乙基淀粉溶液，5-20mmol/L PBS，pH7.0；B液：密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。本发明的试剂盒使用方法简单，条件温和，制备的间充质干细胞杂质少，活性高，安全性好，产品生产成本低。
【专利说明】
一种从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒。【背景技术】
[0002] 干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。间充质干细胞(MCS)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，体外贴壁呈成纤维样细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪细胞，可以分泌大量具有免疫调节、造血支持、促进血管生成、趋化组织损伤修复等生物活性的细胞因子和生长因子。
[0003] 间充质干细胞可以从常用的四种来源取得:胚胎(主要用于基础研究)，胎盘及其附属物，骨髓，成体组织(包含外周血)。目前用于临床干细胞来源主要有三种:自体外周血、 自体骨髓、胎盘及其附属物。研究采用生育来源的MSCs应具有更广阔应用前景和更优的治疗效果。其优势在于:本身是生育废弃物，来源充足，容易获得；细胞年龄轻、分化能力强， 未有其他成人干细胞受到环境、辐射等侵害，品质纯净；干细胞旁分泌功能强大，因此对机体发挥的营养调节和免疫调节作用比其他成体干细胞更强。
[0004] 间充质干细胞在临床上虽然有广泛的应用前景，但现有的分离方法存在种种不足，例如分离步骤复杂，耗时冗长，分离成本高，制备的间充质干细胞纯度低，活性差等，限制了其临床应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对上述现有问题提供一种从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒。本发明的试剂盒使用方法简单，条件温和，产品中的活性成分含量高，活性高，安全性好，产品生产成本低，使医生在临床上方便、安全、规范地获取间充质干细胞来治疗相关疾病，便利推广干细胞治疗技术。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明提供一种从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒， 所述试剂盒由A液和B液组成，八液:0.2-0.5臟〇1/1人参皂苷，15-25%羟乙基淀粉溶液，5-20臟〇1/1?85，口117.0 B液:密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。
[0007] 优选的，上述试剂盒的特征在于:A液:0.3 mmol/L人参皂苷，20%羟乙基淀粉溶液，10 mmol/L PBS，pH 7.0 B液:密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。
[0008] 另一方面，本发明提供上述从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒的使用方法， 包括如下步骤:1)取含有10-50 U/mL肝素的脐带血与A液按2:1的体积比混匀；2)将离心管置于离心机中，1000-2000 rpm离心15-30分钟，离心后弃去上清液，用生理盐水清洗离心管，并用20-30 mL生理盐水重悬细胞沉淀；3)将20-30 mL B液缓慢加入新的50 mL离心管中，再将步骤2)得到的细胞液沿管壁缓慢加入B液上面，2000-3000 rpm离心20-30分钟；4)离心后管内可见分为四层:最上层是血浆，第二层为白膜层，主要含间充质干细胞， 第三层为分离液层，第四层为粒细胞和红细胞，用吸管轻轻插入，穿过血浆层至白膜层，沿管壁周缘吸出白膜层细胞，转入另一 50 mL离心管中；5)向步骤6)获得的细胞液中加入5倍体积的生理盐水，混匀，1000-2000 rpm离心 15-30分钟，弃去上清液，将沉淀的细胞团用生理盐水清洗2次，得到间充质干细胞。
[0009]本发明的试剂盒具有如下优点:1.使用方法简单，条件温和，制备的间充质干细胞杂质少，活性高，安全性好，产品生产成本低。
[0010]2.使得医生在临床上方便、安全、规范地获取间充质干细胞，解决临床上获取干细胞的瓶颈，推广干细胞治疗技术。【具体实施方式】
[0011]实施例1从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒由A液和B液组成，A液:0.2 mmol/L人参皂苷，20%羟乙基淀粉溶液，5 mmol/L PBS，pH 7.0 B液:密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。
[0012]实施例2人脐带血的采集，包括如下步骤:1)打开采血袋包装，关闭采血袋与穿刺针之间的管路上近针头处的卡子，血袋置于一芳备用。
[0013]2)胎儿娩出后两把止血钳分别在距脐蒂侧约5cm和8cm处夹闭脐带，在两把止血钳之间断脐带，胎儿脱离母体。
[0014]3)在脐带母体侧断端确定脐静脉穿刺采血部位，将采血袋穿刺针头上的针帽沿顺时针方向拧开后，沿脐静脉断端针头斜面向下穿刺入脐静脉，可用一把止血钳将针头固定在脐带上。
[0015]4)打开采血袋与针头间输液管上的卡子，脐带血将注入采血袋，同时持续轻摇采血袋使抗凝剂与脐血充分混合，保持采血袋处于低位。为增加采血量可自胎盘侧向断端挤压脐带。采血量以l〇〇ml以上为佳。
[0016]5)采血至脐带血不能流出时，在拔针前用近针头处和近采血袋处的两只卡子将采血袋与穿刺针之间的管路再次关闭，拔针。
[0017]6)在近针头处卡子与针头之间剪断管路去掉针头，并用热合机封口。
[0018]7)将采集的脐血置于4-10° C冰箱中暂存，无冰箱室内暂存不能高于24° C。
[0019]实施例3从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒的使用方法，包括如下步骤:1)取含有10-50 U/mL肝素的脐带血与A液按2:1的体积比混匀；2)将离心管置于离心机中，1000-2000 rpm离心15-30分钟，离心后弃去上清液，用生理盐水清洗离心管，并用20-30 mL生理盐水重悬细胞沉淀；3) 将20-30 mL B液缓慢加入新的50 mL离心管中，再将步骤2)得到的细胞液沿管壁缓慢加入B液上面，2000-3000 rpm离心20-30分钟；4)离心后管内可见分为四层:最上层是血浆，第二层为白膜层，主要含间充质干细胞， 第三层为分离液层，第四层为粒细胞和红细胞，用吸管轻轻插入，穿过血浆层至白膜层，沿管壁周缘吸出白膜层细胞，转入另一 50 mL离心管中；5)向步骤4)获得的细胞液中加入5倍体积的生理盐水，混匀，1000-2000 rpm离心 15-30分钟，弃去上清液，将沉淀的细胞团用生理盐水清洗2次，得到间充质干细胞。
[0020] 实施例4将10份脐血分成2组，每组5份标本。A组为本发明干细胞分离试剂盒组(采用本发明试剂盒的A液和B液)。B组为市售干细胞分离试剂盒组，采用市售干细胞分离试剂盒(骨髓、 脐带血细胞处理试剂盒，北京盛宏业医药科技发展有限公司)，按照试剂盒说明书提供的方法分离。对最后收获的产品经流式细胞仪分析，本发明试剂盒从人脐带血回收间充质干细胞的比率比市售试剂盒高30%(p〈0.05)，可见本发明试剂盒取得了显著的技术效果。
【主权项】
1.一种从人脐带血分离间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒由以下两种溶液组成: △液:0.2-0.5臟〇1/1人参皂苷，15-25%羟乙基淀粉溶液，5-20臟〇1/1?834117.0 B液:密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由以下两种溶液组成:A液:0.3 mmol/L人身皂苷，20%羟乙基淀粉溶液，10 mmol/L PBS，pH 7.0B液:密度为1.077g/mL的葡聚糖-泛影葡胺溶液。
【文档编号】C12N5/0775GK105985929SQ201510099171
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月6日
【发明人】王玉
【申请人】王玉