一种人脐带间质干细胞分离并诱导为软骨细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及间充质肝细胞技术领域，具体地，为一种人脐带分离培养间质干细胞 并诱导为软骨细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] 关节软骨损伤在临床上较为常见，由于关节软骨无血液供应和神经支配，自身修 复能力很差，关节软骨一旦损伤即很难修复，如不及时治疗，继而会发生不可逆的病理变 化，造成关节的退行性改变(关节炎），严重影响患者的生活质量，临床症状主要表现为关节 活动后肿胀、疼痛，上下楼、下蹲困难。
[0003] 间质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，间质干细胞存在于人体多种组织 中，尤其是脐带、胎盘、骨髓、脂肪组织，这种干细胞在不同的诱导条件下可分化成许多不同 的组织，如骨组织、软骨组织、脂肪组织、内皮组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织等，2002 年Wakitani等首次报道间质干细胞可定向到软骨细胞用于治疗软骨损伤。
【发明内容】
[0004] 本发明采用人脐带间质干细胞(hUC-MSCs)其目的在于提供一种生长速度快、方法 简单，费用低，生物安全性高的软骨细胞培养方法。本发明是采用如下方案实现的：
[0005] -种人脐带间质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤，
[0006] (1)原代培养：取预处理过的人脐带沃顿胶组织，进行原代培养，原代培养采用 MesenGro培养液培养，MesenGro培养液包括MesenGro培养基、胎牛血清、青霉素和/或链霉 素双抗、阿卡米星、成纤维细胞生长因子，带细胞游出后，用胰蛋白酶消化离心，得到原代人 脐带间质干细胞；
[0007] (2)传代培养:对得到的原代细胞置于新的MesenGro培养液进行传代培养，待细胞 长至80%~90%融合时，用胰蛋白酶消化离心，得到第二代细胞;并使用同样方法得到重复 进行第二代到第三代传代人脐带间质干细胞的培养。
[0008] 优选地，步骤（1)中，所采用的胎牛血清的浓度为5%~20 %，青霉素/链霉素双抗 的浓度为80~120U/mL，阿卡米星的浓度为5~10mg/L，成纤维细胞生长因子的浓度为8~13 yg/L〇
[0009] 优选地，步骤(1)中，培养温度为37°C，环境空气为5%C〇2。
[0010] 优选地，步骤(2)中，培养温度为37°C，环境空气为5%C〇2。
[0011] -种人脐带间质干细胞分化诱导为软骨细胞的培养方法，取上述第三代传代脐带 间质干细胞，与人关节软骨细胞(hACs)共培养，诱导分化为软骨细胞。
[0012] 优选地，所述人关节软骨细胞(hACs)的获取方法为，取膝关节非负重区软骨，使用 Π 型胶原酶消化后过滤，弃上清液，收集软骨细胞，接种于培养瓶内，使用含10 %胎牛血清 的DMEM/F12培养基培养。待细胞达到80%~90%融合时，消化传代成第1代细胞，然后再对 第一代细胞置37°C、5 % C02的培养箱中继续培养，获得第2代人关节软骨细胞(hACs)。
[0013] 优选地，软骨细胞的培养方法为，将第三代传代人脐带间质干细胞与第二代人关 节软骨细胞(hACs)，按1:1的比例接种于DMEM/F12培养液中，进行共培养。
[0014] 脐带间质干细胞和软骨细胞共培养，两种细胞相互促进增殖和分化，可减少软骨 细胞增殖传代次数并节省软骨细胞数量，方法简单，费用低，生物安全性高，对建立种子细 胞源是一种实用的策略，也为优化和扩大软骨组织工程的种子细胞源提供了实验依据。
【附图说明】
[0015] 图1A实施例1利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD34和 CD45的检测结果
[0016]图1B实施例1利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD105和 CD73的检测结果
[0017] 图2A实施例2利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD34和 CD45的检测结果
[0018] 图2B实施例2利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD105和 CD73的检测结果
[0019] 图3A实施例1利用RT-qPCR技术对S0X9基因的转录情况表征 [0020]图3B实施例1利用RT-qPCR技术对I型胶原基因的转录情况表征 [00211图3C实施例1利用RT-qPCR技术对Π 型胶原基因的转录情况表征
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0023] 实施例1、
[0024] 实验用新生儿脐带(η = 7 )，取自深圳市第二人民医院妇产科，产妇体健，足月剖宫 产，产妇及其家属均签署知情同意书，实验方案经医院医学伦理会批准。
[0025] 本实施例所采用的药品及来源如表1。
[0026] 表1本实施例中所采用药品及来源
[0029] 1.从人脐带中分离和培养间质干细胞，其具体分离、培养方法如下：
[0030] (1)脐带的预处理
[0031]无菌条件下，取脐带5~8cm，剔除血管和外膜后，使用PBS洗净，取脐带的胶冻状组 织，即沃顿胶(Wharton，s jelly，WJ)剪碎成1.0~2.0mm3大小的组织块。
[0032] (2)细胞分离及原代细胞培养
[0033]将预处理过的沃顿胶组织块，按一定比例均匀放置于含MesenGro培养液的培养皿 中，放置于培养箱内培养，培养箱内温度为37°C，培养箱内C〇2含量为5 %。
[0034]其中，MesenGro培养液的组分及配比为：MesenGro培养基，胎牛血清的浓度为 10%，青霉素/链霉素双抗的使用浓度为l〇〇U/mL，阿卡米星的使用浓度为7.5mg/L，成纤维 细胞生长因子的使用浓度l〇yg/L。
[0035] 10天以后，细胞从组织块中爬出，用胰蛋白酶消化离心，获得原代细胞。
[0036] (3)细胞传代培养
[0037]将获得的原代细胞，置入含有新的MesenGro培养液的T25培养瓶进行传代培育，其 培养温度为37°C，环境空气为5%⑶2。待细胞长至80%~90%融合时，用胰蛋白酶消化离 心，得到第二代细胞。使用同样方法重复进行第二代到第三代传代细胞的培养。对细胞进行 传代培养，每传代一次，细胞按指数式增长。
[0038] (4)传代细胞的检测
[0039]以上步骤(3)获得的人脐带间质干细胞已培养至第三代，用流式细胞仪检测其表 面抗原（CD105-PE、CD73-FITC、CD34-PE、CD45-FITC，Bioscience，1