一种脂肪干细胞的纯化方法及干细胞在成骨诱导及成软骨诱导上的应用
【专利摘要】本发明提供一种脂肪干细胞的纯化方法，该方法包括：原代脂肪干细胞培养和CD90+细胞群纯化。本发明还提供纯化后的脂肪干细胞在成骨诱导和成软骨诱导方面的应用。通过本发明得到的ADSCs中CD90+细胞群，具有更高的干细胞分化潜能，可以提高ADSCs在组织工程中的使用效率和修复效果，在相同诱导条件下，成骨率和成软骨率分别提高了3?5倍和5?7倍。
【专利说明】
一种脂肪干细胞的纯化方法及干细胞在成骨诱导及成软骨诱导上的应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种干细胞的纯化方法，特别涉及一种兔来源脂肪干细胞的纯化方法。
【背景技术】
[0002]脂肪组织是最富有、最容易获取的间充质干细胞来源。脂肪干细胞(ADSCs)SPmsc来源于脂肪组织，是一个重要的再生应用的细胞来源。ADSCs从脂肪组织的基质血管部分(SVF)分离得到，它包含多种类型的细胞，如平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。最近的研究显示，ADSCs有能力分化成多种细胞类型(脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞)，刺激血管生成，减少炎症和细胞凋亡。但原代培养未经纯化的ADSCs做为组织工程的种子细胞存在分化能力弱，修复效果不理想等问题。目前大部分都是分离细胞后原代培养直接用，没有进行纯化，造成的缺陷是同样的方法，不同批次培养，由于血管基质成分含量不同，培养出的ADSCs中干细胞含量不同，分化为目的细胞的效率不同，用于组织工程修复效果参差不齐。目前用于纯化的方法主要有微孔过滤膜法(聚氨酯(PU)膜、PLGA/蚕丝膜)、磁珠富集法和流式分选法，用于纯化脂肪细胞的多为微孔过滤膜法，缺陷在于膜的孔径比较难掌握。
【发明内容】
[0003]本发明首先要解决的技术问题是目的是提供一种脂肪干细胞的纯化方法，该方法采用流式细胞术的方法从原代培养的ADSCs中分选纯化出具有更强干细胞分化潜能的CD90+细胞群，能够做为组织工程的种子细胞，改善组织工程中受损组织的修复效果。
[0004]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:
一种脂肪干细胞的纯化方法，
按如下步骤进行:
(1)原代脂肪干细胞培养:取兔源腹股沟处脂肪块置于含100U/ml青霉素-链霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加胶原酶11剪碎，37 0C消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基重悬，37°C，5%C02孵箱培养，每3天换液一次，待细胞长至80%时传代，传代1_5次，获得原代脂肪基质细胞的培养液；
(2)CD90+细胞群纯化:弃掉步骤(I)原代脂肪基质细胞的培养液，用步骤(I)中的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入4 °C预冷的PBA溶液，1500rpm，3min离心，弃上清，加入鼠抗兔CD90—抗PBA溶液，4°C孵育2小时，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC标记的荧光二抗的PBA溶液，4°C孵育30min，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次后用PBS重悬，采用流式细胞仪收集CD90+细胞群，获得纯化后的脂肪干细胞。进一步地，所述PBA溶液为含体积浓度
0.5%胎牛血清的?83。
[0005]进一步地，所述CD90—抗PBA溶液中CD90—抗与PBA体积比为1:100。
[0006]进一步地，所述抗兔的FITC标记的荧光二抗PBA溶液中FITC标记的荧光二抗与PBA体积比为1:200。
[0007]本发明还提供一种上述纯化后的脂肪干细胞在成骨诱导和成软骨诱导方面的应用。
[0008]所述的骨细胞诱导具体是指:细胞长至80%时，0.25%胰酶37°C消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度5 X 15细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周，用茜素红检测。
[0009]进一步地，所述骨诱导液购自GIBC0，其成分组成为:dexamethasone 10-7M，β-glycerol phosphate 1mM,ascorbic acid 50ug/mlo
[0010]所述的软骨细胞诱导具体是指:细胞长至80%时，0.25%胰酶37°C消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度1x107细胞/ml分装于15ml离心管中，每管Iml，1500rpm，3分钟离心，弃上清，沿管壁缓慢加入含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，置于37° C，5%C02培养箱中培养24小时，形成细胞球加入软骨诱导液诱导3周，细胞球经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋成蜡块，切片3um，S.0染色检测软骨细胞生成情况。
[0011]进一步地，所述的软骨诱导液购自GIBC0，其成分组成为:TGF-f3-310ng/ul，dexamethasone 1mM,ascorbic acid 5mg/ml，sodium pryruvate 10nm0
[0012]与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:
通过本发明得到的ADSCs中CD90+细胞群，具有更高的干细胞分化潜能，可以提高ADSCs在组织工程中的使用效率和修复效果。本发明成功用流式分选法纯化脂肪来源的干细胞，从四方面证实了用流式分选法纯化得到的干细胞特性得以明显提高，(I)形成克隆的能力；
(2)干细胞表面标记物的表达量；(3)三系分化的能力；(4)干细胞相关基因表达量上调，月旨肪相关基因的表达量下调。通过本发明的方法得到的CD90+细胞，细胞增殖率为未纯化细胞的1.5倍，干细胞相关基因表达上调2倍，脂肪相关基因表达下调2-10倍，干细胞表面抗原表达量提高2.5-3.9倍，在相同诱导条件下，成骨率和成软骨率分别提高了 3-5倍和5-7倍。
【附图说明】
[0013]图1为流式分选图片43、(:、04均为未标记0)90+的空白对照组，？、1、!1、1、1为标记⑶90+的实验组，J中P4为收集的目的细胞。
[0014]图2为分选前后细胞培养图片，A为原代脂肪基质细胞，B为CD90+细胞成克隆增殖，C为甲苯胺蓝染色后的细胞克隆。
[0015]图3为分选前后细胞的三系分化图片，A为原代脂肪基质细胞向脂肪分化图，B为CD90+细胞向脂肪分化图，油红O染色，C为原代脂肪基质细胞向骨分化图；D为CD90+细胞向骨分化图，茜素红染色;E为原代脂肪基质细胞向软骨分化图;F为CD90+细胞向软骨分化图，S.0染色；图3G表示分选后细胞向骨分化中生成的钙盐总量是未分选细胞的7倍，图3H表示向软骨分化中，诱导相同数量的细胞，诱导后形成的细胞球，面积为3-4倍，图31表示颜色面积4-5倍。
[0016]图4为分选前后细胞的干细胞表面标记检测图片，A-D为原代脂肪基质细胞的空白对照、⑶14、⑶105和⑶90 ;E-H是分选后细胞⑶90+细胞的空白对照、⑶14、⑶105和⑶90。
[0017]图5为分选前后细胞的脂肪和干细胞相关基因检测结果图片。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1
(I )ADSCs原代细胞培养:取新西兰大白兔一只，雄性，3-4周，静脉注射空气针处死后取腹股沟处脂肪块(带筋膜)置于含100U/ml青霉素-链霉素双抗的PBS(PH7.2-7.4)中，去掉筋膜和血管，加Co 11 agenase II剪碎，37 °C消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10%血清的低糖培养基培养(DMEM-L，GIBC0)重悬，37°C，5%C02孵箱培养。每3天换液一次，待细胞长至80%时传代，P5之前的细胞用于分选，获得原代脂肪基质细胞的培养液。
[0019](2)⑶90+细胞群分选纯化:弃掉原代脂肪基质细胞的培养液，PBS清洗一次后再加入I3BS,然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入2ml 4°C预冷的I3BA溶液(含体积浓度0.5%胎牛血清的I3BS)，1500rpm，3min离心，弃上清，加入200UL的CD90—抗PBA溶液(CD90—抗与PBA体积比为1: 100，购自华安生物有限公司)，4 °C孵育2小时，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次，加入200仙抗兔的FITC标记的荧光二抗(Molecular probes Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG(H+L) )PBA溶液(invitrogen，二抗与PBA体积比为1: 200)，4°C孵育30min，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次后，加入3ml PBS使细胞浓度不低于17个/ml，转入无菌流式管，采用流式细胞分析仪进行上机检测。用488nm激光激发，分选出细胞中CD90+的细胞群。结果如图1所示，经两步法标记后，用流式细胞分析仪分选得到CD90+细胞比例为1.5%，共收集细胞约5万个细胞，J中P4框中的细胞为收集的目的细胞，即为CD90+细胞。
[0020]分选获得的细胞群，继续培养I周后，发现细胞生长成克隆式增殖，并且扩增效率较快，如图2所示，取细胞后用PBS冲洗，然后4%甲醛固定10分钟，弃固定液，PBS冲洗后，1%甲苯胺兰染色10分钟，弃染色液，PBS冲洗后，倒置显微镜观察拍照，放大倍率为10倍。
[0021]实施例2
干细胞表面标记检测:为比较分选前后细胞群中干细胞表面标记阳性细胞的含量，用细胞刮刀获得细胞(步骤I培养的原代脂肪基质细胞及步骤2筛选的CD90+细胞)，离心后，分别用CD14、CD105、CD34标记原代脂肪基质细胞和CD90+细胞，4°C孵育1-2小时，PBS清洗后，焚光二抗(Molecular probes Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG(H+L))孵育30分钟，PBS清洗，然后经流式细胞分析仪检测。
[0022]干细胞表面标记抗体的表达量也代表了干细胞特性之一，分选前和分选后细胞干细胞表面标记抗体CD14、CD105的表达量也发生了较大的变化，如图4所示。分选前CD14和CD105的表达量为20.7%和22.2%;分选后CD90+细胞CD14和CD105的表达量为57.8%和56.1%，表明分选后细胞的干细胞特性至少提高了 2.5倍。
[0023]实施例3
三系分化潜能检测:为比较细胞分选前后的三系分化能力，将步骤I制备的原代脂肪基质细胞和步骤2获得的CD90+细胞以同样细胞浓度5 X 15细胞/ml种于24孔板中，(I)骨细胞诱导:细胞长至80%时，0.25%胰酶37 °C消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度5 X 15细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液(购自GIBCO)进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周，用茜素红检测。骨诱导液的成分组成:dexamethasone( 10-7M)，β-glycerol phosphateC1mM),ascorbic acid(50ug/ml)。
[0024](2)软骨细胞诱导:细胞长至80%时，0.25%胰酶37 V消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度1x107细胞/ml分装于15ml离心管中，每管Iml，1500rpm，3分钟离心，弃上清，沿管壁缓慢加入含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，置于37° C，5%C02培养箱中培养24小时，形成细胞球加入软骨诱导液诱导3周，细胞球经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋成蜡块，切片3um，S.0染色检测软骨细胞生成情况。软骨诱导液(购自GIBC0)，软骨诱导液的成分组成:TGF_0_3( 10ng/ul)，dexamethasoneC 1mM) ,ascorbic acid(5mg/ml)，sodiumpryruvate(10nm)。
[0025]本文中所用到的正置显微镜为OLYMPUS D61，倒置显微镜为ZESSI Ti_U。体外三系分化的能力是干细胞特性之一，分选前和分选后细胞体外三系分化结果，如图3所示，结果显示分选后的CD90+细胞群在相同的分化时间内，向骨和软骨分化能力明显强于未分选细胞，分选后细胞向骨分化中生成的钙盐总量是未分选细胞的7倍(图3G)，向软骨分化中，诱导相同数量的细胞，诱导后形成的细胞球，面积为3-4倍(图3H)，颜色面积4-5倍(图31)。脂肪诱导和骨诱导为10倍，软骨诱导为40倍。
[0026]实施例5
基因水平检测:为进一步检测基因水平发生的变化，分别用RNA抽提试剂盒(购自invitrogen)提取未分选细胞(步骤I制备的原代脂肪基质细胞)和分选后CD90+细胞(步骤2制备的⑶90+细胞)的RNA，利用q-PCR检测脂肪相关基因PPARr和干细胞相关基因0CT4等基因的变化，以GAPDH做为内参。取模板IlIg逆转，逆转体系20μI，稀释3倍，做qpcr反应。计算2-A AT值。收集未分选和分选后的细胞RNA，检测脂肪相关基因PPAR-r、C/EBPa和干细胞相关基因sox2，结果见图5所示。分选出的CD90+细胞群脂肪相关基因表达量较未分选的细胞表达下调，干细胞相关基因表达上调。
【主权项】
1.一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于:所述的纯化方法按如下步骤进行: (1)原代脂肪干细胞培养:取兔源腹股沟处脂肪块置于含100U/ml青霉素-链霉素的PBS中，去掉筋膜和血管，加胶原酶11剪碎，37 0C消化2小时，离心，沉淀用含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基重悬，37°C，5%C02孵箱培养，每3天换液一次，待细胞长至80%时传代，传代1_5次，获得原代脂肪基质细胞的培养液； (2)CD90+细胞群纯化:弃掉步骤(I)原代脂肪基质细胞的培养液，用步骤(I冲的PBS清洗一次后再加入PBS，然后用细胞刮刀将细胞刮下，收集于离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，加入4 °C预冷的PBA溶液，1500rpm，3min离心，弃上清，加入鼠抗兔CD90—抗PBA溶液，4°C孵育2小时，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次，加入抗鼠的FITC标记的荧光二抗的PBA溶液，4°C孵育30min，1500rpm，3min离心，弃上清，PBS清洗2次后用PBS重悬，采用流式细胞仪收集CD90+细胞群，获得纯化后的脂肪干细胞。2.如权利要求1所述的一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于:所述PBA溶液为含体积浓度0.5%胎牛血清的PBS。3.如权利要求1所述的一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于:所述鼠抗兔CD90—抗PBA溶液中鼠抗兔⑶90—抗与PBA体积比为1:100。4.如权利要求1所述一种脂肪干细胞的纯化方法，其特征在于:所述抗鼠的FITC标记的荧光二抗PBA溶液中FITC标记的荧光二抗与PBA体积比为1:200。5.权利要求1所得的CD90+细胞在成骨诱导方面的应用，其特征在于:所述的骨细胞诱导具体是指:细胞长至80%时，0.25%胰酶37°C消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度5 X 15细胞/ml种于24孔板中，贴壁后24小时后用骨诱导液进行诱导，每3天换液一次，共诱导2周，用茜素红检测。6.如权利要求5所述的CD90+细胞在成骨诱导方面的应用，其特征在于:所述骨诱导液购自GIBC0，其成分组成为:dexamethasone(地塞米松)10-7M，β-glycerol phosphate(0-甘油磷酸钠)10mM，ascorbic acid(抗坏血酸维生素C) 50ug/ml。7.权利要求1所得的CD90+细胞在成软骨诱导方面的应用，其特征在于:所述的软骨细胞诱导具体是指:细胞长至80%时，0.25%胰酶37 °C消化3分钟，血清终止消化后，置于15ml离心管，1500rpm，3min离心，弃上清，细胞重悬后置于含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，以细胞浓度1x107细胞/ml分装于15ml离心管中，每管lml，1500rpm，3分钟离心，弃上清，沿管壁缓慢加入含体积浓度10%血清的DMEM-L培养基，置于37° C，5%C02培养箱中培养24小时，形成细胞球加入软骨诱导液诱导3周，细胞球经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋成蜡块，切片3um，S.0染色检测软骨细胞生成情况。8.如权利要求7所述的CD90+细胞在成软骨诱导方面的应用，其特征在于:所述的软骨诱导液购自GIBCO，其成分组成为:TGF-0_3(转化生长因子-β-3) 10ng/ul ,dexamethasone(地塞米松)10mM，ascorbic acid(抗坏血酸维生素C) 5mg/ml，sodium pryruvate(丙酮酸钠)10nm0
【文档编号】C12N5/0775GK106047804SQ201610372872
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】宋兴辉, 沈婷, 洪朝阳, 李艳伟, 王佳佳, 王琳琳
【申请人】浙江大学