一种骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法
【专利摘要】本发明涉及一种骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的骨髓间充质干细胞体外扩增纯化培养的方法，所用细胞培养基的组成如下：PL血小板裂解液5-20％，肝素2-5U/ml，强力霉素5-10μg/ml，基础培养基DMEM或基础培养基AMEM；本发明采用骨髓间充质干细胞的分离提取、细胞接种、细胞培养、更换细胞培养液、细胞传代的方法，获得的骨髓间充质干细胞纯度高，体外增殖能力强，并且具有较好的向成骨细胞分化的能力。
【专利说明】一种骨髓间充质干细胞在体外扩増纯化培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及骨髓间充质干细胞的采集，分离提取，细胞在体外培养扩增纯化的【技术领域】，具体地说是一种骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法。
【背景技术】
[0002]骨髓间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，是非终末分化细胞，它具有多项分化的能力，相关研宄已经表明这种干细胞可分化为成骨、软骨、脂肪、以及神经细胞等，这种细胞易于采集，分离培养，而且在体外具有很强的自我更新，分化能力和免疫抑制等优点，使其在组织器官缺损性疾病，组织器官退行性疾病以及细胞治疗和组织工程领域具有重要的应用前景，近年来在国内外有众多的研宄探索骨髓间充质干细胞的体外分离及培养方法，主要有细胞贴壁分离，密度梯度离心和细胞分选等方法，结果显示通过贴壁传代分离的细胞纯度低，梯度离心和细胞分选可获得较高纯度的细胞，但细胞活力相对较低，且所需骨髓量较大，影响后续的研宄和应用，同时通过这些方法获得的骨髓间充质干细胞在传代培养的过程中将逐渐失去扩增的能力。
【发明内容】
[0003]本发明针对现有技术的不足，提供一种骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法。
[0004]本发明所采取的技术方案是:一种骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法，其特征在于，所述的方法包括:
[0005](I)骨髓血的采集:从髂后上棘抽取骨髓血。
[0006](2)有核细胞的分离提取:
[0007]A、密度梯度离心:将骨髓血注入无菌离心管a内进行离心，离心后骨髓血在离心管内分为三层，上层为上清液，中间层为一层薄薄絮状白膜层的有核细胞层，下层为红细胞层；
[0008]B、有核细胞层的分离提取:第一次有核细胞层的分离提取:取上层的上清液和中间层的白膜层的有核细胞层放入无菌离心管b内进行离心，离心后取出上层上清液放回离心管a内进行离心；第二次有核细胞层的分离提取:取上层的上清液和中间层的白膜层的有核细胞层放入无菌离心管b内进行离心。
[0009](3)细胞计数:用PBS将两次提取的有核细胞层混匀，取100 μ I细胞悬液对有核细胞和红细胞进行计数。
[0010](4)细胞接种:根据计数的有核细胞和红细胞分别按初始密度为0.8-1.0X 16/cm2和1.0-1.2X10 8/cm2接种于细胞培养瓶内。
[0011](5)原代细胞的培养:用适合于原代细胞培养的完全培养基将分离提取的有核细胞混匀，接种于细胞培养瓶内，再将盛有细胞的细胞培养瓶置于饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，细胞培养箱内0)2为5%，02为5%，温度为37°0，培养时间为24-7211时；进行细胞换液，弃掉培养瓶内的培养液，用PBS洗涤2次细胞培养瓶细胞贴壁面，洗涤后加入新配置的原代细胞培养所用的完全培养基；每隔三天更换一次原代细胞培养所用的完全培养基，当细胞长至80%以上时，对细胞进行收集传代。
[0012](6)原代细胞收集传代:a、弃掉培养瓶内的培养基，用PBS洗涤培养瓶细胞贴壁面2次，弃掉PBS ;b、在培养瓶内加入0.25%胰酶，在室温消化小于等于3分钟；c、当细胞从细胞培养瓶贴壁面开始部分脱落时，细胞培养瓶内加入第一代及第一代以后细胞培养所用的完全培养基，终止消化；d、取100 μ I细胞悬液用于细胞计数，通过离心提取细胞，细胞接种密度为6000-10000个/cm2进行培养。细胞接种密度的高低要视细胞扩增的速度和预计培养的天数而定。
[0013](7)第一代及第一代以后的细胞培养及传代:a、将盛有细胞的细胞培养瓶置于饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，细胞培养箱内0)2为5%，温度为37°C ;b、当细胞长至80%以上时；c、弃掉培养瓶内的培养基，用PBS洗涤培养瓶细胞贴壁面2次，弃掉PBS ；d、在培养瓶内加入0.25%胰酶，在室温消化小于等于3分钟；e、当细胞从细胞培养瓶贴壁面开始部分脱落时，细胞培养瓶内加入第一代及第一代以后细胞培养所用的完全培养基，终止消化；f、取100 μ I细胞悬液用于细胞计数，通过离心提取细胞，细胞接种密度为6000-10000个/cm2进行培养。
[0014]细胞培养所用的完全培养基:
[0015]原代细胞培养所用的完全培养基的终浓度组成如下:PL血小板裂解液5-20%，肝素2-5U/ml，强力霉素5-10 μ g/ml，基础培养基为DMEM。
[0016]第一代及第一代以后细胞培养所用的完全培养基的终浓度组成如下:PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，强力霉素5_10 μ g/ml，基础培养基为AMEM。
[0017]所述的0.25%胰酶含有0.02% EDTA。
[0018]本发明的有益效果是:
[0019]1.人体髂后上棘的骨髓血比较丰富，易于抽出并能获得足量的骨髓间充质干细胞。
[0020]2.在骨髓间充质细胞分离提取时单纯的利用密度梯度离心法，没有加入细胞分离液等试剂，减少了外界试剂对细胞的伤害，同时也减少了实验的成本，并且能够获得大量的间充质干细胞。
[0021]3.根据细胞贴壁速度不同，在早期更换细胞培养液，去除骨髓中的造血干细胞，其他类型的细胞以及上清液中存在的细胞碎片，利于细胞的早期纯化。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1更换完全培养液后，原代培养第2天的细胞形态。
[0023]图2培养细胞的第8天，细胞群落慢慢融合至80%以上时的细胞形态。
[0024]图3培养细胞的第11天，此时为第一代细胞，长至80%以上时的细胞形态。
[0025]图4培养细胞的第14天，此时为第二代细胞，长至80%以上时的细胞形态。
[0026]图5培养细胞的第17天，此时为第二代细胞，长至80%以上时的细胞形态。
【具体实施方式】
:
[0027]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述:
[0028]实施例1:
[0029]一种骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法，包括以下步骤:
[0030](I)骨髓血的采集:从志愿者的髂后上棘抽取60ml骨髓血。
[0031](2)有核细胞的分离提取:
[0032]A、密度梯度离心:将骨髓血注入无菌离心管a内进行离心，离心后骨髓血在离心管内分为三层，上层为上清液，中间层为一层薄薄絮状白膜层的有核细胞层，下层为红细胞层；在不添加任何细胞分离液的情况下进行密度梯度离心。B、有核细胞层的分离提取:第一次有核细胞层的分离提取:取上层的上清液和中间层的白膜层的有核细胞层放入无菌离心管b内进行离心，离心后取出上层上清液放回离心管a内进行离心；在将白膜层及上清液取出时，为了获得更多的有核细胞，可以夹带少量红细胞，放入无菌离心管b内，将盛有白膜层，上清液及少量红细胞的离心管进行离心，离心后取出不能带有白膜层及红细胞的上清液放回离心管a内。第二次有核细胞层的分离提取:取上层的上清液和中间层的白膜层的有核细胞层放入无菌离心管b内进行离心。步骤同第一次有核细胞层的分离提取。
[0033](3)细胞计数:用PBS将两次提取的有核细胞层混匀，取100 μ I细胞悬液对有核细胞和红细胞进行计数；
[0034](4)细胞接种:对有核细胞和红细胞进行计数，根据其数量计算出所需细胞培养瓶的面积，然后根据细胞培养瓶的数量配制所需完全培养基的体积，将计数完毕的有核细胞和红细胞分别按初始密度为0.8-1.0X 1fVcm2和1.0-1.2X10 8/cm2接种于细胞培养瓶内。
[0035](5)原代细胞的培养:此时用原代细胞培养的完全培养基将细胞混匀，接种于细胞培养瓶内，再将盛有细胞的细胞培养瓶置于饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，细胞培养箱内0)2为5%，02为5%，温度为37°C，培养时间为24-7?时；进行细胞换液，弃掉培养瓶内的培养液，用PBS洗涤2次细胞培养瓶细胞贴壁面，洗涤后加入新配置的原代细胞培养所用的完全培养基；每隔三天更换一次原代细胞培养所用的完全细胞培养基，当细胞长至80%以上时，对细胞进行收集传代。
[0036](6)原代细胞收集传代:弃掉培养瓶内的培养基，用PBS洗涤培养瓶细胞贴壁面2次，在洗涤的过程中左右晃动培养瓶时动作要缓慢，避免细胞被PBS从细胞贴壁面洗下来，弃掉PBS ;向培养瓶内加入0.25%胰酶，所述的0.25%胰酶含有0.02% EDTA，在室温消化不超过3分钟；当细胞从细胞培养瓶贴壁面开始部分脱落时，此时拍打细胞培养瓶的侧壁，当细胞全部从细胞培养瓶的细胞贴壁面脱落下来后，将第一代及第一代以后细胞培养的完全培养基加入培养瓶内，终止消化细胞；取100 μ I细胞悬液用于细胞计数，通过离心提取细胞，细胞接种密度为6000-10000个/cm2进行培养。
[0037](7)第一代及第一代以后的细胞培养及传代:a、将盛有细胞的细胞培养瓶置于饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，细胞培养箱内0)2为5%，温度为37°C ;b、当细胞长至80%以上时；c、弃掉培养瓶内的培养基，用PBS洗涤培养瓶细胞贴壁面2次，弃掉PBS ；d、在培养瓶内加入0.25%胰酶，在室温消化小于等于3分钟；e、当细胞从细胞培养瓶贴壁面开始部分脱落时，细胞培养瓶内加入第一代及第一代以后细胞培养所用的完全培养基，终止消化；f、取100 μ I细胞悬液用于细胞计数，通过离心提取细胞，细胞接种密度为6000-10000个/cm2进行培养。
[0038]上述骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养所有的完全培养基的制备:
[0039]原代细胞培养所用的完全培养基的终浓度组成如下:PL血小板裂解液5-20%，肝素2-5U/ml，强力霉素5-10 μ g/ml，基础培养基为DMEM培养液。
[0040]第一代及第一代以后细胞培养所用完全培养基的终浓度组成如下:PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，强力霉素5_10 μ g/ml，基础培养基为AMEM培养液。
[0041]实施例2:
[0042]1.骨髓血的采集:从志愿者的髂后上棘抽取60ml骨髓血
[0043]2.有核细胞(主要是骨髓间充质干细胞)的分离提取:将60ml的骨髓血等量放入编号分别为①和②的离心管内，在200g，6min室温的条件下进行密度梯度离心，离心后骨髓血分为三层，上层为上清液，中间层为薄薄白色絮状的有核细胞层，下层为红细胞层，此时进行第一次有核细胞层的分离提取:分别将编号为①和②离心管内的有核细胞层及上清液取出，为了获得更多的有核细胞，可以少取一些红细胞，放入编号为③的无菌离心管内，将编号为③的离心管在1000g，6min室温的条件进行离心，离心后取出不能带有白膜层及红细胞的上清液分为等量两份放回编号为①和②的离心管内，重新混匀后进行第二次有核细胞的分离提取，步骤同第一次有核细胞的分离提取。
[0044]3.细胞计数:用PBS将两次提取的有核细胞混匀，放在编号为⑤的离心管内，取100 μ I细胞悬液对有核细胞和红细胞进行计数，计数结果:有核细胞451.5Χ 106，红细胞572.25Χ108。
[0045]4.细胞接种:根据有核细胞和红细胞计数，计算出要用细胞培养瓶的面积，再根据细胞培养瓶的数量配制原代细胞培养所用完全培养基的体积，将计数完毕的有核细胞和红细胞分别按初始密度为0.86 X 1fVcm2和1.09X 10 8/cm2接种于3个175cm 2细胞培养瓶内。
[0046]5.原代细胞的培养:将盛有细胞的细胞培养瓶置于0)2为5%，02为5%，温度为370C，饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，培养到48小时，细胞进行换液，弃掉培养瓶内的培养液，用PBS轻轻洗涤细胞培养瓶细胞贴壁面2次，弃掉PBS之后加入原代细胞培养所用的完全培养基，48小时的细胞图片见(图1)，细胞呈长梭型，群落式生长，在第5天换一次原代细胞培养所用的完全细胞培养基，同第一次换液，在第八天细胞长至80%以上时，细胞图片见(图2)，细胞呈长梭型，旋涡式生长，将细胞进行收集传代。
[0047]6.原代细胞收集传代:弃掉培养瓶内的培养基，用PBS轻轻洗涤培养瓶细胞贴壁面2次，弃掉PBS，每个细胞培养瓶加入0.25%胰酶6ml，胰酶含有0.02% EDTA，室温消化不超过3分钟，当细胞从细胞培养瓶贴壁面脱落时，每个细胞培养瓶内加入6ml第一代细胞培养所有的完全培养基终止消化，将所有的细胞悬液放入一个容器内混匀，取100 μ I细胞悬液用于细胞计数，通过细胞计数得知骨髓间充质干细胞的计数总量为15.2X 106，将细胞接种于11个Τ175细胞培养瓶内，细胞接种密度为7896/cm2进行培养。
[0048]7.第一代细胞及以后代次细胞的培养扩增纯化:将盛有细胞的细胞培养瓶置于0)2为5%，温度为37°C，饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，每天观察细胞的形态和融合度，在细胞培养的第11天，细胞长至80%以上，细胞图片见(图3)，此时将细胞传代，继续培养扩增纯化，细胞传代的步骤与原代细胞收集传代的步骤相同，在细胞培养的第14天，细胞长至80%以上，见(图4)，此时继续将细胞传代扩增纯化，在细胞培养的第17天，细胞长至80%以上，细胞图片见(图5)。
[0049]骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养所用的完全培养基的制备:
[0050]原代细胞培养所用完全培养基的配制:根据细胞培养瓶所需完全培养基90ml，终浓度组成如下，PL血小板裂解液按10%添加，需要9ml，肝素按5U/ml添加，需要450U，强力霉素按8 μ g/ml添加，需要720 μ g，需要基础培养基DMEM 81ml，配制完成后放在37°C恒温水浴锅预热5min，待用。
[0051]第一代细胞培养所用的完全培养基配制:根据细胞培养瓶所需完全培养基330ml，终浓度组成如下，PL血小板裂解液按10%添加，需要33ml，肝素按5U/ml添加，需要1650U，强力霉素按8 μ g/ml添加，需要2640 μ g，需要基础培养基AMEM207ml，配制完成后放在37°C恒温水浴锅预热5min，待用。
[0052]由于骨髓间充质干细胞贴壁生长，贴壁时间较快等特性，在细胞培养的过程中不断的得到纯化，同时为了防止细胞在培养的过程中发生细胞老化，变异，分化等潜在的危险，一般细胞培养天数不超过21天，细胞培养代次在P3或P4。骨髓间充质干细胞表面抗原的检测:取第3代长至80%以上的贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，计数后取2X 16个细胞，分装 6 管，每管加入 10 μ I 荧光标记抗体 CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、⑶166-ΡΕ，另设I管为空白对照，室温避光30分钟；用PBS反复洗2_3次，减少非特异性结合；加入200 μ IPBS混匀细胞，并以I %多聚甲醛固定，4 °C保存，24小时内上流式细胞仪检测，经流式细胞仪表型分析得知，表达骨髓间充质干细胞标记⑶73(98.6% )、CD105(97.7% )、CD166(97.4% )，不表达造血细胞标记⑶45 (0.2% )、CD34(0.4% )，此检测表明骨髓间充质干细胞的纯度较高。
【权利要求】
1.一种骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法，其特征在于，所述的方法包括: (1)骨髓血的采集:从髂后上棘抽取骨髓血。 (2)有核细胞的分离提取:A、密度梯度离心:将骨髓血注入无菌离心管a内进行离心，离心后骨髓血在离心管内分为三层，上层为上清液，中间层为一层薄薄絮状白膜层的有核细胞层，下层为红细胞层； B、有核细胞层的分离提取:第一次有核细胞层的分离提取:取上层的上清液和中间层的白膜层的有核细胞层放入无菌离心管b内进行离心，离心后取出上层上清液放回离心管a内进行离心；第二次有核细胞层的分离提取:取上层的上清液和中间层的白膜层的有核细胞层放入无菌离心管b内进行离心。 (3)细胞计数:用PBS将两次提取的有核细胞层混匀，取100μ I细胞悬液对有核细胞和红细胞进行计数。 (4)细胞接种:根据计数的有核细胞和红细胞分别按初始密度为0.8-1.0X 1fVcm2和1.0-1.2 X 1Vcm2接种于细胞培养瓶内。 (5)原代细胞的培养:用原代细胞培养所用的完全培养基将提取的细胞混匀，接种于细胞培养瓶内，将盛有细胞的细胞培养瓶置于饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，细胞培养箱内0)2为5%，02为5%，温度为37°C，培养时间为24-7?时；进行细胞换液，弃掉培养瓶内的培养液，用PBS洗涤2次细胞培养瓶细胞贴壁面，洗涤后加入新配置的原代细胞培养所用的完全培养基；每隔三天更换一次原代细胞培养所用的完全培养基，当细胞长至80%以上时，对细胞进行收集传代。 (6)原代细胞收集传代:a、弃掉培养瓶内的培养基，用PBS洗涤培养瓶细胞贴壁面2次，弃掉PBS ;b、在培养瓶内加入0.25%胰酶，在室温消化小于等于3分钟；c、当细胞从细胞培养瓶贴壁面开始部分脱落时，加入第一代及第一代以后细胞培养所用的完全培养基加入培养瓶内，终止消化；d、取100 μ I细胞悬液用于细胞计数，通过离心提取细胞，细胞接种密度为6000-10000个/cm2进行培养。 (7)第一代及第一代以后的细胞培养及传代:a、将盛有细胞的细胞培养瓶置于饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，细胞培养箱内0)2为5%，温度为37°C ;b、当细胞长至80%以上时；c、弃掉培养瓶内的培养基，用PBS洗涤培养瓶细胞贴壁面2次，弃掉PBS ;d、在培养瓶内加入0.25%胰酶，在室温消化小于等于3分钟；e、当细胞从细胞培养瓶贴壁面开始部分脱落时，细胞培养瓶内加入第一代及第一代以后细胞培养所用的完全培养基，终止消化；f、取100 μ I细胞悬液用于细胞计数，通过离心提取细胞，细胞接种密度为6000-10000个/cm2进行培养。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法，其特征在于所述的原代细胞培养所用的完全培养基的配制:终浓度组成如下，PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，强力霉素5_10 μ g/ml，基础培养基为DMEM培养液。
3.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法，其特征在于所述的第一代及第一代以后细胞培养所用的完全培养基的配制:终浓度组成如下，PL血小板裂解液5-20 %，肝素2-5U/ml，强力霉素5_10 μ g/ml，基础培养基为AMEM培养液。
4.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞在体外扩增纯化培养的方法，其特征在于 所述的0.25%胰酶含有0.02% EDTA。
【文档编号】C12N5/0775GK104480068SQ201410759017
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】黄诚, 黄相杰, 姜红江, 王玉鹤 申请人:黄相杰