专利名称：一种干细胞分离纯化方法
技术领域：
本 发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞分离纯化方法。
背景技术：
干细胞(stem cells)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞， 在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞有两种分类方法，一是根据干细胞所 处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜能分为三类全能干细胞(totipotent stem cell, TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)干细胞有着巨大的医学应用前景，但要将其成功地用于临床实践，必须解决的首 要课题是如何有效地分离纯化干细胞。目前对干细胞的体外分离纯化技术大多是建立在 对细胞表面标记识别的基础之上，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-I和c-kit 等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为⑶34+和Thyl+而 ⑶10，⑶14，⑶15，⑶16，⑶19，⑶20皆为阴性，具体方法有单抗贴壁铺展法、流式细胞分选 法、免疫磁珠分选法等，如羊水来源干细胞，In’t Anker等运用流式细胞技术从羊水中获得 胎儿间充质干细胞。Tsai等运用新的两期培养方法(一期羊水细胞培养，二期间充质干 细胞培养)从孕中期(4-6月)羊水中分离获得多能间充质干细胞。Coppi等运用免疫磁珠 的方法从羊水细胞中分离出c-Kit或CD117(干细胞因子受体)表达阳性的细胞，将这些细 胞命名为AFS细胞(amniotic fluid stem cells，AFS)。另外干细胞还有不同于一般分化 细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodaminel23染色，采用荧光细胞 分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。除此之外，人们还采用显微镜下人工挑克隆 传代法来分离纯化干细胞。
发明内容
本发明旨在提供一种简单快捷的干细胞分离纯化方法。为此，本发明提供了一种干细胞分离纯化方法，包括下列步骤A)干细胞培养将干细胞细胞悬液或含有干细胞的细胞悬液接种于培养容器中， 加入培养液培养至出现干细胞克隆团；B)干细胞分离纯化a)弃去培养液，加入平衡盐溶液洗去残余培养液，弃平衡盐溶液；b)加入平衡盐溶液，放置克隆杯圈住干细胞克隆团，一个克隆杯圈住单个干细胞 克隆团；c)弃杯内的平衡盐溶液，加入酶液，将干细胞克隆团消化成细胞悬液；d)将杯内细胞悬液移植于新的培养容器里，加入培养液继续培养；其中所述克隆杯为一个两端开口、中空柱状物，其内径大小能够圈住干细胞克隆团，这样人为地给单一的细胞克隆创建一个隔离环境，便于进一步分离细胞克隆。在一优选实施例中，所述两端开口、中空柱状物可为任何对细胞无毒的材料制成， 优选不锈钢管，其高度略低于标准培养皿内高，以便它能完全放置于培养皿内，也便消毒和 防止漂浮；更优选所述不锈钢管的端面为光滑的，以便于其能和培养皿底部紧密结合；最 优选所述不锈钢管的端面涂有凡士林，以使其和培养皿底部紧密结合，加强隔离效果。在一优选实施例中，所述干细胞可为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导性多潜能干 细胞或成体干细胞中之一；其中所述成体干细胞为羊水干细胞，优选为人羊水干细胞。
在一优选实施例中，当所述干细胞为羊水干细胞时，所述培养液为α-ΜΕΜ+20% FBS+1%谷氨酰胺+1%青霉素/链霉素+1%非必须氨基酸+0. 5πιΜβ巯基乙醇。本发明所述培养容器是常规的细胞培养皿或培养板。本发明方法具有一下突出优点和特点1、培养基选择法常需要在培养基中加入比较特殊且昂贵的细胞因子，而且需要长 期传代培养才能获得纯的干细胞。与其相比，本方法不需要长期传代培养和细胞因子就能 获得纯度较高的干细胞，节省了人力财力。2、流式细胞分选法和免疫磁珠分选法往往是根据细胞表面特殊的细胞标记来分 离干细胞，但目前特异的细胞表面标记很难达到共识。另外此两种分离方法都要借助需专 业人士操作的较大仪器来完成，分离时间较长，耗费较高。与其相比，本方法材料来源简单， 分离操作时间短，操作者只需具备基本的细胞培养传代技能就能完成，经济效益较高。与上述方法不同，本发明方法分离一个细胞克隆的过程所需时间约为3-5分钟， 操作简便，另外利用常规的胰酶消化法分离细胞，对细胞损伤小，细胞性状保持良好。而且 挑选得到的细胞源于单一克隆，细胞纯度较高，为对其进一步的研究提供了有力的保证。
图1克隆杯使用示意图。图 2hAFSCs 形态。图3对hAFSCs细胞周期分析结果。图4流式细胞仪对hAFSCs检测结果。
具体实施例方式为进一步详细描述在本发明的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关细 胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell :A practical approach[E. J. Robertson 编，IRL 出版有限公司， 1987] ；Guide to techniques in MouseDevelopment [P. M. Wasserman 等编，学术出版社， 1993] ；Embryonic StemCell Differentiation in Vitro[Μ. V. Wiles, Meth.Enzymol.225 900,1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells :Prospects forApplication to Human Biology and Gene Therapy [P. D. Rathjen 等，Reprod. Fertil. Dev. 10 :31, 1998]。细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案” [J. E. Colligan等编辑，Wiley & Sons]、“细胞生物学中的当前方案” [J. S. Bonifacino等，Wiley & Sons]和“兔疫学功时当亦方案” [J. E. Colligan等编辑，Wiley & Sons]中找到。 与本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、 Stratageneλ Invitrogen、ClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。细胞培养方法通常在“动物细胞培养基本技术手册”最新版本(R. I. Freshney 编辑，Wiley & Sons)；“细胞培养一般技术”(Μ. A. Harrison和I. F. Rae，剑桥大学出版)； 和“胚胎干细胞方法和操作规定”(K. Turksen编辑，Humana出版)中有描述。组织培养 基和试剂可从商业供应商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma ChemicalCo.、以及 ICN Biomedicals。 干细胞的来源和培养本发明可用各种类型的干细胞进行操作，除非另有说明，本发明可用任何脊椎动 物的干细胞进行操作。其中包括但不限于胚胎干细胞(embryonic stemcells，ES细胞)、 诱导性多潜能干细胞(又称iPS细胞)、胚胎生殖(EG)细胞、成体干细胞(somatic stem cell)等。ES细胞可以从灵长类动物的胚泡中获得[Thomson等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 =7844,1995]。如采用 Thomson 等所描述的技术[美国专利 5，843，780，Science 282 1145,1998]或 Reubinoff 等描述的技术[NatureBiotech. 18 :399，2000]，可从人胚泡细胞 中制备人胚胎干(hES)细胞。胚胎生殖(EG)细胞如人胚胎生殖(hEG)细胞可由原始的生殖细胞(存在于最后 一次经期后约8-11周的胎儿材料中)中制得。合适的制备方法描述可参见Shamblott等， Prco. Natl. Acad. Sci. USA 95 13726，1998 以及美国专利 6，090，622。诱导性多能干细胞(又称iPS细胞)是通过基因转染技术将某些因子导入动物 或人的体细胞，可将体细胞直接重构成为ES细胞样的多潜能细胞，其制备和培养可参见 Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Nature 2007 ；448 313-317 ；Wernig M, Meissner A, et al. Na ture 2007 ；448 318-324 ；Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Cell 2007 ； 131 861-872 ；YuJ, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Science 2007 ；318 1917—1920。成体干细胞(somatic stem cell)包括骨髓间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干 细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、羊膜干细胞、羊水干细胞等成体组织中存在的干细胞，包括 以下非限制性的实施例。美国专利5，851，832中报道了从脑组织中获得的多能神经干细 胞；美国专利5，766，948中报道了从新生儿大脑半球制造成神经细胞；美国专利5，654，183 和5，849，553号报道了哺乳类神经峭干细胞的应用；W02009040458公开了血液多能间充质 干细胞的制备方法；本发明成体干细胞优选为人羊水干细胞(human amniotic fluidstem cells hAFSCs)。Kaviani等发现从孕71_90天孕羊的羊水细胞中获得的间充质干细胞的体 外扩增速度明显快于羊胎儿细胞和成年羊骨髓来源的间充质干细胞。2003年In’ t Anker 等从人孕中期羊水细胞中培养得到间充质干细胞，发现其扩增潜能甚至超过了骨髓间充质 干细胞。2007年Kim等在对孕14-16周人羊水细胞进行体外培养研究中获得类似于骨髓间 充质干细胞的干细胞，称其为hAFFTs细胞，通过端粒酶活性和分化潜能测定，发现其具备 端粒酶活性和良好的体外扩增潜能。Coppi等分离获得的AFS (amnioticf Iuid stem cells) 细胞在体外可迅速生长，在36小时内即实现细胞数倍增，而且未显示出有致瘤特性。这些 细胞在经过250次倍增之后，仍然保持正常核型。
“消化”指的是使用任何常规技术或方法将完整的组织或细胞团分离为单细胞，这 些技术或方法包括机械力(切碎力或剪切力)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白 酶、脂肪酶、如US专利5，952，215中公开的释放酶(Iiberase)Hl和胃蛋白酶进行酶消化 或机械和酶方法的组合。例如，可通过以下方法将完整组织片段的消化使用胶原酶介导 的组织消化的方法；或参考用于本发明的使用胶原酶的其它方法公开在US专利5，830，714 和5，952，215中。类似地，可使用中性蛋白酶来代替胶原酶，如在Twentyman，P.R.和 J. M. Yuhas (Cancer Lett 1980:9(3) =225-228)中公开的方法。此外，方法可采用酶的组 合，例如胶原酶与胰蛋白酶的组合，如在Russell，S. W. F. Doc等人(Int J Cancer 1976 18(3) 322-30)中公开的方法；或酶如胰蛋白酶与机械离解的组合，如在Engelholm. S. A， M. Spang. Thomsen 等人(Br J Cancer 1985:51(1) :93_98)中公开的方法。 对本发明使用的培养基的类型没有限制，只要可用于干细胞培养的培养基即可。 在这类培养基中CO2的浓度优选是5%，但本发明不限于此。本发明所述方法既可适合人工操作实现，也适于机器手自动系统操作实现。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。以 下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发 明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商 所建议的条件。实施例中所述羊水由上海市杨浦区妇幼保健院提供。实施例中所使用培养液成分为α -MEM+20% FBS+1 %谷氨酰胺+1 %青霉素/链霉 素+1%非必须氨基酸+0. 5πιΜβ巯基乙醇。实施例1一羊水细胞原代培养羊水标本来自怀孕16-22周行产前诊断的孕妇，超声引导下行羊膜腔穿刺取得 20-40ml羊水至50ml无菌离心管，密封后4°C冷藏保存并迅速转移到层流无菌细胞培养室 内的超净台中。利用无菌100目筛网过滤后4°C环境下IOOOrpm离心5min。离心后弃上清， 管内加入4-5ml培养液，轻轻吹打，制成细胞悬液，种植到直径60mm培养皿中，置于37°C， 5% CO2的恒温培养箱中，记为原代。静置5天后，更换培养液，倒置相差显微镜下观察，可 以看到散在的细胞克隆，继续培养，准备从中分离干细胞。即完成羊水细胞原代培养过程。二分离工具准备羊水细胞原代培养期间，形成的细胞克隆在培养皿中分布不均一，而且在培养早 期细胞克隆之间不会相互接触混合。因此，只要人为地给单一的细胞克隆创建一个隔离环 境，就能进一步将其分离获得。我们的分离工具——“克隆杯”就是一个能够隔离克隆的工 具。克隆杯可由不锈钢管切割而得，不锈钢材质的密度保证了细胞分离操作过程中克隆杯 的不易移动。其高度略低于标准培养皿以便它能完全放置于培养皿内。克隆杯内径要恰巧 将一个细胞克隆圈进，且不与邻近克隆接触，基底必须是光滑的以便于其能和培养皿底部 紧密结合。分离干细胞之前将克隆杯超声处理30分钟，然后用蒸馏水冲洗三次，再将其置 于120°C干燥箱内烘干，高温高压消毒灭菌待用。即完成克隆杯的准备过程。三“克隆杯”从原代羊水分离干细胞的过程
1实验材料克隆杯、医用凡士林、PBS平衡盐溶液，0. 25% Trypsin-EDTA, 0. 2%明 胶溶液(PBS平衡盐溶液配制)、玻璃培养皿、弯镊子、24孔培养板、200ul、IOOOul Tip枪头 等。以上均消毒灭菌，并将医用凡士林置于玻璃培养皿中备用。2 “克隆杯”分离法过程参见图11)取已形成细胞克隆的60mm培养皿，倒置显微镜下观察，并用标记笔将性状良好 的细胞克隆在培养皿底部对侧圈标记号。2)将培养皿移入超净台，用IOOOul Tip枪头吸去培养液，用3ml无菌PBS平衡盐 溶液轻轻漂洗，尽量洗去残余培养液，弃平衡盐溶液。再向培养皿内加入2ml无菌PBS平衡 盐溶液。3)用无菌的弯镊子取一个克隆杯，将克隆杯底部轻轻压到医用凡士林上，使凡士 林均勻涂至克隆杯的底部。然后将涂有凡士林的克隆杯准确放到标记好的克隆上，将细胞 克隆隔离。4)用200ul Tip枪头吸去克隆杯内的PBS平衡盐溶液，加入预热至37°C的0.25% Trypsin-EDTA 30_50ul，缓慢移至倒置相差显微镜下观察，见细胞突起缩回，细胞间隙增 力口，细胞近乎缩成圆形，部分悬浮时加入适量培养液(以不溢出克隆杯为准)终止消化。用 200ul Tip枪头在克隆杯内轻轻吹打皿底，尽量使细胞完全脱离皿底。将细胞悬液移入预先 0.2%明胶溶液包被的24孔板的一个孔内。再用新鲜培养液洗杯内剩余细胞，合并放入同 一孔内。5)重复3)、4)步骤挑选其余克隆。上述整个操作过程务必保证克隆杯固定。不锈 钢材质的密度和操作过程中克隆杯的底部均勻涂抹了凡士林均有助于保证细胞分离操作 过程中克隆杯的不易移动。6)最后将24孔板静置于37°C,5% CO2的恒温培养箱中12_24小时以利于细胞贴壁。7)待细胞贴壁后每2-3天更换新鲜培养液，即完成分离过程。在培养期间，需按常规细胞生长所需的各种条件，例如温度(37°C )，二氧化碳浓 度(5% )，相对稳定的PH值及适宜的湿度等。在倒置显微镜下观察(图2A 原代羊水细胞培养过程出现的细胞克隆，40倍镜； B 克隆杯分离获得的hAFSCs，100倍镜)，所获得的细胞形态均一，生长迅速，倍增时间约为 36小时。发明者对所获得的hAFSCs进行细胞周期和核型分析，证实G0/G1，S期，G2/M正常 出现(图3)，染色体数目无增加，无缺失，G带染色分析证实染色体无重排。证明我们的发 明方法对所分离获得的干细胞没有不良影响。实施例2对例1中获得的hAFSCs进行流式细胞仪分析其细胞表面标记(图4)，证实⑶10 阳性率为0. 97%，⑶14阳性率为0. 93%,CD 34阳性率为0. 92%，⑶44阳性率为99. 20%, CD45阳性率为0. 65%, CD90阳性率为96. 65%, CD105阳性率为2. 88%, CDl 17阳性率为 12. 92%, HLA-A, B, C 阳性率为 98. 74%, HLA-DR, DP, DQ 阳性率为 0. 40%。对例1中获得的hAFSCs进行细胞免疫荧光技术检测分析，证实hAFSCs表达 SSEA4, Tra-1-81, 0ct_4。RT-PCR 检测分析发现 hAFSCs 表达 0ct_4、Nanog、Sox_2、Rex-U Thy-I、Nestin、NF、BMP4,不表达 FGF4、TDGFl、EBAF, Myoglobin、AFP、Alb。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各 个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所 述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
权利要求
一种干细胞分离纯化方法，包括下列步骤A)干细胞培养将干细胞细胞悬液或含有干细胞的细胞悬液接种于培养容器中，加入培养液培养至出现干细胞克隆团；B)干细胞分离纯化a)弃去培养液，加入平衡盐溶液洗去残余培养液，弃平衡盐溶液；b)加入平衡盐溶液，放置克隆杯圈住干细胞克隆团，一个克隆杯圈住单个干细胞克隆团；c)弃杯内的平衡盐溶液，加入酶液，将干细胞克隆团消化成细胞悬液；d)将杯内细胞悬液移植于新的培养容器里，加入培养液继续培养；其中所述克隆杯为一个两端开口、中空柱状物，其内径大小能够圈住干细胞克隆团。
2.如权利要求1所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述两端开口、中空柱状物 为不锈钢管，其高度略低于标准培养皿内高。
3.如权利要求2所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述不锈钢管的端面为光滑的。
4.如权利要求3所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述不锈钢管的端面涂有凡 士林。
5.如权利要求1所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述干细胞可为胚胎干细 胞、胚胎生殖细胞、诱导性多潜能干细胞或成体干细胞中之一。
6.如权利要求5所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述成体干细胞为骨髓间充 质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、羊膜干细胞、或羊水干细胞。
7.如权利要求5所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述成体干细胞为羊水干细胞。
8.如权利要求7所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述羊水干细胞为人羊水干 细胞。
9.如权利要求1所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述干细胞为人羊水干细胞 时，所述培养液为α -MEM+20% FBS+1%谷氨酰胺+1%青霉素/链霉素+1%非必须氨基酸 +0. 5πιΜβ巯基乙醇。
10.如权利要求1所述的干细胞分离纯化方法，其特征在于所述培养容器是细胞培养 皿或培养板。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞分离纯化方法。本发明提供了一种干细胞分离纯化方法，包括下列步骤干细胞培养将干细胞细胞悬液或含有干细胞的细胞悬液接种于培养容器中，加入培养液培养至出现干细胞克隆团；干细胞分离纯化弃去培养液，加入平衡盐溶液洗去残余培养液，弃平衡盐溶液；加入平衡盐溶液，放置克隆杯圈住干细胞克隆团，一个克隆杯圈住单个干细胞克隆团；弃杯内的平衡盐溶液，加入酶液，将干细胞克隆团消化成细胞悬液；将杯内细胞悬液移植于新的培养容器里，加入培养液继续培养；其中所述克隆杯为一个两端开口、中空柱状物，其内径大小能够圈住干细胞克隆团。本方法操作简捷，分离细胞纯度高，具有较高的经济效益。
文档编号C12N5/10GK101818126SQ20091019787
公开日2010年9月1日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者周君梅, 张胜利, 陈方 申请人:上海市儿童医院