一种髓核细胞分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种髓核细胞分离纯化方法，包括：冲洗步骤，将获取的椎间盘髓核组织用PBS冲洗干净；剪碎步骤，将所述组织剪碎；消化步骤，加入2倍体积的消化液，消化液是体积比为1：1的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液，在恒温水浴箱震荡消化设定时长，静置后吸取上清液，加入含体积分数10％FBS的DMEM培养基终止消化，剩余组织加所述消化液继续消化，如此重复多次；收集步骤，将终止消化后的液体离心，离心转速为1000～1500rpm，离心时间为5～10min，去上清，用含体积分数10％FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。本方法分离纯化过程简单快捷，消化过程温和，消化时间短，所需仪器设备简单；所获得的髓核细胞量大，存活率高，更易于在培养瓶内贴壁、附着、延伸，细胞活性比较强。
【专利说明】
-种髓核细胞分离纯化方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种分离纯化方法，具体来说是指一种椎间盘髓核细胞的分离纯化方 法。
【背景技术】
[0002] 腰痛构成了一个可观的流行病学和经济学问题，尽管腰痛的原因有许多，但是一 个很明显的原因是与椎间盘的退变极大相关。椎间盘随年龄增长由于各种原因而导致退 变，而髓核组织中存在最明显的改变。椎间盘的退变速度远比其他组织要快，从而改变了脊 柱的力学，而运种损伤极难自我修复。目前的治疗包括非手术治疗(例如锻炼、物理治疗如 热/冷刺激、电刺激、针灸、牵引W及止痛药物)和手术治疗(融合术和微创），但是手术常常 达不到缓解疼痛的目的，还可能加速邻近间盘的退变性改变。组织工程技术提供了修复退 变椎间盘功能的一条有效方法。大多数研究直接指向了髓核组织工程，因为椎间盘退变被 认为起源于髓核组织区域，而临床微创手术可获取大量退变髓核组织，研究者试图通过从 髓核组织内分离得到髓核细胞，从而在体外通过髓核细胞来研究椎间盘退变的机制。目前， 关于人髓核细胞的分离培养方法不一，所用消化酶及消化时间（2-4h，4-化，6-她、过夜）差 异较大，而且所获取的细胞量较少，存活率也较低。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供了一种新的髓核细胞分离纯化方法。
[0004] 本发明的一种髓核细胞分离纯化方法，包括如下步骤：
[0005] 冲洗步骤，将椎间盘髓核组织冲洗干净；
[0006] 剪碎步骤，将所述组织剪碎；
[0007] 消化步骤，利用消化液消化所述组织；
[000引收集步骤，收集消化下来的髓核细胞。
[0009] 所述消化步骤可W重复多次。
[0010] 所述消化液包含II型胶原酶和膜蛋白酶中的至少一种。
[00川所述消化液是体积比为1:1的0.5 % II型胶原酶和0.25 %膜蛋白酶混合液。
[0012] 所述消化步骤中，终止液是含体积分数10%FBS的高糖DMEM。
[0013] 所述收集步骤中，通过离屯、作用收集消化下来的髓核细胞。
[0014] 所述剪碎步骤中，剪碎后的所述组织的直径不大于1mm。
[0015] -种髓核细胞分离纯化方法，包括如下步骤：
[0016] a)将获取的髓核组织置于含双抗的PBS中，分离髓核组织周围的纤维环组织，然后 用PBS冲洗干净；
[0017] b)将冲洗干净后的髓核组织剪碎，加入消化液，在恒溫水浴箱中震荡消化过夜，并 用终止液终止消化；
[001引 C)离屯、，弃上清及用DMEM重悬细胞。
[0019] 所述步骤b)中，所述消化液是2倍体积的0.5% II型胶原酶和0.25 %膜蛋白酶混合 液，且所述II型胶原酶和0.25%膜蛋白酶的体积比是1:1。所述步骤b)中，所述终止液是含 体积分数10 % FBS的DMEM。
[0020] -种髓核细胞分离纯化方法，包括如下步骤：
[0021] 冲洗步骤，将获取的椎间盘髓核组织用PBS冲洗干净；
[0022] 剪碎步骤，将所述组织剪碎；
[0023] 消化步骤，加入2倍体积的消化液，消化液是体积比为1:1的0.5% II型胶原酶和 0.25%膜蛋白酶混合液，在恒溫水浴箱震荡消化设定时长，静置后吸取上清液，加入含体积 分数10 % FBS的DMEM培养基终止消化，剩余组织加所述消化液继续消化，如此重复多次；
[0024] 收集步骤，将终止消化后的液体离屯、，离屯、转速为1000~1500巧m，离屯、时间为5~ lOmin，去上清，用含体积分数10 %FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。
[00巧]较佳的是，离屯、转速为1500巧m，离屯、时间为1 Omin。
[0026] 本发明的有益效果是:分离纯化过程简单快捷，消化过程溫和，消化时间短，所需 仪器设备简单，成本较低；所获得的髓核细胞量大，存活率高，更易于在培养瓶内贴壁、附 着、延伸，细胞活性比较强。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0028] 本实施方式髓核细胞分离纯化方法包括如下步骤:获取手术椎间盘髓核组织后， 将组织用PBS冲洗S遍，尽量将组织上残留的血液冲洗干净;洗净后尽量吸去残留的PBS溶 液，无菌条件下用眼科剪将组织尽可能的剪碎;加入2倍体积的胶原酶-膜酶混合液(0.5% 浓度的II型胶原酶和0.25%浓度的膜蛋白酶的体积比是1:1)，37°C消化15min，静置后吸取 上清液，加入含体积分数10 %FBS(FBS，胎牛血清）的DMEM培养基终止消化，剩余组织加胶原 酶-膜酶混合液继续消化，如此重复S次。将终止消化后的液体离屯、，离屯、转速1500rpm，离 屯、时间lOmin，去上清，用含体积分数10 % FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。
[0029] 本实施方式中，获取的髓核组织需用PBS洗多次，尽量去除血液残留，髓核组织用 眼科剪剪碎，要尽可能剪到直径1mm W下。
[0030] 本实施方式中，所用消化液为0.5%11型胶原酶和0.25%膜蛋白酶等体积混合液。 当然，II型胶原酶和膜蛋白酶的体积比也可W是2:1或1:2。较佳的是，体积比是1:1，此时， 消化时间和细胞存活率较佳。
[0031] 本实施方式中，消化时间15min是指每次加入消化液后、37°C恒溫水浴震荡消化 15min，剩余未被消化的组织继续加消化液消化，反复重复多次;每次消化可W使用同样的 消化液。重复次数如3次。
[0032] 本实施方式中，消化反应的终止液可W选用含10%FBS的高糖DMEM。当然，终止液 可 W 选用含 10%FBS 的 RPMI1640。
[0033] 本实施方式中，离屯、转速为1500巧m，离屯、时间为lOmin。
[0034] 本实施方式的关键是手术所取髓核组织消化前要尽可能将血液洗净，W免残留血 细胞影响髓核细胞的沉降贴壁;眼科剪要尽可能将组织剪碎，W减少消化时间，从而减少酶 对细胞的损伤;消化液为胶原酶和膜蛋白酶的混合液，一方面避免单独用胶原酶消化时间 过长，另一方面避免膜蛋白酶作用太强对细胞造成损伤；消化过程重复=次，每次作用 15min，可避免酶对已消化下来的髓核细胞造成损伤;离屯、1500rpm、10min可W最大程度收 集消化下来的髓核细胞。
[0035] 实施例1:
[0036] 手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素）的PBS中，小屯、分离周围少量的纤维 环组织，然后用PBS冲洗S次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径约1mm大 小，加入2倍体积0.5% n型胶原酶，37°C恒溫水浴箱中震荡消化过夜。用含体积分数10%胎 牛血清的DMEM培养基终止消化，100化/min离屯、5min;弃上清(主要作用为去除残存的消化 酶），用含体积分数10%胎牛血清的重悬细胞。使用台吩蓝染色检测细胞存活率、血球 计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X lOVml后，接种于T25培养瓶，置于37 °C、5 % C〇2 培养箱中培养，24h换液1次，W后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。
[0037] 实施例2:
[0038] 手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素）的PBS中，小屯、分离周围少量的纤维 环组织，然后用PBS冲洗S次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm 大小，加入2倍体积0.5 % n型胶原酶，37°C恒溫水浴箱中震荡消化过夜。用含体积分数10 % 胎牛血清的DMEM培养基终止消化，15(K)r/min离屯、lOmin;弃上清(主要作用为去除残存的消 化酶），用含体积分数10 %胎牛血清的重悬细胞。使用台吩蓝染色检测细胞存活率、血 球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X 105/ml后，接种于T25培养瓶，置于37 °C、5 % C〇2 培养箱中培养，24h换液1次，W后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。
[0039] 实施例3:
[0040] 手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素）的PBS中，小屯、分离周围少量的纤维 环组织，然后用PBS冲洗S次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm 大小，加入2倍体积0.25%膜蛋白酶，37°C恒溫水浴箱中震荡消化化。用含体积分数10%胎 牛血清的DMEM培养基终止消化，150化/min离屯、lOmin;弃上清(主要作用为去除残存的消化 酶），用含体积分数10%胎牛血清的重悬细胞。使用台吩蓝染色检测细胞存活率、血球 计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X 105/ml后，接种于T25培养瓶，置于37 °C、5 % C〇2培 养箱中培养，24h换液1次，W后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。
[0041 ] 实施例4:
[0042] 手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素）的PBS中，小屯、分离周围少量的纤维 环组织，然后用PBS冲洗S次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm 大小，加入2倍体积0.5% n型胶原酶和0.25%膜蛋白酶混合液(体积比1:1 )，37°C恒溫水浴 箱中震荡消化4h。用含体积分数10 %胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1500r/min离屯、 lOmin;弃上清(主要作用为去除残存的消化酶），用含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬细 胞。使用台吩蓝染色检测细胞存活率、血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X 105/ ml后，接种于T25培养瓶，置于37°C、5%C02培养箱中培养，24h换液1次，W后每3天换液1 次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。
[0043] 实施例5:
[0044] 手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素）的PBS中，小屯、分离周围少量的纤维 环组织，然后用PBS冲洗S次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm 大小，加入2倍体积0.5% n型胶原酶和0.25%膜蛋白酶混合液（1:1)，37°C恒溫水浴箱中震 荡消化15min。静置后取上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，剩余组 织加酶继续消15min，如此重复S次直至组织完全消化，终止消化后1500r/min离屯、lOmin; 弃上清(主要作用为去除残存的消化酶），用含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬细胞。使 用台吩蓝染色检测细胞存活率、血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X lOVml后， 接种于T25培养瓶，置于37°C、5%C02培养箱中培养，24h换液1次，W后每3天换液1次。倒置 相差显微镜下观察细胞形态。
[0045] 现有文献显示常用消化酶组分为n型胶原酶、膜蛋白酶、DNA酶、链霉蛋白酶等单 独或混合使用，而文献报道的消化时间为20min，45min，化，2-地，4-化，6-8h、过夜等，差异 较大，国内外说法各异，而有研究者认为0.2 % n型胶原酶消化髓核组织块4h为获取髓核细 胞的最佳条件。本
【申请人】用0.5% n型胶原酶进行了尝试，即使把组织剪碎成糜烂状，4h仍 不能完全消化组织，因而不能获得全部细胞。同时本
【申请人】也用0.25%膜蛋白酶进行消化， 消化过程很快（化左右），但死细胞很多，细胞存活率很低，说明膜蛋白酶对细胞损伤很大。 而最后本
【申请人】混合胶原酶和膜蛋白酶，加快了消化过程(分=次消化，每次15min，如果组 织小于500mg，两次即可完全消化），减少了获取髓核细胞操作过程所需要的时间。而且混合 胶原酶可使作用溫和，避免膜蛋白酶强的作用对细胞造成的损伤。
[0046] 各种消化液的消化结果如表1所示。
[0047] 表1各种消化液的消化结果对比 [004引
[0049] 本消化时间和所获细胞量W500mg组织计算，如果组织大于500mg，则需消化S次。 当0.5% n型胶原酶/0.25%膜蛋白酶体积比是1:1时，如果组织小于500mg，可W只消化两 次;如果大于500mg，则需消化S次。表1中，当体积比是1:1时，消化总时间较短、所获总细胞 较多且细胞存活率较高。
[0050] W上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤： 冲洗步骤，将椎间盘髓核组织冲洗干净； 剪碎步骤，将所述组织剪碎； 消化步骤，利用消化液消化所述组织； 收集步骤，收集消化下来的髓核细胞。2. 如权利要求1所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化步骤重复多次。3. 如权利要求1或2所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化液包含II型 胶原酶和胰蛋白酶中的至少一种。4. 如权利要求3所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化液是体积比为1: 1的0.5 % II型胶原酶和0.25 %胰蛋白酶混合液。5. 如权利要求1-3中任意一项所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化步 骤中，终止液是含体积分数10 % FBS的高糖DMEM。6. 如权利要求1-3中任意一项所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述收集步 骤中，通过离心作用收集消化下来的髓核细胞。7. 如权利要求1-3中任意一项所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述剪碎步 骤中，剪碎后的所述组织的直径不大于1mm。8. -种髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 将获取的髓核组织置于含双抗的PBS中，分离髓核组织周围的纤维环组织，然后用 PBS冲洗干净； b) 将冲洗干净后的髓核组织剪碎，加入消化液，在恒温水浴箱中震荡消化过夜，并用终 止液终止消化； c) 离心，弃上清及用DMEM重悬细胞。9. 如权利要求8所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述消化 液是2倍体积的0.5% II型胶原酶和0.25 %胰蛋白酶混合液，且所述0.5% II型胶原酶和 0.25 %胰蛋白酶的体积比是1:1。10. -种髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤： 冲洗步骤，将获取的椎间盘髓核组织用PBS冲洗干净； 剪碎步骤，将所述组织剪碎； 消化步骤，加入2倍体积的消化液，消化液是体积比为1:1的0.5% II型胶原酶和0.25% 胰蛋白酶混合液，在恒温水浴箱震荡消化设定时长，静置后吸取上清液，加入含体积分数 10 % FBS的DMEM培养基终止消化，剩余组织加所述消化液继续消化，如此重复多次； 收集步骤，将终止消化后的液体离心，离心转速为1 〇 〇 〇~15 0 0 r p m，离心时间为5~ lOmin，去上清，用含体积分数10 %FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。
【文档编号】C12N5/077GK106047801SQ201610371318
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】朱艳霞, 周光前
【申请人】深圳大学