豌豆蛋白的新型分离方法

豌豆蛋白的新型分离方法
【专利摘要】本发明提供了分离豌豆蛋白的方法。所述方法开始于豌豆蛋白的水性提取物或溶液，使其通过至少一种膨胀床吸附(EBA)过程。所述EBA过程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触，所述吸附树脂包含具有特定化学结构的至少一种配体(L1或L2)。目标蛋白通过将其从所述吸附树脂洗脱而分离。本发明还提供了经由本发明的方法可获得的各种蛋白组合物。
【专利说明】豌豆蛋白的新型分离方法发明领域
[0001]本发明涉及豌豆蛋白的分离方法以及由所述方法获得的纯化的豌豆蛋白。
[0002]发明背景
[0003]豌豆(来自(Pisum Sativum)植物的种子)是人类和动物的未加工形式和加工形式的蛋白的重要来源。
[0004]WO 2011/122937、W0 1998/033388和WO 2011/050471 全部涉及分离、纯化和使用豌豆蛋白的各个方面。另外，Croy等，B1chem J.1980,191,509-516讨论了来自豌豆的伴豌豆球蛋白(convicilin)的纯化和特性。
[0005]分离豌豆蛋白级分的先前方法通常涉及给定级分的沉淀。在盐的分级中，豆球蛋白在盐中沉淀，豌豆球蛋白保持可溶的。然而，当分离富含豌豆球蛋白的级分时，伴豌豆球蛋白已被证明是污染物，并且难以避免。豆球蛋白级分通常被伴豌豆球蛋白污染。伴豌豆球蛋白污染在大规模的分离过程中是典型的(参见，例如Geuguen等，J.Sc1.FoodAgric.1984,35,1024-1033；Larre&Gueguen,J.Chromatogr.1986,361,169-178)。
[0006]发明目标
[0007]尽管至今已取得进步，但仍需要从豌豆蛋白的水性提取物或溶液中纯化和分离蛋白的替代和改善的方法。
[0008]发明概述
[0009]本发明人已经发现某些配体对豌豆蛋白中的各种蛋白显示出选择性亲和力。因此，在第一方面，本发明涉及分离豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0010]1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少两种类型的豌豆蛋白；
[0011]i1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通过至少一种膨胀床吸附过程，其中所述膨胀床吸附过程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触以提供未结合的蛋白级分和结合的蛋白级分，所述吸附树脂选择性地吸附至少第一类型的豌豆蛋白，所述吸附树脂包含:
[0012]至少一种配体(LI)，所述至少一种配体(LI)包含芳族或杂芳族环系和一种或多种酸性基团，或者
[0013]至少一种配体(L2)，所述至少一种配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自以下的一个或多个基团取代的胺:
[0014]a.芳基、苄基或杂芳基；
[0015]b.具有4-16个碳原子的烷基，所述烷基可以为直链、支链或环状的；
[0016]或者它们的组合；
[0017]ii1.通过洗脱所述未结合的蛋白级分或所述结合的蛋白级分从所述吸附树脂中分离所述第一类型的豌豆蛋白；以及
[0018]iv.从所述吸附树脂中分离第二类型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白组合物，所述第二豌豆蛋白组合物在所述第一类型的豌豆蛋白中被消耗。
[0019]方法以及配体LI和L2的进一步详细内容在本发明的下述详述以及所附权利要求中给出。
[0020]本发明还提供了通过本发明的方法获得的豌豆蛋白组合物。
【附图说明】
[0021]图1-11示出本发明实例的SDS-PAGE凝胶。
[0022]图12-16b示出，与商用豌豆蛋白来源相比，根据本发明分离的豌豆蛋白的性质。
[0023]发明详述
[0024]如上所述，本发明提供了分离豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0025]1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少两种类型的豌豆蛋白；
[0026]i1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通过至少一种膨胀床吸附过程，其中所述膨胀床吸附过程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触以提供未结合的蛋白级分和结合的蛋白级分，所述吸附树脂选择性地吸附至少第一类型的豌豆蛋白，所述吸附树脂包含:
[0027]至少一种配体(LI)，所述至少一种配体(LI)包含芳族或杂芳族环系和一种或多种酸性基团，或者
[0028]至少一种配体(L2)，所述至少一种配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自以下的一个或多个基团取代的胺:
[0029]a.芳基、苄基或杂芳基；
[0030]b.具有4-16个碳原子的烷基，所述烷基可以为直链、支链或环状的；
[0031]或者它们的组合；
[0032]ii1.通过洗脱所述未结合的蛋白级分或所述结合的蛋白级分从所述吸附树脂中分离所述第一类型的豌豆蛋白；以及
[0033]iv.从所述吸附树脂中分离第二类型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白组合物，所述第二豌豆蛋白组合物在所述第一类型的豌豆蛋白中被消耗。
[0034]适当地，方法的步骤依序进行，而无介入步骤。
[0035]豌豆和豌豆蛋白
[0036]豌豆为豌豆植物的种子，是生长于世界许多地区的豆科作物。豌豆作为食品和食品成分的来源具有重大的经济重要性。
[0037]婉?蛋白是婉?中存在的蛋白的通用术语。婉?含有约25%的蛋白。
[0038]豌豆中大的蛋白级分为:
[0039]1.凝集素
[0040]2.豆球蛋白(类似于大豆球蛋白)，60kDa并且可以被分成40kDa和20kDa的亚基。[0041 ] 3.豌豆球蛋白，50kDa并且可以被分成331^^、301^^、191^^、171^^和12.51^3的亚基。
[0042]4.伴碗豆球蛋白，70kDa
[0043]已经开发了复杂的实验室程序以将蛋白彼此分级。此类技术不能实际地应用于商业规模生产。这些技术中的一些也难以再现，因为程序中小的变化显著地改变产物的最终组成。
[0044]方法
[0045]根据本发明的方法开始于豌豆蛋白的粗制水性提取物或豌豆蛋白的溶液。通常，豌豆蛋白的水性提取物通过用水或者稀酸或稀碱提取豌豆或豌豆产物(例如压碎的豌豆或豌豆粉)获得。提取优选在I至60°C的温度下进行0.1至20小时。水可以具有近中性的pH(pH
6.5-7.5),或者可以为碱性的，例如pH 8.Ο-pH 12。在一些情况下，在提取期间，提取混合物的pH通过添加水性碱而在优选范围内保持恒定。
[0046]在一些情况下，豌豆蛋白为来源于通过进一步加工如沉淀、离心和过滤(包括膜过滤，如超滤、钠滤和微滤)的粗提物的豌豆蛋白的溶液。在优选实施方案中，豌豆蛋白溶液由蛋白沉淀物制备，所述蛋白沉淀物通过酸化近中性或碱性豌豆蛋白提取物获得。
[0047]豌豆蛋白可以来自于豌豆中所有豌豆蛋白的“全部”提取物。豌豆蛋白也可以来自于豌豆乳清，在低PH(?pH 4.5)时，大部分蛋白已经从所述豌豆乳清中沉淀，而在提取物中留下低PH的可溶性蛋白。
[0048]为了与分离过程的pH相匹配，豌豆蛋白的水性提取物或溶液可以在步骤(ii)之前进行PH调节，优选将pH调节至2.0-9.0。调节pH可以导致水性提取物中的蛋白质沉淀，因此可以倾析、离心或过滤PH-调节的豌豆蛋白提取物以在步骤(ii)之前移除不溶性材料。
[0049]豌豆蛋白的水性提取物或溶液包含至少两种类型的豌豆蛋白-第一类型的豌豆蛋白和第二类型的豌豆蛋白。
[0050]使豌豆蛋白的水性提取物或溶液通过至少一种分离过程，所述分离过程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物与至少一种吸附树脂接触。
[0051]吸附树脂选择性地吸附至少第一类型的豌豆蛋白，并且可能吸附其它豌豆蛋白。因此，获得了未结合的蛋白级分和结合的蛋白级分。
[0052]分离过程为固相吸附过程:膨胀床吸附(EBA)。
[0053]膨胀床吸附(EBA)
[0054]在近些年开发的各种工业色谱分离技术中，膨胀床吸附(EBA)已经成功地引入生物技术产业的某些领域中。EBA为一类流化床吸附，其中返混水平保持最小。与其它色谱分离技术相比，EBA提供显著的优势，因为它可以直接使用非澄清进料。
[0055]在EBA期间，当应用液体流时，允许吸附树脂的床在色谱柱内膨胀。床的膨胀通常在柱或一些其它穿孔装置中实现，所述柱具有在其各个末端提供的网状结构，所述网状结构覆盖柱的横截面积，所述穿孔装置在流动中不产生湍流。参见，例如W0-A-9218237(Amersham Pharmacia B1tech AB, Sweden)。相同效果也在利用揽动的输入流WO-A-9200799的系统(UpFront Chromatography A/S)中观察到。
[0056]在膨胀床状态中，树脂的吸附剂颗粒之间的距离致使进料流中的微粒杂质自由通过。相比之下，传统的填充床充当可以阻塞的深层过滤器，从而产生增加的反压，除非进料完全澄清。由于在EBA柱中未积累显著的压力，所以可能应用EBA而无通常与填充床柱相关的大小和流速的限制。因此，在本发明的优选实施方案中，吸附过程未涉及填充床。
[0057]EBA过程的特征在于:柱内部液体的返混非常有限，这与熟知的湍流流化床相反。床中的返混通常被测量为轴向分散(“容器分散准数”)，SMLevenspiel，"ChemicalReact1n Engineering〃2nd Edit1n,John Wiley&Sons(1972)。
[0058]可以通过将豌豆蛋白的水性提取物以至少3cm/min，诸如至少5cm/min、例如至少8cm/min、诸如至少10cm/min、例如20cm/min的线性流速应用至吸附柱而有效地进行纯化。通常地，流速在5-50cm/min的范围内进行选择，诸如范围为5_15cm/min、例如范围为10-30cm/min、诸如范围为25_50cm/min。
[0059 ] 豌豆蛋白溶液/提取物的温度优选在1°C -90 °C的范围内，诸如范围为5 °C -18 °C、诸如范围为7°C_15°C、诸如范围为19°C_80°C、诸如范围为19°C_70°C、诸如范围为25°C_65°C、诸如范围为45°C_60°C。
[0060]当将豌豆蛋白的水性提取物或溶液添加至吸附柱时，柱中存在的吸附颗粒与材料悬浮液之间的比率可以进行优化以便保留吸附柱的高容量以及获得高纯度的待纯化的蛋白产物。在本发明的优选实施方案中，在柱中存在的吸附剂相对于待上样至柱的豌豆蛋白的水性提取物以至少1:0.5、诸如至少1: 1、例如至少1:3、诸如至少1:5、例如至少1:8、诸如至少1:10、例如至少1:12、诸如至少1:15、例如至少1:20、诸如至少1:25、例如1:30、诸如1:30的比率提供，所述比率基于体积/体积测量的。
[0061]第一类型的豌豆蛋白通过洗脱未结合的蛋白级分或结合的蛋白级分从所述吸附树脂中分呙。
[0062]分离过程可以以许多方式起作用，现将对所述方式进行描述。
[0063]通常，第一类型的豌豆蛋白级分以结合的蛋白级分保持吸附在树脂上，而第二类型的豌豆蛋白(为未结合的蛋白级分)在第一洗脱(洗涤)步骤中洗脱。随后进行第二洗脱步骤，其释放第一类型的豌豆蛋白(为结合的蛋白级分)。
[0064]可选地，第二类型的豌豆蛋白保持吸附在树脂上，而第一类型的豌豆蛋白在第一洗脱(洗涤)步骤期间从所述吸附树脂上洗脱。在一个或多个后续的洗脱步骤中，第二类型的豌豆蛋白然后被释放，并且基本上分离而不含第一类型的豌豆蛋白。
[0065]在一个方面，基本上全部豌豆蛋白(包括第一类型的豌豆蛋白)最初吸附至所述吸附树脂上，然后在含有部分第一类型的豌豆蛋白或者不含第一类型的豌豆蛋白的情况下，将第一类型的豌豆蛋白在第二洗脱步骤(在第一洗脱(洗涤)步骤以去除其它未结合的物质之后)中从所述吸附树脂洗脱，然后将剩余的第二类型的豌豆蛋白在第三或进一步后续洗脱步骤中洗脱。
[0066]为了获得纯化的第一类型的豌豆蛋白，洗脱可以通过现有技术常规描述和已知的任何方法进行。吸附的蛋白产物的洗脱可以用通常选自以下的溶液进行:稀碱、稀酸、稀的缓冲液、稀盐溶液和水或者它们的组合。在优选的实施方案中，洗脱和/或洗涤步骤用稀溶液进行以使得在洗脱产物中存在的盐和其它不需要的物质的量最小化。
[0067]优选地，用于洗脱第一类型的豌豆蛋白级分和/或第二类型的豌豆蛋白产物的稀溶液的盐、缓冲液、酸或碱的浓度小于200mM、优选地小于lOOmM、优选地小于50mM、优选地小于30mM、甚至更优选地小于20mM。盐、缓冲液、酸或碱浓度的测定直接在含有待分离的一种蛋白或多种蛋白的洗出液级分中进行，而无需另外稀释洗出液级分。通常，低成本且无毒的盐、缓冲液、酸和碱为适用的。特别优选的盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵。特别优选的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液。特别优选的酸为柠檬酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸、盐酸。特别优选的碱为氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化Ii(Ca(OH)2)、氢氧化钱(NH4OH)。所有这些可以进行组合以实现优化的洗脱程序。
[0068]在本发明的实施方案中，可以使用包含小于5%(v/v)的有机溶剂、诸如小于3%(v/v)的有机溶剂、例如小于I % (v/v)的有机溶剂、诸如O % (v/v)的有机溶剂的洗脱液进行洗脱。
[0069]吸附树脂
[0070]在本发明的实施方案中，吸附树脂包含至少一种配体(LI)。配体(LI)包含芳族或杂芳族环系和一种或多种酸性基团。
[0071]优选地，包含芳族或杂芳族环系和/或一种或多种酸性基团的配体(LI)具有至多2000道尔顿、诸如至多1000道尔顿、诸如至多500道尔顿的分子量。
[0072]芳族环系适当地包含苯基或萘基。
[0073]在本发明的实施方案中，杂芳族部分可以选自:单环杂芳族基，其选自噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和哒嗪基；以及双环杂芳族基，其选自吲哚基、嘌呤基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基和苯并噁唑基。
[0074]在本发明的进一步实施方案中，酸性基团选自羧酸基团(-C00H)、磺酸基团(_SO2OH)、亚磺酸基团(-S(O)OH)、次膦酸基团(-PH(O) (OH))、膦酸单酯基团(_P(0) (OH) (OR))和膦酸基团(-P(O) (0H) 2)，优选羧酸基团(-COOH)。
[0075]优选地，配体(LI)可以来源于选自以下的化合物:亚甲基-苯甲酸、羟基-苯甲酸、氨基-苯甲酸、巯基-苯甲酸、巯基-烟酸、巯基-四唑乙酸，诸如2-氨基-苯甲酸、3-氨基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巯基-苯甲酸、3-巯基.苯甲酸、4-巯基-苯甲酸、5-巯基-1 -四唑乙酸、4-氨基邻苯二甲酸和5-氨基间苯二甲酸。
[0076]适当地，在配体(LI)中，所述一种或多种芳族或杂芳族环系被所述一种或多种酸性基团取代。配体LI可以包含多于一种酸性基团以及其它取代基，诸如碱性取代基和酸性取代基。
[0077]在本发明的替代实施方案中，吸附树脂包含至少一种配体(L2)。配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺。配体(L2)中的烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自以下的一个或多个基团取代的胺:
[0078]1.芳基、苄基或杂芳基；
[0079]i1.具有4-16个碳原子的烷基，所述烷基可以为直链、支链或环状的;诸如例如，丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、i^一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或十氢萘基；
[0080]或者它们的组合。
[0081]配体(L2)可以选自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N，N_二甲基-1，3_二氨基丙烧、1,3-二氨基丙烧、1,6-二氨基己烧、1,6-二氨基己烧、1,8-氨基辛烧、1,9-二氨基壬烷、I，12-氨基十二烷、2-氨基苄胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶、节胺或苯(撑)二甲(基二)胺。
[0082]具体优选的配体(L2)的C/N比(定义为化学式中碳原子/氮原子的数目)为至少4，诸如至少5、诸如至少6。
[0083]在本发明的实施方案中，配体(LI或L2)的浓度在10-990ymol/g吸附树脂的干物质的范围内。
[0084]在本发明的实施方案中，配体(LI或L2)的浓度在l-145ymol/ml水合的、沉降的吸附树脂的范围内。
[0085]在本发明的进一步实施方案中，配体(LI或L2)的浓度在l-130ymol/g湿的但抽吸-沥干的吸附树脂的范围内。
[0086]优选地，配体(LI或L2)的浓度在I O-1 ΟΟμπιο I /g湿的但抽吸-沥干的吸附树脂的范围内，诸如在15-80ymol/g湿的但抽吸-沥干的吸附树脂的范围内，诸如在20_60ymol/g湿的但抽吸-沥干的吸附树脂的范围内。
[0087]除配体(LI或L2)之外，吸附树脂包含聚合物基础基质，其构成大部分的吸附树脂，并且支撑在其上的配体(LI或L2)。
[0088]聚合物基础基质可以在通常选自以下的某些类型的天然或合成的有机聚合物中寻找:i)天然和合成的多糖以及基于其它碳水化合物的聚合物，包括琼脂、海藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、盖提胶(gum ghatti)、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐树豆胶、黄原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋白、葡聚糖、淀粉、肝素、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；ii)合成的有机聚合物与单体产生聚合物，包括丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烃和它们的取代衍生物以及包含功能上多于一种此类聚合物的共聚物和它们的取代衍生物；以及i i i)它们的混合物。聚合物基础基质的优选组为多糖，诸如琼脂糖。
[0089]在本发明的实施方案中，吸附树脂呈颗粒形式。吸附树脂颗粒可以至少部分地透过待分离的蛋白以便确保与不可透过的颗粒相比显示出显著的结合能力，所述不可透过的颗粒仅可以在其表面结合靶蛋白，从而产生相对低的结合能力。吸附树脂颗粒可以为一系列不同的结构、组成和形状。
[0090]吸附剂可以进一步呈多孔纤维或多孔膜的形式。
[0091]配体LI或L2可以通过本身已知可适用于该目的的任何类型的共价键与聚合物基础基质连接，所述连接可以通过配体与固相材料之间直接的化学反应进行或者通过用本身已知可能将基质和配体连接的适当的试剂活化前述的聚合物基础基质或配体进行。
[0092]此类适当的活化试剂的实例为表氯醇、表溴醇、烯丙基缩水甘油醚；双环氧化合物，诸如丁二醇二缩水甘油醚;卤素取代的脂肪族化合物，诸如二氯丙醇、二乙烯砜;羰基二咪唑;醛类，诸如戊二醛;醌类;溴化氰;高碘酸盐，诸如偏过碘酸钠;碳二亚胺;氯-三嗪，诸如氰尿酰氯;磺酰氯，诸如甲苯磺酰氯和tresyl chlorides;N-轻基琥?白酰亚胺;2_氟_1_甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐;噁唑酮；马来酰亚胺;吡啶基二硫化物;和酰肼。在这些中，优选留下不同于单键的间隔基团SPl的活化试剂，例如表氯醇、表溴醇、烯丙基缩水甘油醚;双环氧化合物；卤素取代的脂肪族化合物;二乙烯砜;醛类;醌类;溴化氰;氯-三嗪;噁唑酮;马来酰亚胺;吡啶基二硫化物;和酰肼。
[0093]特别令人关注的活化试剂被认为是环氧-化合物，诸如表氯醇、烯丙基缩水甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚。在某些情况下，活化试剂甚至可以构成促成免疫球蛋白与聚合物基础基质结合的官能团的一部分，例如在二乙烯砜被用作活化试剂的情况下。在其它情况下，活化试剂在官能团与基质反应期间从基质释放。当使用羰基二咪挫(carbodi imidazoles)和碳二亚胺时，则将是上述情况。
[0094]上文提及的可能性使得与定义存在连接聚合物基础基质和配体LI或L2的任选间隔基团SPl相关。在本发明的上下文中，间隔基团SPl被认为是活化试剂的一部分，所述间隔基团SPl在基质与配体之间形成连接。因此，间隔基团SPl对应于涉及的活化试剂和偶联反应。在一些情况下，例如当使用碳二亚胺时，活化试剂形成基质或配体试剂的活化形式。在偶联之后，在配体与基质间质之间未留下活化试剂部分，因此，SPl仅为单键。
[0095]在其它情况下，间隔基团SPl为实现结合特性(即配体)的官能团的组成部分，并且如果间隔基团SPl包含官能活性位点或取代基，诸如硫醇、胺类、酸性基团、砜基、硝基、羟基、腈基或能够通过氢键、静电键合或排斥、电荷转移等发生相互作用的其它基团，则这为特别重要的。
[0096]在其它情况下，间隔基团SPl可以包含芳族或杂芳族环，其在固相基质的结合特性中起重要作用。例如，如果醌类或氯三嗪被用作聚合物基础基质或配体LI或L2的活化剂，则将是上述情况。
[0097]优选地，间隔基团SPl为来源于活化试剂的单键或双基团，所述活化试剂选自表氯醇、烯丙基缩水甘油醚、双环氧化合物诸如丁二醇二缩水甘油醚、卤素取代的脂肪族化合物诸如I，3_二氯丙-2-醇、醛类诸如戊二醛、二乙烯砜、醌类、溴化氰、氯-三嗪诸如氰尿酰氯、2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐、马来酰亚胺、噁唑酮和酰肼。优选地，间隔基团SPl选自，例如式-ch2-ch(oh)-ch2-(来源于表氯醇)、-(ch2)3-o-ch2-ch(oh)-ch2-(来源于烯丙基缩水甘油醚)或-CH2-CH(0H)-CH2-0-(CH2)4-0-CH2-CH(0H)-CH2-(来源于丁二醇二缩水甘油醚)的短链脂肪族双基团;或单键。
[0098]因此，吸附树脂颗粒可以由许多化学上衍生的多孔材料构成，所述多孔材料具有在给定流速下操作的必要密度和结合能力。
[0099]吸附树脂颗粒的密度可以为至少1.3g/mL、更优选为至少1.5g/mL、更优选为至少1.8g/mL、甚至更优选为至少2.0g/mL、更优选为至少2.3g/mL、甚至更优选为至少2.5g/mL、最优选为至少2.8g/mL以便使方法的高生产率成为可能。
[0100]在本发明的优选实施方案中，吸附树脂颗粒的平均粒径为至多500μπι、具体为至多450μηι、更具体为至多400μηι、甚至更具体为至多350μηι、甚至更具体为至多300μηι、甚至更具体为至多250μπι诸如至多200μπι。
[0101]吸附树脂颗粒可以在聚合物基础基质内包含一个或多个无孔芯。聚合物基础基质充当覆盖多个(或单个)芯材料和保持多个(或单个)芯材料在一起的装置。吸附树脂颗粒可以为如WO 92/00799中所述的凝聚成团型，每个被多孔材料包围的颗粒具有至少两个无孔芯。在凝聚成团型吸附树脂颗粒中的无孔芯适当地为不同类型和尺寸，例如由两个或更多个高密度颗粒组成的芯颗粒通过周围的琼脂糖(聚合物基础基质)保持在一起。
[0102]吸附树脂颗粒也可以为薄膜型，每个颗粒具有单个无孔芯，所述颗粒被多孔材料例如被琼脂糖包被的高密度不锈钢珠或固体玻璃珠包围。
[0103]无孔芯通常构成吸附树脂颗粒的总体积的至多50%，诸如至多40%，优选至多30 % ο无孔芯可以随机分布在聚合物基础基质内并且不一定位于吸附树脂颗粒的中心。
[0104]适当的无孔芯材料的实例为无机化合物、金属、重金属、基本的非金属(elementary non-metals)、金属氧化物、非金属氧化物、金属盐和金属合金等。此类芯材料的实例为金属硅酸盐、金属硼硅酸盐;陶瓷，包括二硼化钛、碳化钛、二硼化锆、碳化锆、碳化妈、碳化娃、氮化招、氮化娃、氮化钛、氧化乾、金属娃粉和二娃化钼(mo lybdenumdisiIide);金属氧化物和硫化物，包括镁、铝、钛、银、络、错、給、猛、铁、钴、镍、铜和银的氧化物;非金属氧化物;金属盐，包括硫酸钡;金属元素，包括钨、锆、钛、铪、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铟、铜、银、金、钯、铂、钌、锇、铑和铱，以及金属元素的合金，诸如所述金属元素之间形成的合金，例如不锈钢;碳的结晶形式和非晶形形式，包括石墨、碳黑和炭。优选的无孔芯材料为碳化妈、妈、钢和钦珠诸如不镑钢珠。
[0105]蛋白组合物及其制备
[0106]本发明提供了豌豆蛋白组合物和组合的豌豆蛋白产物的途径。
[0107]在第一类型的豌豆蛋白中被消耗的第二豌豆蛋白组合物通过从吸附树脂中分离第二类型的豌豆蛋白来提供。在本发明的上下文中，第二豌豆蛋白在所述第一类型的豌豆蛋白中“被消耗”，意指在第二豌豆蛋白中的第一豌豆蛋白的量借助于方法而减少。然而，在一个方面，第一类型的豌豆蛋白可以从第二豌豆蛋白中完全去除。
[0108]优选地，分离第一类型的豌豆蛋白和第二类型的豌豆蛋白以使得在分离过程之前和之后，基于蛋白的重量/重量测量时，第一类型的豌豆蛋白含有的第二类型的蛋白的初始量小于30%、诸如小于25%、诸如小于20%、诸如小于15%、诸如小于10%、诸如小于5%。
[0109]还优选的是分离第一类型的豌豆蛋白和第二类型的豌豆蛋白以使得在分离过程之前和之后，基于蛋白的重量/重量测量时，第二类型的豌豆蛋白含有的第一类型的蛋白的初始量小于30%、诸如小于25%、诸如小于20%、诸如小于15%、诸如小于10%、诸如小于
[0110]在一些情况下，优选分离第一类型的豌豆蛋白和第二类型的豌豆蛋白以实现两种类型的蛋白的上文提及的优选分离水平。
[0111]在第一类型的豌豆蛋白中被消耗的第二豌豆蛋白组合物可以变性以提供变性的第二豌豆蛋白组合物。可以获得变性过程的选择性。变性第二豌豆蛋白组合物通过加热至温度为 50°c-100°c，诸如 50°c-90°c、诸如 50°c-80°c、诸如 55°c-80°c、诸如 60°c-80°c 而适当地发生。可选地-或者与加热处理组合-可以应用酶的蛋白质水解以使任何不需要的蛋白失活，诸如脂氧合酶、凝集素和过敏性抗原。
[0112]因此，本发明涉及通过本文所述的方法获得的第二豌豆蛋白组合物。
[0113]保健饮品
[0114]根据本发明的方法分离豌豆蛋白级分允许制备有用的食品，所述食品可以提供有益效果。一种此类有用的食品为包含豌豆蛋白级分的保健饮品。适当地，此类健康饮品的PH小于7，并且可以为例如果汁或苏打。
[0115]本发明的实施方案。
[0116]1.实施方案1.分离豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0117]1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少两种类型的豌豆蛋白；
[0118]i1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通过至少一种膨胀床吸附过程，其中所述膨胀床吸附过程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触以提供未结合的蛋白级分和结合的蛋白级分，所述吸附树脂选择性地吸附至少第一类型的豌豆蛋白，所述吸附树脂包含:
[0119]至少一种配体(LI)，所述至少一种配体(LI)包含芳族或杂芳族环系和一种或多种酸性基团，或者
[0120]至少一种配体(L2)，所述至少一种配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自以下的一个或多个基团取代的胺:
[0121]c.芳基、苄基或杂芳基；
[0122]d.具有4-16个碳原子的烷基，所述烷基可以为直链、支链或环状的；
[0123]或者它们的组合；
[0124]ii1.通过洗脱所述未结合的蛋白级分或所述结合的蛋白级分从所述吸附树脂中分离所述第一类型的豌豆蛋白；以及
[0125]iv.从所述吸附树脂中分离第二类型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白组合物，所述第二豌豆蛋白组合物在所述第一类型的豌豆蛋白中被消耗。
[0126]实施方案2.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述第二类型的豌豆蛋白保持吸附在所述树脂上，而所述第一类型的豌豆蛋白从所述吸附树脂洗脱。
[0127]实施方案3.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中第一和第二类型的豌豆蛋白最初均被吸附在所述吸附树脂上，然后将所述第一类型的豌豆蛋白从所述吸附树脂洗脱。
[0128]实施方案4.如实施方案3所述的方法，其中从所述吸附树脂洗脱所述第一类型的豌豆蛋白经由增加洗脱液的pH发生。
[0129]实施方案5.如前述实施方案中任一项所述的方法，还包括变性所述第二豌豆蛋白组合物以提供变性的第二豌豆蛋白组合物的步骤。
[0130]实施方案6.如实施方案5所述的方法，其中变性所述第二豌豆蛋白组合物通过加热至50°C-100°C的温度发生。
[0131]实施方案7.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中包含芳族或杂芳族环系和/或一种或多种酸性基团的所述配体(LI)具有至多2000道尔顿、诸如至多1000道尔顿、诸如至多500道尔顿的分子量。
[0132]实施方案8.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述配体(LI)包含芳族环系，优选为苯基或萘基。
[0133]实施方案9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述配体(LI)包含杂芳族环系，所述杂芳族环系可以选自单环杂芳族基，其选自噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和哒嗪基；以及双环杂芳族基，其选自吲哚基、嘌呤基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基和苯并噁唑基。
[0134]实施方案10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述配体(LI)包含酸性基团，其选自羧酸基团(-C00H)、磺酸基团(-SO2OH)、亚磺酸基团(-S(O)OH)、次膦酸基团(-PH(O) (OH))、膦酸单酯基团(-P(O) (OH) (OR))和膦酸基团(-P(O) (OH)2)，优选羧酸基团(_C00H)ο
[0135]实施方案11.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述配体(LI)选自亚甲基-苯甲酸、羟基-苯甲酸、氨基-苯甲酸、巯基-苯甲酸、巯基-烟酸、巯基-四唑乙酸诸如2-氨基-苯甲酸、3-氨基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巯基-苯甲酸、3-巯基.苯甲酸、4-巯基-苯甲酸、5-巯基-1-四唑乙酸、4-氨基邻苯二甲酸和5-氨基间苯二甲酸。
[0136]实施方案12.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中-在配体(LI)中-所述一个或多个芳族或杂芳族环系被所述的一个或多个酸性基团取代。
[0137]实施方案13.如实施方案1-12中任一项所述的方法，其中配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自以下的一个或多个基团取代的胺:具有4-16个碳原子的烷基，所述烷基可以为直链、支链或环状的，诸如例如丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或十氢萘基；
[0138]实施方案14.如实施方案13所述的方法，其中所述配体(L2)选自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烧、1,3-二氨基丙烧、1,6-二氨基己烧、I,
6-二氨基己烧、1,8-氨基辛烧、1,9-二氨基壬烧、1,12-氨基十二烧、2-氨基节胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶或苄胺。
[0139]实施方案15.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述吸附树脂包含聚合物基础基质，在其上支撑有所述配体(LI或L2)。
[0140]实施方案16.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述聚合物基础基质为天然或合成的有机聚合物，选自i)天然和合成的多糖以及基于其它碳水化合物的聚合物，包括琼脂、海藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、盖提胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐树豆胶、黄原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋白、葡聚糖、淀粉、肝素、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素;ii)合成的有机聚合物与单体产生的聚合物，包括丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烃和它们的取代衍生物以及包含功能上多于一种此类聚合物的共聚物和它们的取代衍生物；以及iii)它们的混合物。
[0141]实施方案17.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述吸附树脂呈颗粒形式。
[0142]实施方案18.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述豌豆蛋白的水性提取物通过在pH 6.5-7.5时用水提取豌豆或豌豆产物获得。
[0143]实施方案19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述豌豆蛋白的水性提取物通过在约pH 9.0时用水提取豌豆或豌豆产物获得。
[0144]实施方案20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之前，将所述豌豆蛋白的水性提取物进行PH调节，优选将pH调节至2.0-9.0。
[0145]实施方案21.如实施方案20所述的方法，其中在步骤(ii)之前，将pH调节的豌豆蛋白提取物进行离心或过滤以去除不溶性材料。
[0146]实施方案22.第二豌豆蛋白组合物，其在所述第一类型的豌豆蛋白中被消耗，通过实施方案I所述的方法获得。
[0147]实施方案23.变性的第二豌豆蛋白组合物，其通过实施方案5的方法获得。
实施例
[0148]实施例1
[0149]1A)琼脂糖珠的活化:
[Ο?δΟ] 将珠尺寸为20-350μηι的多种高密度琼脂糖珠的样品(由Upfront ChromatographyA/S生产，琼脂糖浓度为3-8%并且含有10%的碳化钨作为高密度填充物)进行交联并且用表氯醇(Aldrich目录号:E1055)活化。测定产生的环氧基的浓度以在20-100mmol/L珠的范围内变化。
[0151]1B)配体与活化珠的偶联:
[0152]下述一般程序用于将配体与实施例1A中所述的活化珠偶联。
[0153]I)将50ml环氧-活化珠在吸滤器上用200ml去离子水洗涤并且沥干。将沥干的吸附剂转移至250ml塑料瓶中。
[0154]2)将配体(2.5g)溶解或悬浮在50ml去离子水中，并且用2M NaOH将pH调节至10.5-12.5以获得完全溶解的配体溶液。
[0155]3)在室温下，将配体溶液与沥干的吸附剂在辊混合机上温育18小时。
[0156]4)将吸附剂用5升去离子水洗涤。
[0157]对于在水中溶解性差的配体而言，将配体溶解或悬浮在50%的乙醇中，并且用2MNaOH将pH调节至10.5-12.5。在将配体溶液与抽吸-沥干的吸附剂温育之后，将吸附剂用I升50 %的乙醇洗涤，随后用4升去离子水洗涤。
[0158]通过偶联配体上特有官能团的酸碱滴定来测定配体浓度。
[0159]将下述化合物与表氯醇-活化的琼脂糖珠如上文一般程序中所述进行偶联:
[0160]4-氨基苯甲酸、4-巯基苯甲酸、4-氨基水杨酸、丁胺、己胺、辛胺、苄胺、二氨基丙烷、1.6-二氨基己烷(4和6%的琼脂糖)、二氨基辛烷、I，9_ 二氨基壬烷、二氨基十二烷、2-氨基节胺、新戊胺、二丁胺、戊胺、N, N-二甲基-二氨基丙烧、2-氨基苯并咪卩坐、2,4-二氨基-6-羟基嘧啶、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑。
[0161]1C)配体氯甲基苯甲酸与实施例1A中所述的活化珠的偶联
[0162]I)将200ml环氧-活化珠在吸滤器上用800ml去离子水洗涤并且沥干。将沥干的吸附剂转移至500ml塑料烧杯中。
[0163]2)添加224ml去离子水。将溶液用机械混合器混合。
[0164]3)添加32.5%的氢氧化钠以达到pH 13.5(最初为25ml)。
[0165]4)添加6.7g氯甲基苯甲酸。
[0166]5)每隔15min检查pH并且添加32.5%的NaOH以将pH保持在13.5。
[0167]6)每小时添加6.7g氯甲基苯甲酸。
[0168]7)在混合8小时之后，将吸附剂用5升去离子水洗涤。
[0169]通过偶联配体上特有官能团的酸碱滴定来测定配体浓度。
[0170]ID)配体2-二乙氨基-氯乙烷(DEAE)与实施例1A中所述的活化珠的偶联
[0171]I)将200ml环氧-活化珠在吸滤器上用800ml去离子水洗涤并且沥干。然后，将其用600ml 85%的N-甲基吡咯烷酮溶液洗涤。将沥干的吸附剂转移至1000ml塑料烧杯中。
[0172]2)添加200ml 85%的N-甲基吡咯烷酮溶液。将溶液与机械混合器混合。
[0173]3)将12g DEAE添加至溶液中。
[0174]4)将50.8g NaOH添加至溶液中。
[0175]5)在2小时之后，将吸附剂用5升去离子水洗涤。
[0176]通过偶联配体上特有官能团的酸碱滴定来测定配体浓度。
[0177]IE)配体亚硫酸钠和丁磺酸内酯(SP)与实施例1A所述的活化珠的偶联
[0178]I)将200ml环氧-活化珠在吸滤器上用800ml去离子水洗涤并且沥干。将沥干的吸附剂转移至100ml塑料瓶中。
[0179]2)添加200ml 1.2M亚硫酸钠溶液。将溶液用机械混合器混合。
[0180]3)在室温下，将配体溶液与沥干的吸附剂在辊混合机上温育18小时。
[0181]4)将吸附剂用5升去离子水洗涤并且沥干。将沥干的吸附剂转移至100ml塑料烧杯中。
[0182]3)将10ml 35%的NaOH添加至烧杯中。将含有吸附剂和NaOH的烧杯置于水浴中并且加热至63 °C。
[0183]4)将4g SDS添加至溶液中。
[0184]6)每隔30分钟，将8ml 丁磺酸内酯添加至溶液中。
[0185]5)在5小时之后，将吸附剂用5升去离子水洗涤。
[0186]通过偶联配体上特有官能团的酸碱滴定来测定配体浓度。
[0187]实施例2
[0188]本实施例描述了用于下述实施例的豌豆提取物的制备。
[0189]将干燥的黄色豌豆(目录号:3032，来自Unifood Import A/S,Denmark)研磨以产生豌豆粉。
[0190]以1+7的粉/水比使用六种提取方法:
[0191]1.在近中性pH提取
[0192]2.在pH 8.0提取
[0193]3.在pH 10.0 提取
[0194]4.在pH 8.0用0.1M NaCl提取
[0195]5.在pH 8.0.5Μ NaCl提取
[0196]6.在pH 8.0用I.0Μ NaCl提取
[0197]在近中性pH提取
[0198]将250g豌豆粉与1750ml去离子水混合。将悬浮液混合I小时，之后通过在ΙΟΟμπι尼龙滤网上筛分提取物来去除不溶性级分。所得的提取物为浑浊的乳状液体，其中PH为6.3，并且电导率为2.4mS/cm。
[0199]在PH8.0提取
[0200]将250g豌豆粉与1750ml去离子水混合。将悬浮液混合I小时，同时在混合期间，通过添加IM NaOH将pH连续调节至pH 8.0。在整个提取期间，将pH以此方式保持在pH 8.0。在提取之后，通过在ΙΟΟμπι尼龙滤网上筛分提取物来去除不溶性级分。所得的提取物为浑浊的乳状液体，其中pH为8.0，并且电导率为2.6mS/cm。
[0201]在PH 10.0 提取
[0202]将250g豌豆粉与1750ml去离子水混合。将悬浮液混合I小时，同时在混合期间，通过添加IM NaOH将pH连续调节至pH 10.0。在整个提取期间，将pH以此方式保持在pH 10.0。在提取之后，通过在ΙΟΟμπι尼龙滤网上筛分提取物来去除不溶性级分。所得的提取物为浑浊的乳状液体，其中pH为10.0并且电导率为3.9mS/cm。
[0203]在PH8.0用0.IM NaCl提取
[0204]将250g豌豆粉与1750ml 0.1M NaCl溶液混合。将悬浮液混合I小时，同时在混合期间，通过添加IM NaOH将pH连续调节至pH8.0。在整个提取期间，将pH以此方式保持在pH8.0。在提取之后，通过在ΙΟΟμπι尼龙滤网上筛分提取物来去除不溶性级分。
[0205]在pH8.0用0.51 NaCl提取
[0206]将250g豌豆粉与1750ml 0.5M NaCl溶液混合。将悬浮液混合I小时，同时在混合期间，通过添加IM NaOH将pH连续调节至pH8.0。在整个提取期间，将pH以此方式保持在pH
8.0。在提取之后，通过在ΙΟΟμπι尼龙滤网上筛分提取物来去除不溶性级分。
[0207]在ΡΗ8.0用I.0Μ NaCl提取
[0208]将250g豌豆粉与1750ml 1.0M NaCl溶液混合。将悬浮液混合I小时，同时在混合期间，通过添加IM NaOH将pH连续调节至pH8.0。在整个提取期间，将pH以此方式保持在pH
8.0。在提取之后，通过在ΙΟΟμπι尼龙滤网上筛分提取物来去除不溶性级分。
[0209 ]对于以填充床色谱进行的实验而言，将提取物在1，OOOrpm离心以去除沉淀的和不溶的材料。
[0210]实施例3
[0211]SDS PAGE和干物质分析程序。
[0212]在下述实施例中描述的各个测试吸附剂的性能根据下述一般程序通过SDS-PAGE凝胶电泳测定。
[0213]将25yL豌豆蛋白样品(在10.000RPM离心以去除不溶性物质的颗粒)与25yL tris-甘氨酸样品缓冲液(LC2676,Novex by Life Technologies，USA)混合。将所得的溶液在非还原条件下于水中煮沸5。将20yL煮沸的样品上样至预制的SDS-PAGE凝胶盒中(4-20%的tris-甘氨酸梯度凝胶(lmm) ,EC6025 ,Novex by Life Technologies ,USA)。将凝胶在200V，400mA下运行I小时。将凝胶用考马斯亮蓝染色剂(SimplyBlue? SafeStain,LC6060)染色过夜。
[0214]图1显示在pH 10.0,pH 8.0和pH 6.3时豌豆提取物的SDS-PAGE凝胶。已添加来自Invitrogen(Novex未染色蛋白标准物，LC5801)的标准分子标记以便鉴定不同的蛋白。存在箭头以指示鉴定的蛋白条带。
[0215]在下述实例中，基于显示标准标记的SDS-PAGE凝胶，与凝胶上出现的特异性蛋白条带相比，可以推断出例如豌豆凝集素、豌豆豆球蛋白或其它特异性蛋白是否结合/不结合特异性吸附剂。
[0216]图1，实施例3
[0217]泳道1=标准标记(kDa)
[0218]泳道2 =豌豆提取物，pH 6.3
[0219]图2显示在pH 10.0、pH 8.0和pH 6.3时提取的，pH逐步调节至pH 3.0的豌豆提取物的SDS-PAGE凝胶。
[0220]图2，实施例3
[0221]泳道I =豌豆提取物，pH 10.0
[0222]泳道2= pH 10.0时提取的，然后调节至pH 9的豌豆提取物，
[0223]泳道3= pH 10.0时提取的，然后调节至pH 8的豌豆提取物
[0224]泳道4= pH 10.0时提取的，然后调节至pH 7的豌豆提取物
[0225]泳道5= pH 10.0时提取的，然后调节至pH 6的豌豆提取物
[0226]泳道6= pH 10.0时提取的，然后调节至pH 5的豌豆提取物
[0227]泳道7= PH 10.0时提取的，然后调节至pH 4的豌豆提取物
[0228]泳道8 = pH 10.0时提取的，然后调节至pH 3的豌豆提取物
[0229]泳道9 = pH 8.0时提取的豌豆
[0230]泳道10 = pH 8.0时提取的，然后调节至pH 7的豌豆
[0231]泳道n =PH 8.0时提取的，然后调节至pH 6的豌豆
[0232]泳道12 = pH 8.0时提取的，然后调节至pH 5的豌豆
[0233]泳道13 = pH 8.0时提取的，然后调节至pH 4的豌豆
[0234]泳道14 = pH 8.0时提取的，然后调节至pH 3的豌豆
[0235]泳道15 = pH 6.3时提取的豌豆
[0236]泳道16 = pH 6.3时提取的，然后调节至pH 5的豌豆
[0237]泳道17 = PH 6.3时提取的，然后调节至pH 4的豌豆
[0238]泳道18 = pH 6.3时提取的，然后调节至pH 3的豌豆
[0239]图3显示在pH 8.0时用0.1、0.5和1.0M NaCl提取的豌豆提取物的SDS-PAGE凝胶。
[0240]泳道I =在pH 8.0时用0.1M NaCl提取的豌豆
[0241]泳道2 =在pH 8.0时用0.1M NaCl提取的，然后调节至pH 7的豌豆
[0242]泳道3 =在pH 8.0时用0.1M NaCl提取的，然后调节至pH 6的豌豆
[0243]泳道4 =在pH 8.0时用0.1M NaCl提取的，然后调节至pH 5的豌豆
[0244]泳道5 =在pH 8.0时用0.1M NaCl提取的，然后调节至pH 4的豌豆
[0245]泳道6 =在pH 8.0时用0.1M NaCl提取的，然后调节至pH 3的豌豆
[0246]泳道7 =在pH 8.0时用0.51 NaCl提取的豌豆
[0247]泳道8 =在pH 8.0时用0.511 NaCl提取的，然后调节至pH 7的豌豆
[0248]泳道9 =在pH 8.0时用0.511 NaCl提取的，然后调节至pH 6的豌豆
[0249]泳道10 =在pH 8.0时用0.51 NaCl提取的，然后调节至pH 5的豌豆
[0250]泳道11=在pH 8.0时用0.5M NaCl提取的，然后调节至pH 4的豌豆
[0251]泳道12 =在pH 8.0时用0.51 NaCl提取的，然后调节至pH 3的豌豆
[0252]泳道13 =在pH 8.0时用I.0Μ NaCl提取的豌豆，
[0253]泳道14 =在pH 8.0时用I.0Μ NaCl提取的，然后调节至pH 7的豌豆
[0254]泳道15 =在pH 8.0时用I.0Μ NaCl提取的，然后调节至pH 6的豌豆
[0255]泳道16 =在pH 8.0时用I.0Μ NaCl提取的，然后调节至pH 5的豌豆
[0256]泳道17 =在pH 8.0时用I.0Μ NaCl提取的，然后调节至pH 4的豌豆
[0257]泳道18 =在pH 8.0时用I.0Μ NaCl提取的，然后调节至pH 3的豌豆
[0258]干物质测定
[0259]根据下述一般程序测定选定实例的蛋白洗出液中回收的不可透析的干物质的量:
[0260]将固定量的洗出液(7.5ml)用水透析18小时以从蛋白样品中消除诸如盐和缓冲物质的小分子(透析膜:Spectra/Por mo I ecu larporous membrane tubing，截留6_8kD,Spectrum Laboratories ,USA)。在透析之后，将透析的蛋白溶液转移至箔烧杯中并在100°C干燥过夜(24小时)。将干物质(蛋白)的量计算为干燥之后烧杯的重量减去烧杯的重量。定量的氨基酸分析通常证实了大于90%的干物质确实为蛋白相关的。
[0261]实施例4:
[0262]测试了根据实施例1制备的吸附剂在pH4.5,6.3和8.0时结合豌豆蛋白的能力。测试了下述配体:
[0263]pH 4.5时的4-巯基苯甲酸、pH 6.3时的苄胺、pH 6.3时的己胺和pH 8.0时的Q-reagenso
[0264]程序
[0265]将Iml吸附剂转移并且装入小的顶部开口塑料柱(Poly-Prep ChromatographyColumn,目录号:731-1550，B1rad，USA)中以形成大约20mm床高的填充床。对于所有测试，应用通过填充床的流速为大约0.5ml/min。在装填之后，根据提取物的pH，用1ml 1mM柠檬酸钠，pH 4.5或10mM K2HPO4,pH 6.0或者10mM K2HP04，pH8.0平衡吸附剂。将豌豆提取物(根据实施例2在近中性pH制备，但比率为1+2)的pH用IM HCl调节至pH 6.0和4.5，用IMNaOH将pH调节至pH 8.0。将所有提取物在6，000RPM离心以去除沉淀的和不溶的材料。将1ml离心的提取物上样至柱。将流经(未结合的蛋白)收集成两个级分。然后，根据提取物的pH，用5ml 1mM柠檬酸钠，pH 4.5或10mM Κ2ΗΡ04ρΗ 6.0或10mM K2HPO4^pH 8.0洗涤柱。将流经(未结合的和松散结合的蛋白)收集成一个5ml级分。通过应用适合于阴离子交换剂的1ml 50mM NaOH或IM NaCl，将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将流经(洗脱的蛋白，洗出液)收集成一个1ml级分。通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图4。
[0266]结果表明测试的芳族酸配体结合与其它测试配体不同的蛋白。4-巯基苯甲酸配体(参见泳道5，代表含有结合蛋白的洗出液级分)结合大约10kDa处的脂氧合酶和大约20-25kDa处的白蛋白。豌豆球蛋白的显著条带在流经中保留(参见泳道2和3)。对于苄胺、己胺和Q-reagnes，结合模式是相似的(参见泳道10、15和20)。它们都结合显著量的伴豌豆球蛋白(70kDa)和豆球蛋白(60kDa)，但豌豆球蛋白在50和33kDa处的较大亚基在流经中保留(参见泳道7、8、11、12、16 和 17)。
[0267]图4，实施例4
[0268]泳道I =PH 4.5时的豌豆提取物
[0269]泳道2=来自负载有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0270]泳道3=来自负载有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的流经级分2(未结合的蛋白)
[0271]泳道4=来自负载有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗涤级分(未结合的蛋白)
[0272]泳道5=来自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0273]泳道6 = pH 6.3时的豌豆提取物
[0274]泳道7=来自负载有配体苄胺的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0275]泳道8=来自负载有配体苄胺的吸附剂的流经级分2(未结合的蛋白)
[0276]泳道9=来自负载有配体苄胺的吸附剂的洗涤级分(未结合的蛋白)
[0277]泳道10=来自具有配体苄胺的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0278]泳道11=来自负载有配体己胺的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0279]泳道12=来自负载有配体己胺的吸附剂的的流经级分2(未结合的蛋白)
[0280]泳道13 = pH 6.3时的豌豆提取物
[0281]泳道14=来自负载有配体己胺的吸附剂的洗涤级分(未结合的蛋白)
[0282]泳道15=来自具有配体己胺的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0283]泳道16=来自负载有配体Q-reagens的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0284]泳道17=来自负载有配体Q-reagens的吸附剂的流经级分2(未结合的蛋白)
[0285]泳道18 = pH 8.0时的豌豆提取物
[0286]泳道19=来自负载有配体Q-reagens的吸附剂的洗涤级分(未结合的蛋白)
[0287 ]泳道20 =来自具有配体Q-reagens的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0288]实施例5:
[0289]测试了根据实施例1制备的吸附剂在pH6.3时结合豌豆蛋白的能力。测试了下述配体:
[0290]4-巯基苯甲酸和苄胺.[0291 ] 程序
[0292]柱制备和流速依据实施例4。在装填之后，将吸附剂用1ml1mM梓檬酸钠，pH 6.0平衡。根据实施例4，在近中性pH时制备豌豆提取物。将提取物在18，000RPM离心以去除不溶的和沉淀的材料。将2ml离心的提取物上样至柱。将流经(未结合的蛋白)收集成两个Iml级分。将吸附剂用5ml 1mM柠檬酸钠，pH 6.0洗涤。将流经(未结合的和松散结合的蛋白)收集成一个5ml级分。通过应用1ml50mM NaOH，将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将流经(洗脱的蛋白，洗出液)收集成一个1ml级分并且通过添加IM HCl，将洗出液级分的pH立即调节至pH 7.0。
[0293]通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图5。
[0294]结果表明苄胺配体(参见泳道5，代表含有结合蛋白的洗出液级分)基本上结合应用至柱的所有蛋白，除了10kDa处的脂氧合酶和20-25kDa处的白蛋白，其在流经和洗涤级分中保留，参见泳道2、3和4。对于4-巯基苯甲酸，结合模式是相似的(参见泳道10)，但不结合大条带的豆球蛋白(60kDa)。这意味着不结合60kDa处的豆球蛋白和20-25kDa处的白蛋白。此处也不存在10kDa处的脂氧合酶。
[0295]图5，实施例5
[0296]泳道I =PH 6.3时的豌豆提取物
[0297]泳道2=来自负载有配体苄胺的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0298]泳道3=来自负载有配体苄胺的吸附剂的流经级分2(未结合的蛋白)
[0299]泳道4=具有配体苄胺的吸附剂的洗涤液(未结合的和松散结合的蛋白)
[0300]泳道5=来自具有配体苄胺的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0301]泳道6 =空白
[0302]泳道7=来自负载有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0303]泳道8=来自负载有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的流经级分2(未结合的蛋白)
[0304]泳道9=具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗涤液(未结合的和松散结合的蛋白)
[0305]泳道10=来自具有配体4-巯基苯甲酸的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0306]实施例6:
[0307]测试了根据实施例1制备的吸附剂在pH8.0时结合豌豆蛋白的能力。测试了下述配体:
[0308]DEAE 和辛胺。
[0309]程序
[0310]柱制备和流速依据实施例4。在装填之后，将吸附剂用1ml 1mM K2HPO4,pH 8.0平衡。根据实施例2，在pH 8.0时制备豌豆提取物。将提取物在6，000RPM离心以去除不溶的和沉淀的材料。将5ml离心的提取物上样至柱中。将流经(未结合的蛋白)收集成两个级分。将吸附剂用5ml去离子水洗涤。将流经(未结合的和松散结合的蛋白)收集成一个5ml级分。通过应用1ml IM NaCl(针对DEAEWPlOml 10mM磷酸，pH 2.3(针对辛胺)，将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将流经(洗脱的蛋白，洗出液)收集成一个1ml级分，并且将洗出液级分的pH立即调节至pH 7.0。
[0311]通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图6。
[0312]结果表明，虽然配体DEAE结合的比配体辛胺多，但两种配体具有相似的结合模式(参见泳道5和9，代表含有结合蛋白的洗出液级分)。它们基本上结合应用至柱的所有蛋白，但除了 10kDa处的脂氧合酶和20-25kDa处的白蛋白，其在流经和洗涤级分中保留，参见泳道2、3、4、6、7和8。
[0313]图6，实施例6
[0314]泳道I =PH 8.0时的豌豆提取物
[0315]泳道2=来自负载有配体DEAE的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0316]泳道3=来自负载有配体DEAE的吸附剂的流经级分2(未结合的蛋白)
[0317]泳道4=具有配体DEAE的吸附剂的洗涤液(未结合的和松散结合的蛋白)
[0318]泳道5=来自具有配体DEAE的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0319]泳道6=来自负载有配体辛胺的吸附剂的流经级分1(未结合的蛋白)
[0320]泳道7=来自负载有配体辛胺的吸附剂的流经级分2(未结合的蛋白)
[0321]泳道8=具有配体辛胺的吸附剂的洗涤液(未结合的和松散结合的蛋白)
[0322]泳道9=来自具有配体辛胺的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)
[0323]实施例7:
[0324]本实施例显示如何从豌豆提取物中捕获特异性豌豆蛋白，其中主要部分的豌豆蛋白已经通过pH 4.5时的沉淀和倾析去除。与配体SP偶联的吸附剂(如实施例1所述制备的)(用滴定至129mmol/L的吸附剂测定配体浓度)已在pH 4.5时被用于结合蛋白。
[0325]用膨胀床吸附(EBA)色谱进行实验。
[0326]用于实验的EBA柱:具有150cm玻璃管的直径为Icm的实验室EBA柱(目录号:7010-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0327]程序
[0328]柱装填有高度为50cm的澄清床，等同于40ml吸附剂。在负载提取物期间的流速:15cm/min= 12ml/min。在平衡、洗涤和洗脱期间的流速:15cm/min= 12ml/min。在装填之后，将吸附剂用200ml 1mM柠檬酸钠，pH 4.5平衡。用IM HCl将豌豆提取物(根据实施例2在近中性pH制备的)的pH调节至pH 4.5，搅拌I小时，并倾析上清液。将上清液直接上样至柱而无需离心。将1200ml上清液上样至柱。将流经(未结合的蛋白)收集成四个300ml级分。将吸附剂用360ml去离子水洗涤。将流经(未结合的和松散结合的蛋白)收集成一个330ml级分。通过应用275ml 30mM NaOH，将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将洗出液收集成一个195ml级分。
[0329]通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图7AP配体(参见泳道8，代表含有结合蛋白的洗出液级分)结合大约10kDa处的脂氧合酶和大约20-25kDa的白蛋白。流经级分几乎从蛋白中被耗尽(参见泳道2、3、4、5和6)。
[0330]对洗出液进行干物质测定(如实施例3中所述)。洗出液中的蛋白浓度为1.9mg/ml，每ml上样至柱的豌豆提取物(上清液)产生的蛋白产量为1.8mg。这致使每ml吸附剂的总吸附剂结合能力为54mg蛋白。
[0331]图7，实施例7
[0332]泳道I=PH 4.5时的豌豆提取物(上清液)
[0333]泳道2=来自负载有配体SP的吸附剂在pH 4.5时的流经级分I (未结合的蛋白)。
[0334]泳道3=来自负载有配体SP的吸附剂在pH 4.5时的流经级分2 (未结合的蛋白)。
[0335]泳道4=来自负载有配体SP的吸附剂在pH 4.5时的流经级分3(未结合的蛋白)。
[0336]泳道5=来自负载有配体SP的吸附剂在pH 4.5时的流经级分4(未结合的蛋白)。
[0337]泳道6=来自负载有配体SP的吸附剂在pH 4.5时的级分I至4的流经汇集物(未结合的蛋白)
[0338]泳道7=具有配体SP的吸附剂的洗涤液(未结合的和松散结合的蛋白)。
[0339]泳道8=来自具有配体SP的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)。
[0340]实施例8:
[0341]本实施例显示如何从豌豆提取物中捕获特异性豌豆蛋白。通过将12.5kg干豌豆在87.5L去离子水中混合60分钟来制备豌豆提取物。此后，将提取物静置沉积20分钟，然后将上清液倾析并被用作对柱进行上样。使用PH 6.3时的苄胺吸附剂结合豌豆蛋白。
[0342]用膨胀床吸附(EBA)色谱进行实验。
[0343]用于实验的EBA柱:具有150cm玻璃管的直径为30cm的EBA柱(目录号:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0344]程序
[0345]柱装填有高度为50cm的澄清床，等同于35.3L吸附剂。在负载提取物期间的流速:20cm/min = 14.lL/min。在平衡、洗涤和洗脱期间的流速:20cm/min= 14.lL/min。在装填之后，将吸附剂用150L 1mM磷酸钾，pH 6.3平衡。将豌豆提取物(在近中性pH时制备的)搅拌I小时，并将上清液倾析。将上清液直接上样至柱而无需离心。将70.6L提取液上样至柱。将流经(未结合的蛋白)收集成一个级分，但每17.5L取样样品。将吸附剂用250L去离子水洗涤。通过应用70L30mM NaOH，将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将洗出液收集成一个70L级分，在收集期间，将所述级分的PH连续调节至pH7-9。在收集之后，总洗出液的pH为7.5，并且电导率为1975yS/cm。
[0346]通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图8。苄胺配体(参见泳道6，代表含有结合蛋白的洗出液级分)结合大约I OOkDa处的脂氧合酶，70kDa处的伴豌豆球蛋白和大约45kDA处的豌豆球蛋白以及20-25kDa处的白蛋白。流经级分含有60kDa处的豆球蛋白和婉?球蛋白(参见泳道2、3、4和5)。
[0347]对洗出液进行干物质测定(如实施例3中所述)。洗出液中的蛋白浓度为13.5mg/ml，每ml上样至柱的豌豆提取物(上清液)产生的蛋白产量为13.5mg。这致使每ml吸附剂的总吸附剂结合能力为26.8mg蛋白。
[0348]图8，实施例8
[0349]泳道I=近中性pH时的豌豆提取物(上清液)
[0350]泳道2=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 6.3时的流经样品1(未结合的蛋白)。
[0351]泳道3=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 6.3时的流经样品2(未结合的蛋白)。
[0352]泳道4=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 6.3时的流经样品3 (未结合的蛋白)。
[0353]泳道5=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 6.3时的流经样品4(未结合的蛋白)。
[0354]泳道6=来自具有配体苄胺的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)。
[0355]实施例9:
[0356]本实施例显示如何从豌豆提取物中捕获特异性豌豆蛋白。通过将12.5kg干豌豆在87.5L去离子水中混合60分钟来制备豌豆提取物。此后，将提取物调节至pH 8.0并静置沉积20分钟。然后将上清液倾析并被用作对柱进行上样。使用pH 8.0的苄胺吸附剂结合豌豆蛋白。
[0357]用膨胀床吸附(EBA)色谱进行实验。
[0358]用于实验的EBA柱:具有150cm玻璃管的直径为30cm的EBA柱(目录号:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0359]程序
[0360]柱装填有高度为50cm的澄清床，等同于35.3L吸附剂。在负载提取物期间的流速:20cm/min = 14.lL/min。在平衡、洗涤和洗脱期间的流速:20cm/min= 14.lL/min。在装填之后，将吸附剂用300L 1mM磷酸钾，pH 8.0平衡。将来自豌豆提取物的上清液直接上样至柱而无需离心。将60L上清液上样至柱。将流经(未结合的蛋白)收集成一个级分，但每20L取样样品。将吸附剂用250L去离子水洗涤。通过应用80L 30mM NaOH将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将洗出液收集成一个70L级分，在收集期间，将所述级分的pH连续调节至pH 7-
9。在收集之后，总洗出液的pH为7.3，并且电导率为2.38mS/cm。
[0361 ] 通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图9。苄胺配体(参见泳道5，代表含有结合蛋白的洗出液级分)结合大约I OOkDa处的脂氧合酶，70kDa处的伴豌豆球蛋白和大约45kDA的豌豆球蛋白以及20kDa处的一些白蛋白。流经级分含有60kDa处的豆球蛋白和豌豆球蛋白(参见泳道2、3和4)。
[0362]对洗出液进行干物质测定(如实施例3中所述)。洗出液中的蛋白浓度为4.8mg/ml，每ml上样至柱的豌豆提取物(上清液)产生的蛋白产量为5.6mg。这致使每ml吸附剂的总吸附剂结合能力为9.6mg蛋白。
[0363]图9，实施例9
[0364]泳道I=PH 8.0时的豌豆提取物(上清液)
[0365]泳道2=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 8.0时的流经样品1(未结合的蛋白)。
[0366]泳道3=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 8.0时的流经样品2(未结合的蛋白)。
[0367]泳道4=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 8.0时的流经样品3(未结合的蛋白)。
[0368]泳道5=来自具有配体苄胺的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)。
[0369]实施例10:
[0370]本实施例显示如何从豌豆提取物中捕获特异性豌豆蛋白。如实施例9所述制备豌豆提取物，除了在提取期间，将0.5mg/ml亚硫酸钠添加至混合物中。因此，将12.5kg干豌豆和50g亚硫酸钠在87.5L去离子水中混合60分钟。此后，将提取物调节至pH 8.0并静置沉积20分钟。然后将上清液倾析并被用作对柱进行上样。使用pH 8.0的苄胺吸附剂结合豌豆蛋白。
[0371]用膨胀床吸附(EBA)色谱进行实验。
[0372]用于实验的EBA柱:具有150cm玻璃管的直径为30cm的EBA柱(目录号:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0373]程序
[0374]柱装填有高度为50cm的澄清床，等同于35.3L吸附剂。在负载提取物期间的流速:20cm/min = 14.lL/min。在平衡、洗涤和洗脱期间的流速:20cm/min= 14.lL/min。在装填之后，将吸附剂用300L 1mM磷酸钾，pH 8.0平衡。将来自豌豆提取物的上清液直接上样至柱而无需离心。将60L上清液上样至柱。将流经(未结合的蛋白)收集成一个级分，但每20L取样样品。将吸附剂用300L去离子水洗涤。通过应用80L 30mM NaOH，将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将洗出液收集成一个60L级分，在收集期间，将所述级分的pH连续调节至pH
7-9。在收集之后，总洗出液的pH为7.0，并且电导率为1.96mS/cm。
[0375]通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图10。苄胺配体(参见泳道7，代表含有结合蛋白的洗出液级分)结合大约10kDa处的脂氧合酶，7OkDa处的伴豌豆球蛋白和大约45kDA的豌豆球蛋白以及20kDa处的白蛋白。流经级分含有60kDa处的豆球蛋白和豌豆球蛋白(参见泳道2、3和4)。
[0376]对洗出液进行干物质测定(如实施例3中所述)。洗出液中的蛋白浓度为5.5mg/ml，每ml上样至柱的豌豆提取物(上清液)产生的蛋白产量为5.5mg。这致使每ml吸附剂的总吸附剂结合能力为9.3mg蛋白。
[0377]图10，实施例10
[0378]泳道I =如实施例3中所述的标准标记。
[0379]泳道2 = pH 8.0时，含有亚硫酸盐的豌豆提取物(上清液)
[0380]泳道3=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 8.0时的流经样品1(未结合的蛋白)。[0381 ]泳道4 =来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 8.0时的流经样品2(未结合的蛋白)。
[0382]泳道5=来自负载有配体苄胺的吸附剂在pH 8.0时的流经样品3 (未结合的蛋白)。
[0383]泳道6 =空白
[0384]泳道7=来自具有配体苄胺的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)。
[0385]实施例11:
[0386]本实施例显示如何从豌豆提取物中捕获特异性豌豆蛋白，其中使用与配体SP偶联的吸附剂(如实施例1所述制备的)，主要部分的豌豆蛋白已经在PH 4.5沉淀并且倾析(用滴定至129mmol/L的吸附剂测定配体浓度)，其中，pH 4.5时，蛋白已结合。
[0387]用膨胀床吸附(EBA)色谱进行实验。
[0388]用于实验的EBA柱:具有150cm玻璃管的直径为30cm的实验室EBA柱(目录号:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0389]程序
[0390]柱装填有高度为44cm的澄清床，等同于31.1L吸附剂。在负载提取物期间的流速:15cm/min = 10.6L/min。在平衡、洗涤和洗脱期间的流速:15cm/min= 10.6L/min。在装填之后，将吸附剂用200L 1mM柠檬酸钠，pH 4.5平衡。将豌豆提取物(根据实施例2在近中性pH时产生的)的PH用IM HCl调节至pH 4.5，搅拌I小时，并将上清液倾析。将上清液直接上样至柱而无需离心。将62L提取物上样至柱。将流经(未结合的蛋白)收集成一个级分，但每301^取样样品。将吸附剂用300L去离子水洗涤。通过应用70L 30mM NaOH，将结合的蛋白随后从柱中释放(洗脱的)。将洗出液收集成一个52.3L级分，在收集期间，将所述级分的pH连续调节至pH 7-9。在收集之后，总洗出液的pH为7.2，并且电导率为1.54mS/cm。
[0391]通过SDS-PAGE测定吸附剂的性能(如实施例3中所述)。参见图11。SP配体(参见泳道5，代表含有结合蛋白的洗出液级分)结合上清液中可得的所有蛋白。流经级分几乎从蛋白中被耗尽(参见泳道3和4)。
[0392]对洗出液进行干物质测定(如实施例3中所述)。洗出液中的蛋白浓度为12.8mg/ml，每ml上样至柱的豌豆提取物(上清液)产生的蛋白产量为10.8mg。这致使每ml吸附剂的总吸附剂结合能力为21.5mg蛋白。
[0393]图11，实施例11
[0394]泳道I=在pH调节之前的豌豆提取物(上清液)
[0395]泳道2= pH 4.5时的豌豆提取物(上清液)
[0396]泳道3=来自负载有配体SP的吸附剂在pH 4.5时的流经级分I (未结合的蛋白)。
[0397]泳道4=来自负载有配体SP的吸附剂在pH 4.5时的流经级分2(未结合的蛋白)。
[0398]泳道5=来自具有配体SP的吸附剂的洗出液(结合并随后释放的蛋白)。
[0399]实施例12
[0400]本实施例示出如实施例8、9、1和11所述制备的不同的豌豆蛋白级分的选择的功能性质。
[0401]对于选择的功能性质，测试了四种豌豆蛋白级分和商用豌豆蛋白:
[0402]豌豆蛋白级分
[0403]I.商用豌豆蛋白:豌豆蛋白MEGA(目录号:480，来自Natur Drogeriet A/S ,Denmark)
[0404]2.豌豆蛋白级分1，？??1(实施例8中所述)
[0405]3.豌豆蛋白级分2，PPF2(实施例9中所述)
[0406]4.豌豆蛋白级分3，PPF3(实施例10中所述)
[0407]5.豌豆蛋白级分4，PPF4(实施例11中所述)
[(MO8]测试的选择的功能性质
[0409]1.颜色(使用CIE实验室颜色测量)
[0410]2.豌豆蛋白级分的pH
[0411]3.发泡能力和稳定性
[0412]4.胶凝强度和温度
[0413]5.乳化能力和稳定性
[0414]颜色
[0415]使用CIE实验室颜色测量方法测量了豌豆蛋白级分的颜色。图12显示来自针对各个豌豆蛋白级分测量的结果。所有测试的豌豆蛋白为白色至浅黄色，然而，与商用豌豆蛋白(MEGA)相比，豌豆蛋白级分I至4的黄色较浅，这通过图12中较低的b*值观察到。
[0416]豌豆蛋白级分的pH
[0417]图13显示豌豆蛋白级分的3%溶液的测量的pH值。所有测试的豌豆蛋白的起始pH为中性pH。与商用豌豆蛋白MEGA相比，豌豆蛋白级分2具有略高的pH值。
[0418]发泡能力和稳定性
[0419]豌豆蛋白级分(PPF1-PPF4和MEGA)的发泡能力和稳定性通过以下测量:将3 %的豌豆蛋白溶解在去离子水中，将pH调节至7.0，并使用Ul tra Turrex，将豌豆蛋白溶液在20.0OOrpm混合5min。将发泡能力测量为体积增加的百分比，将发泡稳定性测量为泡沫降至自身发泡能力的50%的时间。图14a-14f显示出测量的值。从图14b、14c和14d中，可以观察至IJ，随着时间的推移，豌豆蛋白级分1(ρΗ 4时)、级分2和级分3具有的发泡能力等于或高于商用豌豆蛋白(图14a)。在图14f中，豌豆蛋白级分2在pH 4和尤其是pH 7时显示出很好的泡沫稳定性。
[0420]图14a-e:实施例12，发泡能力(Y-轴:体积增加％，X_轴:时间(分钟)
[0421 ]图14f:实施例12，发泡稳定性(Y-轴:体积增加% )
[0422]胶凝强度和温度
[0423]豌豆蛋白级分的胶凝强度已通过将12.5%的豌豆蛋白溶解于去离子水中进行测量。将豌豆蛋白溶液以2 °C/分钟从25 0C加热至90 °C，同时使用来自Anton Paar的rheometerphysica MCR301测量凝胶的弹性和粘度。此后，将凝胶在流变仪中冷却至25°C并在IHz测量胶凝强度。图15a显示测量的胶凝强度，图15b显示胶凝强度相对于40°C至95°C的温度的测量值。图15a表明所有豌豆蛋白级分的胶凝强度等于或高于商用豌豆蛋白，MEGA。在图15b中，可以观察到尤其是PH7时的豌豆蛋白级分I和4在高温下具有优异的胶凝强度。
[0424]图15b，实施例12(Y-轴:胶凝强度(G ’)(Pa)，X-轴:温度(°C))
[0425]乳化能力和稳定性
[0426]豌豆蛋白级分的乳化能力和稳定性已通过将1%的豌豆蛋白溶解于去离子水中测量。然后，将豌豆蛋白溶液与菜籽油以1:1的比率混合。然后，使用U11 r a T h u r r a X以
20.0OOrpm搅拌混合物直至观察到乳状液。此后，将乳状液(全部样品)在1500xg离心5分钟。然后，将乳化能力计算为乳状液体积/样品的总体积的百分比。计算的值显示在图16a中。
[0427]然后，乳化稳定性通过加热样品(乳化)至80°C保持30分钟并在室温冷却静置15分钟来获得。此后，将样品在1500xg离心5分钟。然后，将乳化稳定性计算为乳状液体积/样品总体积的百分比。计算的值显示在图16b中。
[0428]图16a和16b显示与商用豌豆蛋白，MEGA相比，测试的豌豆蛋白级分I至4全部具有相等或较高的乳化能力和稳定性。
【主权项】
1.分离豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤: 1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少两种类型的豌豆蛋白； i 1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通过至少一种膨胀床吸附过程，其中所述膨胀床吸附过程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触以提供未结合的蛋白级分和结合的蛋白级分，所述吸附树脂选择性地吸附至少第一类型的豌豆蛋白，所述吸附树脂包含: 至少一种配体(LI)，所述至少一种配体(LI)包含芳族或杂芳族环系和一种或多种酸性基团，或者 至少一种配体(L2)，所述至少一种配体(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自以下的一个或多个基团取代的胺: a.芳基、苄基或杂芳基； b.具有4-16个碳原子的烷基，所述烷基可以为直链、支链或环状的； 或者它们的组合； ii1.通过洗脱所述未结合的蛋白级分或所述结合的蛋白级分从所述吸附树脂中分离所述第一类型的豌豆蛋白；以及 iv.从所述吸附树脂中分离第二类型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白组合物，所述第二豌豆蛋白组合物在所述第一类型的豌豆蛋白中被消耗。2.如权利要求1所述的方法，其还包括变性所述第二豌豆蛋白组合物以提供变性的第二豌豆蛋白组合物的步骤。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述配体(LI)包含芳族环系，优选苯基或萘基。4.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中配体(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自以下的一个或多个基团取代的胺:具有4-16个碳原子的烷基，所述烷基可以为直链、支链或环状的；诸如例如丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或十氢萘基。5.如权利要求6所述的方法，其中所述配体(L2)选自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烧、1,3-二氨基丙烧、1,6-二氨基己烧、1,6-二氨基己烧、1,8-氨基辛烧、1,9-二氨基壬烧、1, 12-氨基十二烧、2-氨基节胺、2-氨基苯并咪卩坐、2-氨基咪唑、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶或苄胺。6.第二豌豆蛋白组合物，其在所述第一类型的豌豆蛋白中被消耗，通过权利要求1和3-5中任一项所述的方法获得。7.变性的第二豌豆蛋白组合物，其通过权利要求2所述的方法获得。
【文档编号】A23J1/14GK105939618SQ201580006290
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年1月29日
【发明人】阿兰·奥托·利默, 玛丽·本迪克斯·汉森, 马丁·庞陶普丹
【申请人】预层析股份有限公司