专利名称：：一种融合蛋白的组成及其分离方法
技术领域：
：本发明涉及一种融合蛋白的组成及其分离方法。
背景技术：
：使用融合蛋白的表达系统生产重组蛋白是一种广为接受的4支术。在该系统中，融合伴侣有助于所需蛋白的表达和纯化。融合伴侣常用于提供一个可以帮助融合蛋白进行后续纯化的"标签"。然而，为了使所需蛋白恢复其自然形态或药学上可接受的形态，该融合伴侣必须在融合蛋白分离后立即去除。去除融合伴侣最广为使用的方法是使用特异性裂解酶，如凝血酶，Xa因子或肠激酶(Wassenberg等，Prate/"5"c,'<5:1718(1997);Schlumpberger等，尸rafe/"9:440(2000);Zaitseva等，5:1100(1996))。它包括在所需蛋白和融合伴侣之间插入一段能被裂解酶特异性裂解的特定氨基酸序列。所需的蛋白可通过采用裂解酶(如凝血酶)裂解融合蛋白进行恢复。凝血酶是一种可以断裂使用丝氨酸的多肽键的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。许多研究者研究了凝血酶的特异性。已知的凝血酶裂解位点如下(Chang，￡wkJ.所0c/2e附.151:211(1985);GSTgenefusionsystemhandbook,AmershamBiosciences,EditionAA,p.88-89)。l)P4-P3-Pro-Arg/Lys丄Pl，-P2，，其中P3和P4是疏水氨基酸，Pl，和P2，是非酸性氨基酸。Arg/LysiPl，键被断裂。范例:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(SEQIDNOS:1-3)2)P2-Arg/Lys丄Pl',其中P2或Pl，是Gly。Arg/Lys丄Pl，4建一皮断裂。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>最常用的凝血酶裂解序列是由牛因子XIII(Takagi等,伤oc/7em,Wo;13:750(1974))的序歹'H〉'亍生的Leu-Val-Pro-Arg-Gly(SEQIDNO:4)或者Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)。断裂发生在精氨酸残基处，从而使目标蛋白在氨基酸末端以Gly或Gly-Ser扩展。凝血酶裂解序列还被用于一些商用表达质粒，包括pGEX系列(AmershamBiosciences)禾口pET系歹寸(Novagen)。最近，Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)序列一皮进一步i^饰，在凝血酶裂解位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)前面或后面紧接插入了包含序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQIDNO:5)的富含4青氨酸的4妄头(Guan等，5/oc/2ew.192:262(1991》Hakesetal，v4船/.202:293(1992》。虽然凝血酶对已知接头序列区域的裂解具有相当的特异性，但这并非绝对。尽管凝血酶是一种相当特异性的酶，但它可以使用一系列不同的氨基酸序列作为裂解位点。如果目标蛋白包含多个凝血酶裂解位点，则在这些位点均能发生裂解，从而得到内部裂解的蛋白产品，而非所需的全长蛋白。例如，当一个包含内部凝血酶裂解序列的盐生盐杆菌(Halobacteriumhalobium)Lll蛋白4乍为一个GST融合蛋白表达，且该融合蛋白在GST标签和Lll之间具有Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)凝血酶裂解位点时，以凝血酶进行处理将导致目标蛋白Lll内部的裂解，而非在Lll和GST标签之间的裂解(Porseetal，J.7kfo/.S,》/,276:391(1998))。酉良酒酵母的Cdcl4p蛋白同才羊具有一个内部凝血酶裂解序列。当Cdcl4p蛋白作为含有Ser-GIy-Gly-Gly-Gly-Gly-Leu-Val画Pro-Arg隱Gly-Ser(SEQIDNO:6)凝血酶断裂位点的GST融合蛋白进行表达时，融合蛋白同时在Cdcl4p内部位点和,疑血酶裂解4妻头处断裂(Tayloretal,J.Biol.Chem.272:24054(1997))。本发明提供了一种比已知序列更具特异性的可用凝血酶裂解的新型4妻头序列。
发明内容本发明提供了一种包含新型凝血酶裂解位点的肽接头，该接头可用于包含目标蛋白的融合蛋白的重组生产以及,人融合蛋白中分离目标蛋白。在一个实施例中，该itU妾头包含以下序列X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中XI是两个或两个以上4皮此相同或不同的氨基酸残基；X2是疏水氨基酸；X3是精氨酸或赖氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一种非酸性氨基酸。本发明提供了一种融合蛋白，其包括目标蛋白、融合伴侣以及插在两者之间的本发明所述的肽接头。本发明还提供一种从融合蛋白分离目标蛋白的方法，包括使融合蛋白与足够量的凝血酶接触从而引起肽"t妻头的裂解。当裂解反应发生后，由融合蛋白产生得到目标蛋白。目标蛋白可采用本领域中公知的简单技术进行恢复。本发明可用于纯化在宿主细胞中以重组DNA^支术表达的原核或真核蛋白。这些重组蛋白产品包括通过蛋白工程技术或合成蛋白生产的细胞因子，趋化因子，激素，受体，酶，贮藏蛋白，血液蛋白，突变体蛋白。此外，本发明还涉及编码肽接头的多聚核苷酸，编码融合蛋白的多聚核苷酸，包含相同多聚核苷酸的载体，以及包含该载体的宿主细胞。本发明进一步提供了一种编码融合蛋白的多聚核苷酸的制备方法，一种融合蛋白的生产方法以及一种目标蛋白的生产方法。本发明还提供了包含本发明的多聚核苷酸和载体的试剂图1是编码包含本发明肽4妾头的融合蛋白的pGEX4T-hILll(A)的图示(SEQIDNO:8)。图2A显示GST-IL11(A)的凝血酶裂解。图2B显示GST-IL11(A)的凝血酶裂解。图3显示IL-11(A)的MALDI-TOF分析。图4是编码包含本发明肽接头(SEQIDNO:8)的融合蛋白的pGEX-胸腺肽(34的图示。图5是GST-胸腺肽(34的凝血酶裂解。图6显示了胸腺肽(34的MALDI-TOF分析。图7是编码包含本发明肽接头(SEQIDNO:8)的融合蛋白的pGEX-IL6的图示。图8显示GST-IL6的凝血酶裂解。图9是编码包含本发明肽接头(SEQIDNO:8)的融合蛋白的pGEX-PAR4的图示。图IO是编码包含本发明肽接头(SEQIDNO:7)的融合蛋白的pGEX-IL11(LV-)的图示。图11显示GST-ILll(LV-)的凝血酶裂解。图12是编码包含本发明肽接头(SEQIDNO:7)的融合蛋白的pMAL-c2-IL11的图示。图13显示MBP-ILll的凝血酶裂解。图14是编码包含本发明肽接头(SEQIDNO:7)的融合蛋白的pET19b-IL11的图示。图15显示His-IL11的凝血酶裂解。发明详述本发明提供了一种包含可被凝血酶及其类似物裂解的凝血酶裂解位点的肽4妻头。在一个实施例中，该肽接头包含以下序列XI-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中XI是两个或两个以上彼此相同或不同的氨基酸残基；X2是疏水氨基酸；X3是精氨酸或赖氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一种非酸性氨基酸。在一个实施例中，XI是4个或4个以上^^此相同或不同的氨基酸残基。在另一实施例中，XI为不超过IO个氨基酸残基，例如不超过8个氨基酸残基，例如不超过6个氨基酸残基。例如，在不同的实施例中XI可以是2-6，2-8，2-10,4-6，4-8,或4-10个氨基酸残基。当采用凝血酶处理肽接头时，X3和X4之间的4定发生断裂。对于裂解位点，当XI是两个氨基酸残基时XI占据位点5和6(P5-P6),或当XI是4个氨基酸残基时XI占才居位点5到9(P5-P8)。X2,Ser,Pro,X3,X4和X5分别占据位点4，3,2，1，l，和2，，和T(P4,P3,P2，Pl，Pl，，P2，)。在一个实施例中，XI包含Pro和Arg。在一个实施例中，X3可以是Arg或Lys。当Arg或Lys在羧基前时;疑血酶断裂多肽4建。在另一实施例中，X4可以是Ala或Gly。Ala和Gly的性质非常相似，都是小分子非极性氨基酸。在一个实施例中，X2可以是选自由Gly,Ala，Pro，Val,Leu,lie,Met,Phe,Tyr禾口Trp所组成的群的疏水氨基酸。在一个特殊的实施例中，X2为Gly。在一个更进一步的实施例中，X5可以是选自由Ser，Ala,Asn，Val，Leu,lie,Lys，Phe,Tyr和Trp所组成的群的非酸性氨基酸。在一个特殊的实施例中，X5是Ser。在一个实施例中，Xl可以是2个或更多的任何氨基酸。在另一个实施例中，Xl可以是4个或更多的任何氨基酸。XI的确切氨基酸序列对凝血酶裂解没有明显的影响。在一个实施例中，肽4妻头包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)。在一个更进一步的实施例中，月太才妾头包含序歹'JLeu-Val-Pro隱Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)。当一个包含该裂解位点的融合蛋白以凝血酶处理时，裂解位点中的Arg丄Ala《建断裂。在一个实施例中，肽4妄头包含一个与Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)不同的序列。在另一个实施例中，肽4妻头包含一个与Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)不同的序列。肽4妾头序歹'JPro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)和Leu國Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)不同于以往已知的凝血酶裂解位点，因为P3氨基酸Ser为非疏7jC性。根据以往的研究，最佳凝血酶裂解位点在P3位点含有疏水氨基酸(Chang,五MK乂S/0c/2em.151:211(1985》。已知P3位点的非疏水性氨基酸会延长凝血酶裂解的时间。Raftery等人报导了在鼠MPR14蛋白中发现的氨基酸序列Asn-Asn-Pro-Arg-Gly-His(SEQIDNO:9)可作为;疑血酶的底物，^f旦它是一种比Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)差的底物(Raftery等，户/15:228(1999))。对;疑血酶的天然底物纤维蛋白原，Gly^立于纤维蛋白月太A(Gly-Gly-Val-Arg丄Gly-Pro)(SEQIDNO:10)的P3位点，而Ser位于纤维蛋白肽B(Phe-Ser-Ala-Arg丄Gly-His)(SEQIDNO:ll)的P3位点。纤维蛋白肽A可以比纤维蛋白肽B更迅速地一皮;疑血酶裂解(Binnie等，57:3186(1993))。本发明提供了一种融合蛋白，其包含目标蛋白，融合伴倡以及插在两者之间的本发明的肽4妾头。此处所用的术语"融合蛋白"和"嵌合蛋白"可进行互换，指包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间带有凝血酶裂解位点的接头肽的多肽和蛋白质。在一个实施例中，目标蛋白连接至肽接头的N末端，融合伴侣连接至肽接头的C末端。在另一实施例中，目标蛋白连接至肽接头的C末端，融合伴侣连接至肽接头的N末端。在一个更进一步的实施例中，融合蛋白可能包含分别用肽4妻头分隔的超过一个的目标蛋白和/或超过一个的融合伴侣。在这些实施例中，多个目标蛋白可以相同或不同，多个融合伴侣可以相同或不同，且多个月太4妻头可以相同或不同。此处所用的术语"目标蛋白"，"所需多肽"，"所需蛋白"或"粑蛋白，，可进行互换，并指任4可其产物有用的蛋白或肽。在一个实施例中，蛋白或肽具有生物活性。目标蛋白的例子包括但不仅限于白介素(IL)-ll,胸腺肽P4，胸腺肽ocl,IL-2,IL-3,IL-4,IL隱5，IL-6,IL-7，IL-8,IL-IO，IL-13，IL-15,IL誦18,蛋白酶;敫活受体l(PARl),PAR3,PAR4,RANTES，基质细胞衍生因子-loc,单核细胞趋化蛋白，干细胞因子，FLT-3L,甲状旁腺激素，血小板生成素，表皮细胞生长因子，石成性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，血小^^反源生长因子，转化生长因子(TGF)-Pl,肿瘤坏死因子(TNF)-a,干护G素(IFN)-a，IFN-P，IFN-y,肝细月包生长因子，血管内皮生长因子以及免疫球蛋白重链。在一个实施例中，目标蛋白选自由人IL11,胸^J太P4，IL-6和PAR4所组成的群。在另一实施例中，目才示蛋白为人ILll。此处所用的术语"融合伴侣"指任何期望包含在融合蛋白中的蛋白或肽。在一个实施例中，融合伴侣为融合蛋白赋予了改善的特性，如更易纯化，更具稳定性，可溶性等等。在一个实施例中，融合伴侣为一种亲和肽。亲和肽的例子包括但不仅限于谷胱甘肽s转移酶(GST),麦芽糖结合蛋白(MBP),六聚组氨酸，T7多肽，泛素，Flag多月太，c-myc多肽，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，BTag，半乳糖结合域，纤维素结合域(CBD),石克氧还蛋白，葡萄球菌蛋白A,链球菌蛋白G,钙调蛋白，P-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，S-多肽，链霉亲和素，His-标签和Strep-标签。此处所用的术语"肽接头"指包含可被凝血酶识别和裂解的凝血酶裂解位点的特定氨基酸序列。此处所用的术语"凝血酶，，指任何形式的可裂解本发明月太才妄头的;疑血酶。；疑血酶可包"fe天然;疑血酶，重纟且;疑血酶，；疑血酶片段以及凝血酶类似物，只要蛋白中保留了一定水平的裂解活性。在一个实施例中，凝血酶可以是人凝血酶或牛;疑血酶，包括天然凝血酶，重组凝血酶，或是由人或牛序列中衍生得到的凝血酶片段和类似物。本发明提供了一种从包括所述目标蛋白，融合伴侣和插在两者中间的肽接头的融合蛋白中分离目标蛋白的方法，所述方法包括将融合蛋白与足够量的凝血酶接触从而引起多肽接头的裂解。在一个实施例中，融合蛋白由肽冲妄头的X3和X4中间断裂。本方法可进一步包括将目标蛋白从融合蛋白的其他部分中分离，如通过亲和纯化或尺寸分离。在一个实施例中，凝血酶为人凝血酶，融合蛋白与约0.1USP单位至约l.OUSP单位的凝血酶4妻触，如约0.2单位至约0.7单位的;疑血酶，如约0.2单位至约0.5单位的凝血酶，如约0.2单位至约0.3单^立的凌是血酶。在另一实施例中，；疑血酶为人;疑血酶，融合蛋白与凝血酶接触时间为约5分钟至约1.5小时，如约8分钟至约1.2小时，如约10分钟至约1.0小时。在一个更进一步的实施例中，凝血酶为人凝血酶，并且融合蛋白与约0.25单位的凝血酶接触约30》^中。在一个实施例中，，疑血酶为牛凑是血酶，融合蛋白与约O.l单位至约1.0单位的凝血酶，如约0.2单位至约0.7单位的凝血酶4妻触。在另一实施例中，凝血酶为牛凝血酶，融合蛋白与凝血酶4妻触时间为约5分钟至约1.5小时，如约8分钟至约1.2小时，如约10分钟至约1.0小时。在一个更进一步的实施例中，凝血酶为牛凝血酶，且融合蛋白与约0.5单位的凝血酶4妻触约1.0小时。本发明4是供了一种编码本发明中的肽接头的多聚核苷酸。该多聚核苷酸可通过化学合成或克隆进行制备。本发明才是供了一种编码本发明中的融合蛋白的多聚核苷酸。按照本方明，一个编码目标蛋白的多聚核苷酸序列被分离，合成或以其他方式获得并,皮连4妻至一个编码肽4妻头的多聚核苷酸序列上。该种包含了连接至编码肽接头的多聚核苷酸序列的所需蛋白的基因的杂交多聚核苷酸:帔称作嵌合多聚核苷酸。在一个实施例中，嵌合多聚核普酸使用整合了编码肽接头的多聚核芬酸序列的5j物通过聚合酶链式反应等方法进行扩增制备，因此扩增产品中编码肽序列的多聚核普酸可操作地连接至编码目标蛋白的多聚核苷酸。在其他的实施例中，多聚核苷酸通过一种连4妻酶连4妻在一起。嵌合多聚核芬酸随后一皮可才喿作地与编码融合伴4吕的多聚核香酸连4妾乂人而得到编码融合蛋白的多聚核苷酸。在其他实施例中，编码融合伴侣的多聚核苷酸被可操作地连接至编码肽接头的多聚核苷酸以获得嵌合多聚核苷酸，该嵌合多聚核苷酸随后一皮连4妾至编码目标蛋白的多聚核苷酸从而得到编码融合蛋白的多聚核苷酸。此处所用的术语"可操作地连接"指两个编码蛋白或肽的多聚核普酸以一定的方式进4亍连4妾，通过该方式可获得^争越两个多聚核苦酸的连续开放阅读框架。从调节元件来il,术语"可操作地连4妻，，指一个调节元件以一定方式连接至一个编码蛋白或肽的多聚核苦酸，通过该方式连4^后的调节元件可以对多聚核苷酸的转录和/或翻"^产生影响。本发明才是供了一种包含编码肽4姿头的多聚核苷酸的载体(如质粒，病毒，或是噬菌体载体)。在一个实施例中，该载体是表达载体。该载体优选可在宿主细胞中自主复制以及优选带有耐药基因(如氨千西林或四环素)或营养缺陷型补充基因等可选4奪标志。在一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连接至(如在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码融合伴倡的多聚核香酸。在另一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连接至(如在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码目标蛋白的多聚核苦酸。在另一实施例中，该载体包含编码融合蛋白的多聚核普酸，该融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的肽接头。在一个实施例中，该含有编码肽接头的多聚核苷酸的载体在编码肽接头的多聚核香酸的上游和/或下游进一步包含一个或多个如限制性内切酶识别位点等的克隆位点，以帮助编码目标蛋白或融合伴侣的多聚核香酸被克隆到载体中并与肽4妻头同框。该载体提供了必要的调节序列(如转录和翻译元件)以控制融合蛋白在合适的宿主细胞中的表达。该调节序列可包括一个或多个启动子区，增强子区，转录终止位点，核糖体结合位点，起始密码子，剪切信号，内含子，多聚腺苷酸化信号，Shine/Dalgamo翻i奪序列以及Kozak—致序列。调节序列的选4奪依据生产融合蛋白的宿主细胞而定。合适的细菌启动子包招「但不^又限于噬菌体人pL或pR，T6，T7，T7/lacO，lac,recA,gal,trp,ara,hut以及trp-lac。合适的真核启动子包括但不仅限于PRBI，GAPDH，金属硫蛋白，胸苷激酶，病毒LTR，巨细胞病毒，SV40,或是组织特异性或肿瘤特异性的启动子如曱胎蛋白，淀粉酶，组织蛋白酶E，Ml毒蕈石咸受体或Y-谷氨酰转移酶。从宿主细胞分泌到培养基或宿主细胞周质的融合蛋白也可能带有信号序列。信号序列可能为融合伴侣或其他序列。编码4言号序列的多聚核苷S臾可以一皮可才喿作i也连冲妄至编石马融合蛋白的多聚核苷酸的5，末端。此外，可以在信号序列和融合蛋白剩余部分之间插入额外的肽接头，从而使信号序列可以通过凝血酶裂解从融合蛋白去除。合适的信号序列已在本领域公知且包括如来自E.coli的MBP,GST,TRX,DsbA,和LamB以及来自酵母的cx-因子。合适表达载体的额外例子可在美国专利US5,814,503中找到,此处引入作为参考。本发明提供了一种制备编码融合蛋白的多聚核苷酸的方法，包括在载体的克隆位点插入编码目标蛋白的多聚核芬酸，从而4吏该多聚核苷酸在编码肽4妻头的多聚核苷酸的上游或下游并与其同框。在一个更进一步的实施例中，编码目标蛋白的多聚核普酸萍皮插入载体的克隆位点，所述载体包含可操作地连4妄至编码融合伴侣的多聚核苷酸的编码肽接头的多聚核苷酸，,人而使该编码目标蛋白的多聚核苦酸在编码肽接头的多聚核苦酸的上游或下游并与其同框。本发明提供了一种包含本发明载体的宿主细胞。该宿主细月包可以是适合融合蛋白表达的任何细胞，包括原核(如纟田菌)和真核(如真菌，酵母，动物，昆虫，一直物)细力包。合适的原核宿主细胞包括^f旦不4又限于(如DH5,HBIOI,JM109或W3110菌才朱)，芽月包才干菌(S"c/〃ws入嗜连霉菌(5^e/om_yc"入沙门氏菌(Sa/附o"e〃aA沙雷氏菌(J牙口々i单月包菌(尸sez^omo""sJ种属。合适的真核宿主细胞包括但不仅限于COS，CHO,HepG-2，CV-I，LLC-MK2,3T3，HeLa，RPMI8226,293，BHK-21，Sf9，酵母(Sacc/^ramyces义毕赤酵母(P/c//"A'汉逊酵母(7/awsewt//a乂克鲁维酵母(A7w_yveraw_yce^人曲霉菌(爿^wg/〃M9或木霉菌(7Wc/70fiter附aJ种属.制备重组载体和转化宿主细胞使用相同的方法和材料，对于载体在宿主细胞中复制以及具有生物活性的外源多肽和蛋白表达的4苗述见Old等人,PrinciplesofGeneManipulation,2ndedition,(1981);Sambrook等人，MolecularCloning,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratory,2001以及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork3rdedition,(2000)以上内容均引入作为参考。载体可以通过任何本领域的已知技术导入宿主细胞，这些方法包括但不仅限于转化，磷酸钙沉淀，电转化，脂质体，显樣"主射以及病毒感染。本发明提供了一种生产融合蛋白的方法，包括制备一个包含编码本发明融合蛋白的多聚核苷酸的载体，将载体转入一个宿主细胞，在融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞，然后分离融合蛋白。本方法可进一步包括将融合蛋白与凝血酶4妄触以裂解该融合蛋白，并且分离目标蛋白。本发明进一步提供了一种生产目标蛋白的方法，包括制备包含编码本发明融合蛋白的多聚核苷酸的载体，将载体转入宿主细胞，在融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞，分离融合蛋白，将分离得到的融合蛋白与凝血酶接触以裂解该融合蛋白，并且分离目标蛋白。融合蛋白可通过任<可本领域的已知4支术,人宿主细胞分离。如果融合蛋白从宿主细胞分泌，则可收集含有融合蛋白的培养基。如果融合蛋白未从宿主细胞分泌，则可溶解细胞以释放融合蛋白。例如，可采用高压(如使用高压匀浆机)或超声溶解细菌细胞。融合蛋白优选通过基于融合伴侣的亲和纯化进行分离。例如，含有GST的融合蛋白可通过含谷胱甘肽的层析柱进行分离，含有六聚组氨酸标签的融合蛋白可通过含金属的层析柱进行分离。尽管亲和纯化法是分离融合蛋白的优选方法，任何已知的蛋白分离技术都可以用于替代或补充亲和纯化，这些技术包括溶剂萃取，超滤，^L酸铵沉淀，HPLC,凝胶过滤层析，离子交换层析，疏水作用层析，电泳以及等电聚焦。在一个实施例中，可将分离4寻到的融合蛋白与凝血酶才妄触，裂解后的蛋白通过亲和层4斤进4亍分离，其中融合伴侣^皮层析柱结合，目标蛋白通过层析柱后被收集。在另一个实施例中，可将融合蛋白通过亲和层析进行分离，然后将从亲和介质洗脱的融合蛋白与凝血酶接触。在一个更进一步的实施例中，融合蛋白在与亲和介质结合的阶段与溶血酶进行接触，从而释放目标蛋白。凝血酶的浓度范围为从约0.1至约IOOUSP单位/毫升，如约1至约50单位/毫升，如约10单位/毫升。流速可通过关闭泵调整为0毫升/分钟，然后维持约5至约60分钟，如约10至约15分钟。通过凝血酶裂解融合蛋白的条件已为本领域7>知，典型条件如下约pH7至约pH9，约4。C至约37。C,底物酶的比例为约5:1至约125:l(摩尔比)，时间为约1小时至约24小时。上述蛋白纯化技术也可以用于凝血酶裂解融合蛋白后目标蛋白的分离。在一个实施例中，目标蛋白采用阳离子交换层析(如CMSEPHAROSE)和/或阴离子交换层析(如QSEPHAROSE)。在一个实施例中，目标蛋白首先采用阳离子交换层析，随后采用阴离子交换层析。例如，由亲和层析分离得到的重组IL-ll蛋白可以首先采用阳离子交换柱，如CMSepharoseFastFlow介质。4吏用该介质填充的层析柱可采用含有25mMTris-HCl的緩冲液B进行平4軒。可将含有IL-ll蛋白的样品采用緩沖液B稀释约4倍，然后上柱。洗柱时，先采用緩沖液B，然后采用含有0.15MGly-NaOH，pH9.5的纟爰冲液E。輩巴蛋白可采用含有0.15MGly-NaOH，pH9.5和0.15MNaCl的緩冲液F进行洗脱。本步骤的所有过程均可在约4'C下进行。緩沖液B的pH值范围为约7.5至约8.5。緩沖液E和緩冲液F的pH范围为约9.2至约9.7。从阳离子交换柱洗脱的重组IL-ll蛋白可以采用阴离子交^灸一主如QSepharoseFastFlow介质进4亍进一步纯化。<吏用该介质填充的层析柱可采用含有1MGly-NaOH,pH9.5的緩沖液G进行平#f。4吏用含有40mMGly-NaOH,pH9.5的纟爰冲液H对柱进4亍再平衡。可将前一步骤获得的样品用水稀释约4倍，然后上柱。收集含有耙蛋白的流出液。4吏用含有40mMGly-NaOH,pH9.5的纟爰沖液H过柱，收集流出液。本步-骤;也pH^直范围为约9.2至约9.7或约9.5。阴离子交换层析的所有步骤均可在室温左右进行。通过这些步吝聚可以有#丈去除内毒素。本发明才是供了一种包含编码一种肽4妻头的多聚核苷酸的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包含了一种带有编码肽接头的多聚核苦酸的载体。在另一实施例中，该载体是表达载体。在一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连接至(如在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码融合伴侣的多聚核苷酸。在另一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连冲妻至(如在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码目标蛋白的多聚核苦酸。在另一实施例中，该载体包含编码融合蛋白的多聚核苷酸，该融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的肽接头。在一个实施例中，该含有编码肽接头的多聚核苷酸的载体在编码肽4妻头的多聚核苷酸的上游和/或下游进一步包含一个或多个如限制性内切酶识别位点等的克隆位点，以帮助编码目标蛋白或融合伴4吕的多聚核苷酸一皮克隆到载体中并与肽^妻头同框。在一个附加的实施例中，该栽体包含可操作地连接至编码融合伴倡的多聚核苷酸的编码肽冲妻头的多聚核苷酸，并在编码肽4妾头的多聚核苷酸上游或下游进一步包含了一个或多个克隆位点。在一个实施例中，多聚核苷酸的顺序为融合伴侣，肽接头，克隆位点。在另一个替代实施例中，多聚核苷酸的顺序为克隆位点，肽4妄头，融合伴侣。在一个实施例中，试剂盒中包含了多个载体，每一个载体包含编码肽-接头的多聚核苷酸和相对肽4妄头处于不同阅读框架内的多个克隆位点，这样编码目标蛋白的多聚核苷酸可以插入到其中一个载体上并与肽接头同框。该试剂盒可进一步包含与载体使用相关的试剂，如緩冲液，限制性内切酶，连接酶，磷酸化酶类，宿主细胞等等。试剂盒还可以包括载体的使用说明，如插入编码目标蛋白的多聚核苷酸或生产融合蛋白的i兌明。药物治疗和药物科学中常见的各种条件和参凄t所作的在本领域中显而易见的适当修改在本发明的精神和范围之内。具体实施例方式实施例1.GST-IL11(A)本实施例中制备了GST-IL11(A)融合蛋白。GST-IL11(A)融合蛋白由谷胱甘肽s转移酶(GST)和人IL-11以及插入在两者之间的凝血酶裂解位点组成。GST-IL11(A)的凝血酶裂解位点为Leu-Val-Pro-Arg-Gly隱Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)。为生产GST-IL11(A),构建了一个E.coli表达质粒pGEX4T画hILll(A)(图1)。编码人IL11(A)的DNA序列可通过PCR和定点突变,人人IL11cDNA获得。下列引物对坤皮用于PCR。5':GGATCCCCGCGAGCTTCCCCAGACCCT(SEQIDNO:12)BamHI3':GTCGACCCCTTATCACAGCCGAGTCTTCAG(SEQIDNO:13)Sail下列引物对被用于定点突变。5'DN:CCAGCCACCCCCGAACCCGCCGGCGCC(SEQIDNO:14)3'DN:GGCGCCGGCGGGTTCGGGGGTGGCTGG(SEQIDNO:15)PCR的5，引物可编石马Pro-Arg-AIa-Ser残基(SEQIDNO:16)。经BamHI/Sall处理的DNA片賴j皮克隆至pGEX4T-l质粒上的BamHI/SalI位点，并得到pGEX4T-hILll(A)。pGEX4T-l质粒自身在GST标签之后带有凝血酶裂解位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQEDNO:l)。这样，pGEX4T-ML11(A)在谷胱甘肽s转移酶和人ILll序列之间具有了新的凝血酶裂解位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-ArgiAla-Ser(SEQIDNO:8)。进行定点突变的目的在于将野生型IL-ll(NCBI序列号AAA59132)的Aspl55变为Asn。含有凝血酶裂解位点的hILll(A)的氨基酸序列如下Leu-Val一Pro-Arg-Gly-Ser一Pro-Arg丄-Ala-Ser一Pro-Asp-Pro-Arg-Ala—Glu陽Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Aa-Leu-Gly-Ala-Leu-Gin-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gin-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gin-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQIDNO:17)表达质粒pGEX4T-hlL11(A)随后4皮转化进入五.co//BL21。将转化才朱接种至添加了氨千西林(最终浓度50jug/ml)的LB培养基中，在37。C下培养至OD600达到0.5。然后添加异丙基-(3-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4mM以诱导蛋白表达，继续在37。C下i咅养细月包3小时。GST-IL11的表达通过SDS-PAGE进行确认。离心收集细胞，再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl緩冲液中并采用超声;容解。添加石危酸4妄至终浓度为5.6%,同时采用Tris粉末将pH维持在8.0。硫酸铵的添加在4。C下进行。含有靶蛋白的上清液加至以pH8.0，25mMTris-HC1IC冲液进4亍预平4軒的谷耽甘月太Sepharose4FastFlow(AmershamBiosciences)亲和柱。多次洗涤后，以含有150mMNaCl和10mM还原性谷月光甘肽的pH8.0的25mMTris-HC1緩冲液洗脱结合的融合蛋白。以凝血酶消化纯化后的融合蛋白。100微克的蛋白样品可采用0.]单位，0.25单位或0.5单位的牛或人凝血酶在含有150mMNaCl，pH8的25mMTris-HCl緩沖液中于20。C下进行裂解。在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时，2小时以及5小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。以SDS-PAGE分析结果，并用考马斯亮蓝着色显示。随反应进行，融合蛋白GST-hILll(A)逐渐分裂成两个主要的产物，GST融合伴侣(26kDa)和IL-11(18.2kDa)(图2A和2B),且未发现IL-11的内部裂解。GST融合^f半侣可^皮牛和人凝血酶在试-验中的浓度范围和时间点有效地裂解(图2Aand2B)。备选地，融合蛋白的GST部分还可以在融合蛋白结合在层析柱时进行去除，其中该层析柱包含了结合容量约为10毫克每毫升的谷月光甘月太Sepharose4FastFlow介质。该4主以谷月光甘肽Sepharose4FastFlow介质进4亍;真充后，用约54咅一主体积(CV)的含有25mMTris-HCl，pH8.0的緩冲液B进行平^f。将细菌溶解得到的上清'液上才羊后，以约20CV的纟爰冲液B洗一主，然后以约5CV的含有pH8.0，25mMTris-HC1和0.15MNaCl的纟爰冲液C进4亍平4軒。然后〗吏用溶解在緩冲液C的凝血酶，其浓度为约IO单位每毫升介质(或约1单位每毫克介质结合容量)。随后使用约3CV的緩冲液C过柱，收集从融合伴侣上分离的IL11(A)。所有的过程均在约20-25。C的室温下进4亍。为4企查IL-ll是否存在任^T内部裂解，可将IL-11先后采用阳离子交换层析和阴离子交换层析进行进一步的纯化，再使用基体辅助激光解吸电离质i普4义(MALDI-TOF/MS)(ProteomicsSolutionI(Voyager-DESTR)，AppliedBiosystems)进4亍分析。才艮4居i十算PI/MW工具(可由au.expasy.org/tools/pitool.html获耳又M寻到的IL-11的预期分子量为18.26kDa，实际观察到了一个18264Da的峰(图3)。/人这一结果可确定在凝血酶裂解GST-IL11(A)后得到了完整的IL-11蛋白。更具体的说，通过亲和层析分离得到的重组IL-ll蛋白首先采用CMSepharoseFastFlow介质进4亍纯化。层析柱以该介质填充后用緩沖液B进行平衡。含有IL-ll蛋白的样品以緩冲液B稀释约4倍后加载到层析柱上。洗柱时，先采用緩冲液B,然后采用含有0.15MGly-NaOH,pH9.5的緩沖液E。耙蛋白可采用含有0.15MGly-NaOH,pH9.5和0.15MNaCl的纟爰冲液F进4亍洗脱。本步骤的所有过程均在约4。C下进行。然后4吏用QS印haroseFastFlow介质对/人阳离子交换柱洗脱的重组IL-ll蛋白进一步纯化。采用含有1MGly-NaOH,pH9.5的緩冲液G对填充该介质的层析柱进行平衡。4吏用含有40mMGly-NaOH，pH9.5的緩冲液H对柱进行再平衡。将前一步骤获得的样品用水稀释约44咅，然后上柱。收集含有靶蛋白的流出液。使用含有40mMGly-NaOH,pH9.5的缓沖液H过柱，收集流出液。本步骤中的pH值约为9.5。阴离子交换层冲斤的所有步4聚均在室温左右进行。通过这些步骤有效去除了内毒素。GST-ILU(A)融合蛋白含有新的凝血酶裂解序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)。尽管Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列包含了已知的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)序列，埃是血酶裂解并非发生在Arg丄Gly，而是在Arg丄Ala。这证明了凝血酶优选Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)而非Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)。实施例2.GST-胸腺肽(34GST-胸腺肽(34表达质粒pGEX-胸腺肽^4可通过在pGEX4T-l-Kan中插入胸腺肽(34的cDNA进行构建(图4)。编码人胸腺肽(34的cDNA可通过反转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)从由K562细胞获得的总RNA中克隆得到。用于PCR的寡聚核苷酸序列如下5':GGATCCCCTCGAGCTTCTGACAAACCCGATATG(SEQIDNO:18)BamHI3':GTCGACTTACGATTCGCCTGC丁TGCTTCTC(SEQIDNO:19)SalI所i殳计的5，引物含有Gly隱Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:20)的编码序列，这样当PCR产物克隆进入pGEX4T-i表达质粒时可生成Leu-Val國Pro-Arg-Gly-Ser画Pro-ArgiAIa画Ser(SEQIDNO:8)序列。通过PCR可4寻到一个135bp的cDNA产物。^1寻扩增产物克隆入pGEM-TEasy质粒(Promega,WI,USA)，获得pGEM-胸月泉肽(34。经过序列确证后，pGEM-胸月泉肽|34的BamHI/Sall片羊殳净皮克隆入pGEX4T-1-Kan载体的相应位点，该载体可通过将pGEX4T-I中的氨爷西林耐药基因替换为卡那霉素耐药基因制备得到。含有凝血酶裂解位点的胸腺肽|34的氨基酸序列如下Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Argi-Ala-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gn-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-lie-Glu-Gin-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser(SEQIDNO:21)该表达质粒—皮一皮转化进入E.coliDH5cc。将转化才朱4妾种至LB培养基，在37。C下培养至OD600达到0.5,然后添加IPTG至纟冬浓度为0.4mM。继续i多养3小时，然后离心收集细力包。GST-胸腺肽P4的表达通过SDS-PAGE进4亍确i人。将细力包再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl緩冲液中并采用超声溶解。采用谷胱甘肽Sepharose4FastFlow从可溶组分中纯化GST-胸腺肽(34。经纯4匕的融合蛋白以凝血酶进4亍消化，并以4吏用15%tricine分离凝胶的SDA-PAGE进行分析。100孩i克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有150mMNaCl和10mM还原型谷胱甘肽的pH8，25mMTris-HCl的缓冲液中于2(TC下进行裂解。在不同的时间点(反应开始后IO分钟，30分钟，1小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白GST-胸腺肽P4(31kDa)逐渐消失，而胸&泉肽(34(5kDa)的凄史量逐沐斤增力o(图5)。以凝血酶裂解后，重新^吏用谷胱甘肽Sepharose4FastFlow对胸腺肽P4进行层析以去除融合蛋白的GST部分。使用Procise491AHT蛋白测序4义(AppliedBiosystems,USA)分才斤胸&泉肽e4的N末端氨基S交序列。经确i正分离后的胸膽J汰P4在N末端具有序歹'JAla-Ser-Asp-Lys匿Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile(SEQIDNO:22)。为冲企查胸腺肽(34是否存在任何内部裂解，可将胸腺肽P4先后采用阳离子交换层析和阴离子交换层析进行进一步的纯4匕，再4吏用MALDI-TOF/MS(ProteomicsSolutionI(Voyager-DESTR),AppliedBiosystems)进4亍分斗斤。才艮才居计算PI/MW工具(可由au.expasy.org/tools/pitool.html获取)得到的胸腺肽(34的预期分子量为5.02kDa，实际观察到了一个4992Da的峰(图6)。从这一结果可确定在凝血酶裂解GST-胸腺肽(34后得到了完整的胸腺肽P4蛋白。实施例3.GST-IL6GST-IL6表达质粒pGEX-IL6可通过在pGEX4T-1中插入一个鼠IL-6的cDNA进行构建(图7)。编码鼠IL-6的cDNA可通过RT-PCR从由鼠树突细胞获得的总RNA中克隆得到。用于PCR的寡聚核苷酸序列如下5':GGATCCCCTCGAGCTTCTTTCCCTACTTCA(SEQIDNO:23)BamHI3，GTCGACCTAGGTTTGCCGAGTAGATCT(SEQIDNO:24)Sail所设计的5，引物含有Gly-Ser-Pro-ArgiAla-Ser(SEQIDNO:20)的编码序列，这才羊当PCR产物克隆进入pGEX4T-i表达质粒时可生成Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列。通过PCR可得到588bp的cDNA。将扩增产物克隆入pGEM-TEasy质粒，获得pGEM-IL6。经过序列确证后，pGEM-IL6的BamHI/Sall片賴^皮克隆入pGEX4T-1载体的冲目应《立点。含有凝血酶裂解位点的IL6的氨基酸序列如下Leu-^Val一Pro-Arg-Gly-Ser一Pro-Argi陽AIa-Ser一Phe匿Pro-Thr一Ser一Gln-Va1—Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-Thr-Glu-Asp-Thr-Thr-Pro-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Thr-Thr陽Ser-Gln-Val-Gly-Gly-Leu-Ilu-Thr-His-Val-Leu-Trp-Glu-Ilu-Val-Glu-Met-Arg-Lys-Glu-Leu-Cys-Asn-Gly-Asn-Ser-Asp-Cys-Met-Asn-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu-Ala-Glu-Asn-Asn-Leu-Lys-Leu-Pro-Glu-Ilu-Gln-Arg-Asn-Asp-Gly-Cys-Tyr-GIn-Thr-Gly-Tyr-Asn-Gln-Glu-Ilu-Cys-Leu-Leu-Lys-Ilu-Ser-Ser-Gly—Leu-Leu-Glu-Tyr-His-Ser—Tyr-Leu-Glu陽Tyr-Met-Lys-Asn陽Asn-Leu-Lys-Asp-Asn-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Asp-Thr-Glu-Thr-Leu-Ilu-His-Ilu-Phe-Asn-Gln-Glu-Val-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ilu-Val-Leu-Pro-Thr-Pro-Ilu-Ser-Asn-Ala-Leu-Leu-Thr-Asp-Lys-Leu-Glu-Ser-Gln-Lys-Glu-Trp-Leu-Arg-Thr-Lys-Thr-nu-Gln-Phe-Ilu-Leu-Lys-Ser-Leu-Glu-Glu-Phe-Leu-Lys-Val-Thr-Leu-Arg-Ser陽Thr-Arg-Gln-Thr(SEQIDNO:25)表达质粒随后被转化进入E.coliBL21。将转化株接种至添加了氨节西林(最终浓度50mg/ml)的lb培养基中，在37°C下培养至OD600达到0.5，然后添力。IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细月包。GST-IL6的表达通过SDS-PAGE进4亍确i人。将细月包再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中并采用超声>容解。采用谷胱甘肽Sepharose4FastFlow乂人可溶组分中纯4匕GST-IL6。以凝血酶消化纯化后的融合蛋白并以SDS-PAGE进行分析。100孩i克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有150mMNaCl和10mM还原型谷胱甘肽的pH8，25mMTris-HC1的緩冲液中于20。C下进ff裂解在不同的时间点(反应开始后10分4f,30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白GST-IL6(46kDa)逐)新消失，而IL6(22kDa)的凄t量逐)新增加(图8)。欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-6蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的GST-IL6蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进行分离。然后将聚丙烯酰胺凝月交上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-6蛋白的条带后，将其从PVDF膜上切下，然后进4亍氨基酸测序。经确i正IL-6在N末端具有序歹'JAla-Ser-Phe-Pro-Thr-Ser-Gin-Val-Arg陽Arg(SEQIDNO:26)。实施例4.GST-PAR4已知蛋白酶激活受体(PARs)可#皮N末端exodomain的蛋白水解激活(Kahn等，J.C//w./wve"103:879(1999))。构成这一蛋白家力矣共有4个PARs(PARI-4)，其中PAR1，3和4可^皮凝血酶激活(Coughlin,尸rac.淑/.^c"c/.USA96:11023(1999)).PAR4上的凝血酶裂解位点的氨基酸序列为Leu43-Pro-Ala-Pro-Arg4-Gly-Tyr(SEQIDNO:27)。我们生产了以Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄-Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列作为另一凝血酶裂解位点的GST-PAR4蛋白，以测试凝血酶优选哪一个位点。GST-PAR4表达质粒pGEX-PAR4可通过在pGEX4T-l-Kan中插入人PAR4的cDNA进4亍构建(图9)。编码人PAR4的cDNA可通过RT-PCR从由K562细胞获得的总RNA中克隆得到用于PCR的寡聚核苷酸，序列如下5':GGATCCCCTCGAGCTTCTATGTGGGGGCGA(SEQIDNO:28)BamHI3，GTCGACTCAGTGCACCAGGGCCAGGTA(SEQIDNO:29)SalI所i殳计的5，引物含有Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:20)的编码序列，这样当PCR产物克隆进入pGEX4T-l-Kan质粒时可生成Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)。[OIOO]通过PCR可得到540bp的cDNA。将扩增产物克隆入pGEM-TEasy质粒，获得pGEM-PAR4。经过序列确i正后，pGEM-PAR4的BamHI/Sall片#殳#皮克隆入pGEX4T-l-Kan载体的相应位点。含有凝血酶裂解位点的PAR4的氨基酸序列如下Leu画V"al-Pro-Arg國Gly-Ser一Pro-Argi-Ala-Ser-Met-Trp-Gly-Arg-Leu-Leu-Leu-Trp-Pro-Leu-Val-Leu-Gly-Phe-Ser-Leu-Ser-Gly-Gly-Thr-Gln-Thr-Pro-Ser-Val-Tyr-Asp-Glu-Ser-Gly-Ser-Thr-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ser-Thr-Pro-Ser-IIe-Leu-Pro-Ala-Pro-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val-Cvs-Ala-Asn-Asp-Ser-Asp-Thr-Leu-Glu-Leu-Pro-Asp-Ser-Ser-Arg-Ala-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr陽Val-Pro-Thr-Arg-Leu-Val-Pro-Ala-Leu-Tyr-Gly-Leu-Val-Leu-Val-Val-Gly-Leu-Pro-Ala-Asn-Gly-Leu-Ala-Leu-Trp-Val-Leu-Ala-Thr-Gln-Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Ser-Thr-Met-Leu-Leu-Met-Asn陽Leu-Ala-Thr-Ala-Asp-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Ala-Tyr-His-Leu-Arg-Gly-Gln-Arg-Tyr-Pro-Phe-Gly-Glu-Ala-Ala-Cys-Arg-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Leu-Tyr-Gly-His-Met-Tyr-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Leu-Asp-Arg-Tyr-Leu-Aa-Leu-Val-His(SEQIDNO:30)下划线部分为内部;疑血酶裂解位点。表达质粒随后被转化进入E.coliBL21。将转化林接种至添加了卡那霉素(最终浓度50ug/ml)的LB培养基中，在37°C下培养至OD600达到0.5,然后添力oIPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。GST-PAR4的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于50mM,pH8.0的Tris-HCl緩冲液中并采用超声溶解。采用谷胱甘肽Sepharose4FastFlow从可溶组分中纯化GST-PAR4。经纯化的融合蛋白以凝血酶进4亍消化，并以SDA-PAGE进4亍分析。100孩i克的蛋白才羊品可采用0.5单位的凝血酶在含有150mMNaC和10mM还原型谷胱甘肽的pH8，25mMTris-HCI的緩冲液中于2(rc下进4亍裂解。在不同的时间点(反应开始后io分钟，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。实施例5.GST-ILI1(LV-)为测试进行有效的凝血酶裂解是否需要完整的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列，构建了编码Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)作为凝血酶裂解位点的表达质粒。首先参照实施例1的方法从pGEX4T-ILll(A)中获取含有IL-ll(A)的BamHI/Sall片段。然后将其插入pGEX6P-2的BamHI/Sall位点，获得pGEX6P-ILl1。质粒pGEX6P-2在BamHI位点的上游含有"Pro-Leu"序列。因此，由于含有IL-ll(A)的BamHI/Sall片段以Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:20)序列起始，所以pGEX6P-ILll可以具有Pro-Leu-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:31)。通过定点突变将第二个氨基酸Leu该为Arg，以得到Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)序列。下述寡聚核普酸序列,皮用于定点突变5':CAGGGGCCCCGGGGATCCCCTCGAGCT(SEQIDNO:32)所得的质粒被命名为pGEX-ILll(LV-)(图10)，用于GST-ILll(LV-)的生产。含有凝血酶裂解位点的IL-1l(LV-)的氨基酸序列如下Pro扁Arg-Gly-Ser-Pro画Argi-Ala-Ser—Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gin-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-VaI-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg—Ala-Gly-Gly—Ser-Ser-Leu—Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gin-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gin-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala画Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQIDNO:34)[107]表达质粒随后被转化进入E.coliBL21。将转化株接种至添加了氨千西林(最终浓度50jug/ml)的LB培养基中，在37°C下培养至OD600达到0.5,然后添加IPTG至终浓度为0.4mM。继续i备养3小时，然后离心收集细胞。GST-ILll(LV-)的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl纟爰冲液中并采用超声〉容解。采用谷月光甘肽Sepharose4FastFlow,人可溶组分中纯化GST-ILU(LV-)。经纯化的融合蛋白以凝血酶进^亍消化，并以SDA-PAGE进行分析.100孩i克的蛋白样品可釆用0.5单位的凝血酶在含有150mMNaCl的pH8，25mMTris-HCl的纟爰沖'液中于20。C下进4亍裂解在不同的时间点(反应开始后10分4中，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活乡冬止反应。随反应时间的增力口，融合蛋白GST-ILll(LV-)(44kDa)逐渐消失，而IL-11(LV-)(18kDa)的数量逐渐增力口(图11)。欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-ll(LV-)蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的GST-IL11(LV-)蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进行分离。然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-ll(LV-)蛋白的条带后，将其,人PVDF膜上切下，然后进行氨基酸测序。经确证IL-11(LV-)在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp(SEQIDNO:35),i兌明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)已足够进4亍有效的凝血酶裂解。实施例6.MBP-IL11MBP-IL11表达质粒pMAL画c2-IL11可通过在pMAL-c2中插入人IL-11的cDNA进行构建(图12)。编码人IL-11的cDNA可从pGEX4T-ILll(A)通过PCR获取。用于PCR的寡聚核苷S臾序列如下5，GAATTCCCTCGAGGTTCACCTCGAGCTTCC(SEQIDNO:36)EcoRI3':GTCGACTCACAGCCGAGTCTTCAGCAG(SEQIDNO:37)SalI[Olll]所设计的5，引物含有Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)的编码序列。含有IL-ll序列的EcoRI/Sall片段被克隆入pMAL-c2载体的EcoRI/Sall位点，得到pMAL-c2-ILl1。因此，pMAL-c2-IL11与pGEX-ILll(LV-)在麦芽糖结合域和人IL-ll序列之间具有相同的凝血酶裂解位点。在麦芽糖结合域下游含有凝血酶裂解位点的IL-ll的氨基酸序列如下Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Argi-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro陽Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-GIn-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gin-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gin-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQIDNO:34)表达质粒随后被转化进入E.coliBL21。将转化4朱接种至添加了氨千西林(最终浓度50jag/ml)的LB培养基中，在37。C下培养至OD600达到0.5,然后添力口IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。MBP-IL11的表达通过SDS-PAGE进4亍确^人。将细月包再悬浮于含有200mMNaCl，1mMEDTA和1mM叠氮化钠的20mM，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中并采用超声溶解。含有草巴蛋白的上清液力口至以含有200mMNaCl和lmMEDTA的20mM，pH7.4的Tris-HClH冲液进4亍预平^f的直链淀升分(NewEnglandBiolabs)亲和柱。多次洗涤后，用含有200mMNaCl，lmMEDTA和10mM麦芽一唐的20mM,pH7.4的Tris-HCli差沖液洗脱结合的融合蛋白。经纯化的融合蛋白以凝血酶进4亍消化，并以SDA-PAGE进4亍分冲斤。100孩i克的蛋白冲羊品可采用0.5单^f立的;疑血酶在含有200mMNaCl，lmMEDTA和lOmM麦芽#唐的20mM,pH7.4的Tris-HC1的缓冲液中于20。C下进行裂解在不同的时间点(反应开始后10分4中，30分4t,l小日于，2小时以及3小时)乂人反应中耳又出等量的冲羊品，通过煮沸5分4f进^于热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白MBP-IL11(60kDa)逐洋斤消失，而ILll(18kDa)的数量逐渐增加(图13)。欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-ll蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的MBP-IL11蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进4亍分离。然后^)夺聚丙蹄酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-ll蛋白的条带后，将其从PVDF膜上切下，然后进行氨基酸测序。经确证IL-11在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp(SEQIDNO:38),i兌明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)已足够进一于有效的凝血酶裂解。实施例7.HIS-IL11所i殳计的5，引物含有Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-ArgiAla-Ser(SEQIDNO:7)的编码序列。含有IL-l1序列的Ndel/BamHI片^殳4皮克隆至pET19b载体上的Ndel/BamHI位点，并得到pET19b-ILll。因此，pET19b-IL11与pGEX-ILll(LV-)在His标签和人IL-ll序列之间具有相同的凝血酶裂解位点。在His标签下游含有凝血酶裂解位点的IL-l1的氨基酸序列如下Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Argi-AIa-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gin-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-GIy-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gin-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu隱His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr匿Arg-Leu(SEQIDNO:34)将表达质粒转化进入E.coliBL21(DE3)。将转化抹接种至添加了氨千西林(最终浓度50jug/ml)的LB培养基中，在37°C下培养至OD600达到0.5，然后添力口IPTG至乡冬浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。His-ILll的表达通过SDS-PAGE进4亍确i人。将细月包再悬浮于含有0.5MNaCl的20mM，pH7.4的Tris-HCl緩冲液中并采用超声溶解。含有把蛋白的上清液加至以含有0.5mMNaCl和20mM。米唑的20mM,pH7.4的石粦酸钠纟爰沖液进4亍予贞平4軒的Ni画Sepharose高凌文(AmershamBiosciences)亲禾口片主。多>欠洗涤后，用含有0.5mMNaCl和500mM。米峻的20mM，pH7.4的石庳酸钠緩冲液洗脱结合的融合蛋白。经纯化的融合蛋白以凝血酶进行消化，并以SDA-PAGE进行分析。100孩i克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有0.5mMNaCl和500mM。米峻的20mM，pH7.4的石舞酸钠纟爰冲'液中于20。C下进行裂解。在不同的时间点(反应开始后IO分钟，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白His-IL11(22kDa)逐;新消失，而ILll(18kDa)的^t量逐渐增加(图15)。欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-ll蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的His-IL11蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进4亍分离。然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-11蛋白的条带后，将其从PVDF膜上切下，然后进行氨基酸测序。经确证IL-11在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu陽Asp(SEQIDNO:41),"i兌明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)已足够进行有效的凝血酶裂解。现在经过对发明的完整描述，本领域的普通4支术人员均能理解在一个宽泛且等效的条件，配方和其他参凄t范围内可实现同等效果而不影响本发明和其中任意实施例的范围。此处所引用的专利，专利申请以及出版物均在此完整引入作为参考。权利要求1.一种包含以下序列的肽接头X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中X1是两个或两个以上彼此相同或不同的氨基酸残基；X2是疏水氨基酸残基；X3是精氨酸或赖氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一种非酸性氨基酸。2.如权利要求1所述的肽接头，其中XI是4个或4个以上的氨3.如4又利要求1所述的肽4妻头，其中XI是不超过10个的氨基酉复歹芙H。4.如权利要求1所述的肽接头，其中XI包舍脯氨酸和精氨酸。5.如权利要求1所述的肽接头，其中X2选自由甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所组成的群。6.如权利要求5所述的肽4妄头，其中X2是甘氨酸。7.如权利要求1所述的肽接头，其中X5选自由丝氨酸，丙氨酸，天门冬酰胺，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，笨丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所组成的群。8.如权利要求7所述的肽接头，其中X5是丝氨酸。9.如4又利要求1所述的肽一妻头，其特4正在于，包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)。10.如权利要求1所述的肽4妻头，其特4正在于，包含序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)。11.一种融合蛋白，其包含个目标蛋白，融合伴倡以及插在两者之间的肽4妄头；所述爿大4喜头包含以下序列Xl-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中XI是两个或两个以上彼此相同或不同的氨基酸残基；X2是疏L水氨基酸残基；X3是精氨酸或赖氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一种非酸性氨基酸。12.如权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述的目标蛋白选自由白介素(IL)-11，胸腺肽(34，胸腺肽a1，1L-2,1L-3，IL-4，1L-5,IL-6,IL-7,IL-8，1L-10,IL-13,fL-15，IL-18,蛋白酶激活受体l(PARl),PAR3,PAR4，RANTES,基质细月包书f生因子-1a，单核细胞趋化蛋白，千细胞因子，FLT-3L，甲状旁腺激素，血小板生成素，表皮细胞生长因子，碱性成纤維细胞生长因子，胰岛素样生长因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，血小板源生长因子，转化生长因子(TGF)-(3l，肿瘤坏死因子(T'NF)-a，干扰素(IFN)-oc，IFN-(3，IFN-Y,肝细胞生长因子，血管内皮生长因子以及免疫J求蛋白重《连所ia成的群。13.如权利要求12所述的融合蛋白，其中所述的目标蛋白选自由人IL1],胸月泉肽(34,IL-6和PAR4所纟且成的群。14.如权利要求12所迷的融合蛋白，其中所述的目标蛋白为人ILU。15.如权利要求11所述的融合蛋白，其中所述的融合伴倡是一种亲和肽。16.如权利要求15所述的融合蛋白，其中所述的融合伴估选自由谷胱甘肽s转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP),六聚组氨酸，T7多月大，泛素，Flag多肽，c-myc多月太，聚4青氨酸，聚半胱氨酸，聚笨丙氨酸，BTag，半乳糖结合域，纤维素结合域(CBD)，硫氧还蛋白，葡萄球菌蛋白A,链球菌蛋白G,钙调蛋白，[3-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，S-多肽，链霉亲和素，His-标签和Strep-标签所组成的群。17.如4又利要求16所述的融合蛋白，其中所述的融合伴侣是GST。18.—种从权利从要求11所述的融合蛋白分离目标蛋白的方法'，包括使融合蛋白与足够量的凝血酶接触从而引起肽接头的裂角,。19.如权利要求18所述的方法，其中所述的融合蛋白在肽接头的X3一口X4间断裂。20.如权利要求18所述的方法，其中所述的凝血酶为人凝血酶「21.如权利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白与约O.]单位至约1.0单位的凝血酶4妻触。22.如冲又利要求21所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单4立至约0.7单^立的;疑血酶4妻触。23.如权利要求22所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.5单位的凝血酶4妻触。24.如权利要求23所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.3单位的凝血酶接触。25.如权利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约5分钟至约1.5小时。26.如权利要求25所述的方法，其角虫约8分钟至约1.2小时。27.如权利要求26所3'息的方法，角虫约10分4中至约1.0小时.,其中所述的融合蛋白与凝血酶接28.如权利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.25单位凝血酶-接触约30分钟。29.如权利要求18所述的方法，其中所述的凝血酶为牛凝血酶。30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白与约0.1单位至约1.0单位的凝血酶4妻触。31.如权利要求30所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2与4立至约0.7单4立的;疑血S争4妻触。32.如权利要求29所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约5分钟至约1.5小时。33.如权利要求32所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约8分4f至约1.2小时。34.如权利要求33所述的方法，其中所述的融合蛋白与凑是血酶4妄触约10分4中至约1.0小时。35.如4又利要求29所述的方法，其中所i底的融合爿蛋白与约0.5单4立;疑血f錄^妻触约i.o小时。36.—种编码4又利要求1所述的肽4妻头的多聚核苦酸。37.如权利要求36所迷的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X2选自由甘氨酸，丙-氮酸，脯氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，笨丙氨酸，酪-氮酸以及色-氮酸所组成的群。38.如权利要求37所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X2是甘氨酸。39.如权利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X5选自由丝-氮酸，丙氨f狻，天门冬酰胺，缬—氮酸，亮氨酸，异亮#7複，赖氨酸，笨丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所组成的群。40.如权利要求39所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X5《酸。41.如权利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)。42.如权利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头包含序列Leu-VaI-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro隱Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)。43.—种编码权利要求11所述融合蛋白的多聚核普酸。44.如4又利要求43所述的多聚核苷酸，其中所述的目标蛋白选自由白介素(IL)-ll,胸月泉肽(34,胸月泉肽al，IL-2,IL-3，IL-4,IL-5,IL-6，IL-7,IL-8，IL-10,IL-13，IL-15,IL-18,蛋白酶激活受体l(PAR]),PAR3,PAR4,RANTES，基质细胞衍生因子-la,单核细胞趋化蛋白，干细胞因子，FLT-3L,甲状旁腺激素，血小板生成素，表皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，月臭岛素样生长因子，粒细月包-巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，血小板源生长因子，转化生长因子(TGF)-(31,肿瘤坏死因子(TNF)-a,干扰素(IFN)-cc,IFN-(3，IFN-Y,肝细胞生长因子，血管内皮生长因子以及免疫J求蛋白重《连所组成的群。45.如权利要求44所述的多聚核苷酸，其中所述的目标蛋白为人.IL11。46.如斥又利-要求43所述的多聚核苷酸，其中所述的融合伴侣是一种亲和肽。47.如权利要求46所述的多聚核苷酸，其中所述的融合伴侣选自由谷胱甘肽s转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP),六聚组—氨酸，T7多肽，泛素，Flag多肽，c-myc多肽，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，BTag,半乳糖结合域，纤维素结合域(CBD)，石克氣还蛋白，葡萄J求菌蛋白A,链3求菌蛋白G,钙调蛋白，(3-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，S-多肽，链霉亲和素，His-标签和Strep-标签所组成的群。48.如权利要求47所述的多聚核香酸，其中所述的融合伴估是GST。49.一种包含权利要求43所述多聚核苷酸的载体。50.如4又利要求49所述的载体，其进一步包含一个或多个可才喿作地连4妻至所述多聚核苦酸的调节序列。51.—种包含权利要求50所述载体的宿主细胞。52.如权利要求51所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为原核纟田月包。53.如权牙要求51所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为真核纟田月包。54.—种包含权利要求36所述多聚核苷酸的载体'，55.如权利要求54所述的载体，进一步包含一个或多个位于所述多聚核香酸的上游和/或下游的克隆位点。56.如权利要求54所述栽体，进一步包含一种位于所述多聚核苷酸的上游和/或下游并与该多聚核苷酸同框的编码融合伴4吕的多聚核苷酸。57.如权利要求54所述的载体，其进一步包含一个或多个可操作地连接至所述多聚核苷酸的调节元件。58.—种包含权利要求54所述载体的宿主细胞。59.如权利要求58所述的宿主细胞，其中所述的宿主细月包为原核全田月包。60.如—又利要求58所述的宿主细胞，其中所迷的宿主细胞为真核细胞。61.—种制备编码融合蛋白的多聚核苷酸的方法，其包括在4又利要求55所述的载体的克隆位点4翁入编码目标蛋白的多聚核普酸。62.—种制备融合蛋白的方法，包括a)制备包含一种编码融合蛋白的多聚核苷酸的载体，所述融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的如权利-要求1所述的肽接头；d)分离所述融合蛋白。63.—种制备目标蛋白的方法，包4舌a)制备包含一种编码融合蛋白的多聚核苷酸的载体，所述融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的如权利要求]所述的肽4妄头；b)将所述载体转入宿主细月包；c)在融合蛋白表达的条件下培养所述的宿主细胞；d)分离所述融合蛋白；e)将所述融合蛋白与凝血酶进行接触以裂解所述融合蛋白；以.及f)分离所述目标蛋白。64.如权利要求63所述的方法，其中所述的宿主细胞是真核细胞。勺宿主细力包；以及65.如权利要求63所述的方法，其中所述的宿主细胞是原核细胞。66.如权利要求65所述的方法，其中所述的宿主细胞是细菌细月包。67.如权利要求66所述的方法，其中所述的细菌细胞在步骤(d)中采用高压进行溶解。68.如权利要求67所述的方法，其中所述的细菌细胞以高压匀装才几进行溶解。69.如^U']要求63所述的方法，其中对所述融合细月包的所述分离采用亲和柱进4亍。70.如权利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白与凝血酶的接71.如权利要求69所迷的方法，其中所述融合蛋白的所述分离进一步包括对所述目标蛋白进《亍阳离子交换层析。72.如4又利要求69所述的方法，其中所il融合z蛋白的所述分离进一步包括对所述目标蛋白进行阴离子交换层析。73.如权利要求63所述的方法，其中所述的凝血酶为人凝血酶。74.如4又利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.1单位至约l.0单位的凝血酶接触。75.如权利要求74所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.7单位的凝血酶接触。76.如权利要求75所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约().5单位的;疑血酶-接触。77.如权利要求76所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.3单位的凝血酶4秦触。78.如权利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约5分钟至约1.5小时。79.如4又利要求78所述的方法，其中所述的融合蛋白与;疑血酶4妾触约8分^t至约1.2小时。80.如权利要求79所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约10分4中至约1.0小时。81.如权利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.25单位凝血酶^妾触约30分钟。82.如4又利要求81所述的方法，其中所述的;疑血酶为牛省是血惑争，83.如权利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白与约().l单4立至约1.0单〗立的;疑血S条4妻触。84.如权利要求83所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.7单位的凝血酶4妻触。85.如权利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶4妾触约5分钟至约1.5小时。86.如权利要求85所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约8分钟至约1.2小时。87.如权利要求86所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约10至约1.0小时。88.如权利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.5单位凝血酶^妻触约1.0小时。89.—种包含权利要求54所述载体的试剂盒。90.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述载体进一步包含一个或多个位于所述多聚核苦酸的上游和/或下游的克隆位点。91.如权利要求89所述试剂盒，其中所述载体进一步包含一种位于所述多聚核苷酸的上游和/或下游并与该多聚核苷酸同框的编码融合伴侣的多聚冲玄苷酸。92.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述载体进一步包含一个或多个可^t喿作地连4妻至所述多聚核苷酸的调节元件。93.如权利要求89所述的试剂盒，进一步包含对所述载体的使用说明。全文摘要本发明涉及一种融合蛋白的组成及利用一种含有新型凝血酶裂解位点的肽接头进行融合蛋白分离的方法。文档编号C07K7/04GK101287748SQ200680022054公开日2008年10月15日申请日期2006年4月20日优先权日2005年4月20日发明者许松山,金水晶,金钟默申请人:百疗医株式会社