抗肿瘤化合物及其药物组合物的制作方法

专利名称：抗肿瘤化合物及其药物组合物的制作方法
专利说明抗肿瘤化合物及其药物组合物 发明领域 本发明可被描述成分子药理学领域，特别是与肿瘤学相关，更具体而言与通过in silico分子建模获得的化合物相关，所述化合物基于其通过直接或间接相互作用，阻断酪蛋白激酶2底物上的磷酸接纳位点的能力而具有明显的细胞毒性作用和抗肿瘤作用。

背景技术：
酪蛋白激酶2(CK2)是参与细胞增殖增加的丝氨酸/苏氨酸酶，在恶变过程中其主要的胞内位置是细胞核(Tawfic S.，Yu S.，Wang H.等人(2001)Protein kinase CK2 signal in neoplasia.Histol.Histopathol.16573-582)。此外，一些对致病人免疫缺损病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)而言关键的病毒蛋白已经被报道为CK2底物(Meggio F.，Marin O.等人(2001)Mol Cell Biochem 227145-151；Franck N.，Le Seyec J.等人(2005)Hepatitis C virus NS2 proteinis phosphorylated by the protein kinase CK2 and targeted fordegradation to the proteasome.J Virol.792700-2008)。
世界各地其它小组的发现也证实了与正常组织相比，在上皮来源的不同实体肿瘤中升高水平的CK2的存在大约高3-7倍(Tawfic S.，Yu S.等人(2001)Protein kinase CK2 signal in neoplasia.HistolHistopatol.16573-582；Faust R.A.，Gapany M.等人(1996)Elevated protein kinase CK2 activity in chromatin of head andneck tumorsassociation with malignant transformation.CancerLetters 10131-35)，除了CK2酶的磷酸化活性是细胞恶变中非常重要的事件外，它还构成肿瘤进展的较强标记(Seldin D.C.，LederP.(1995)Casein Kinase IIα transgene-induced murine lymphomarelation to theileroiosis in cattle.Science 267894-897)，另一方面，CK2的过量表达导致乳腺细胞肿瘤发生，这是由于信号级联Wnt/β-连环蛋白中的正调节所致(Landesman-Bollag E.，Romien-Mourez R.等人(2001)Protein Kinase CK2 in mammary glandtumorigenesis.Oncogene 203247-3257)。近来的发现还表明CK2在某些其它过程如染色质重塑(Barz T.，Ackenmann K.等人(2003)Genome-wide expression screens indicate a global role forprotein kinase CK2 in chromatin remodelling.J CellSci.1161563-1577)和细胞存活的调节(Unger G.M.，Davis A.T.，Slaton J.W.，Ahmed K.(2004)Protein kinase CK2 as regulatorof cell survivalimplications for cancer therapy.Curr CancerDrug Targets，477-84)中起重要作用。极为重要的是，为了了解癌症的发展过程，已经证明CK2介导的磷酸化是对细胞存活而言非常强的信号，因此认为该酶是细胞生理学的抗细胞凋亡介体(Ahmed K.，Gerber D.A.，Cochet C.(2002)Joining the cell survivals quadan emerging role for protein kinase CK2.Trends Cell Biol，12226-229；Torres J.，Rodriguez J.等人(2003)Phosphorylation-regulated cleavage of the tumour suppressorPTEN by caspase-3implications for the control of proteinstability and PTEN-protein interactions.J Biol Chem，27830652-60)。
基于上述发现，CK2介导的磷酸化已经被证实为一种生化事件，适于用作对癌症进行治疗性干预的潜在靶，使这种事件所有的潜在抑制剂成为这种病症治疗的预期候选物。直到现在，全世界若干研究小组已经开发了抑制CK2介导的磷酸化的不同策略，其使用两种实验方法a)CK2酶的直接抑制，或b)靠近酸性域的磷酸化位点的阻断，该酸性域被描述为所有CK2底物共有的。就两种方法而言，作者已经能够证实这样的概念，即CK2介导的磷酸化事件的抑制诱导肿瘤细胞的细胞凋亡，其暗示实验证实了CK2在寻找用于癌症治疗的药物中是非常可能的靶。
例如，经测试，酶的直接抑制剂如4，5，6，7-四溴三唑(TBB)，在微摩尔浓度范围内，在Jurkat细胞中是潜在的细胞凋亡和胱冬酶依赖性降解诱导剂(Ruzzene M.，Penzo D.，Pinna L.(2002)Proteinkinase CK2 inhibitor 4，5，6，7-tetrabromobenzotriazole(TBB)induces apoptosis and caspase-dependent degradation ofhaematopoietic lineage cell-specific protein 1(HS1)in Jurkatcells.Biochem J.，36441-47)。而且，通过使用反义寡核苷酸抑制CK 2酶的表达，已经在小鼠实验性癌症模型中证实了体外细胞凋亡作用和抗肿瘤作用(Guo C.，Yu S.等人(2001)A potential role ofnuclear matrix-associated protein kinase CK2 in protectionagainst drug-induced a poptosis in cancer cells.J Biol Chem，2765992-5999；Slaton J.W.等人(2004)Induction of apoptosisby antisense CK2 in human prostate cancer xenograft model.MolCancer Res.2712-721)。
其它化合物如蒽醌衍生物、类黄酮化合物和卤代偶氮苄基咪唑已经被描述为CK2 ATP结合位点抑制剂(Sarno S.等人(2002)Towardthe rational design of protein kinase casein kinase-2inhibitors.Pharmacol Therapeutics 93159-168)，且使用高通量筛选，5-氧代-5，6-二氢吲哚(1，2-a)喹唑啉-7-基乙酸(IQA)已经被报道为选择性CK2抑制剂(Vangrevelinghe E.等人(2003)Biochemicaland three-dimensional-structural study of the specificinhibition of protein kinase CK2 by[5-oxo-5，6-dihydroindolo-(1，2-a)quinazolin-7-yl]acetic acid(IQA).J.Med.Chem.462556-2662)。
上述化合物已经显示出在微摩尔范围的抑制浓度50(IC50)下它们的CK2活性抑制作用，但没有报道在癌症的实验模型中任何抗肿瘤作用的证据。
抑制CK2介导的磷酸化过程的其它所述的方法是阻断存在于该酶的底物中的酸性域内的磷酸化位点。在专利申请WO 03/054002中和在Perea S.E.等人(2004)的著作Antitumor effect of a novelproapoptotic peptide impairing the phosphorylation by theprotein kinase CK2.Cancer Res.647127-7129中，作者建议使用体外阻断CK2底物的磷酸化的环肽家族，并说明了在临床前癌症模型中的肿瘤细胞毒性和抗肿瘤作用。然而，在这样的报道中所述的肽具有本身不能渗透到细胞中的限制，因此需要与它们融合的透膜肽。一般而言，当与小分子比较时，肽的使用具有在循环过程中降低的体内稳定性、降解、很难配制成口服给药剂型的缺点且它们不容易在细胞内转运(Ludger Wess，IsogenicaImproving peptides，BiocenturyOctober 25，2004)。该文献中广泛描述的肽的其它问题是快速清除、它们的免疫原性潜能，并且已知它们的每一治疗剂量的成本通常优于非肽类药物。
发明概述 考虑到对于前述环肽类作为候选治疗剂的使用的潜在限制，本发明描述了能够通过与底物上的磷酸接纳位点直接或间接相互作用而抑制CK2介导的磷酸化，并在癌症动物模型中引起细胞毒性和抗肿瘤作用的化学分子。
在此描述的化合物具有明确的化学结构，使它们能够完成下列作用中的一种或几种 A使化合物与CK2底物中的磷酸化功能域或它的环境结合，以直接或间接方式阻断酶与底物结合。
B使化合物与CK2底物的磷酸化功能域结合，允许酶结合，但以直接或间接方式阻断磷酸基团向磷酸受体丝氨酸转移。
C使化合物与CK2蛋白底物结合，引起磷酸化功能域，它的环境，或两者的构象改变，其作用方式是直接或间接地阻断CK2的结合或磷酸基团向磷酸受体丝氨酸转移。
因此，这些化合物的主要特征在于它们的抑制CK2介导的磷酸化的生化事件的能力。
在具体实现时，本发明涉及下列化学分子，其特征在于具体的化学结构是通过以连续方式结合的一些化学元素在分子的任何部分中的出现来限定的，其具有所示的电子杂化且分为下列五个结构组 I.N-[C(sp2)]1，2，3-N II.N-[C(sp2)]1，2-[C(sp3)]1，2，3-N III.N-[C(sp3)]1，2，3-N IV.N-C(sp2)-[C(sp3)]1，2-C(sp2)-N V.N-C(sp3)-[C(sp2)]1，2-C(sp3)-N 属于这种结构类别的若干化合物在下面表示 1.
C30401 (1Z)-3，5，5-三甲基环己-2-烯-1-酮缩氨基脲 2.
C30402 N-(4-氨基-2，6-二羟基嘧啶-5-基)-N′-异丙基硫脲 3
C30403 N-丁基-N′-(2-呋喃甲基)脲 4.
C30404 3-({[(2-羧乙基)氨基]羰基}氨基)丙酸 5.
C30405 1-(2-氯乙基)-3-(氰基甲基)脲 6.
C30406 (2E)-1-(1H-吲哚-3-基)丙酮缩氨基硫脲 7.
C30407 N，N′，N″-磷酰基三肼羧酰胺 8.
C30408 (1E，4E)-1-苯基己-4-烯-1-酮缩氨基脲 9.
C30409 1-(2，5-二氧咪唑烷-4-基)-3-(羟甲基)脲 10.
C30410 N-(3，5-二氯苯基)-4，6-双(三氯甲基)-1，3，5-三嗪-2-胺 11.
C30411 1-叔-丁基-3-(2-氯乙基)脲 12.
C30412 1-(2-氯乙基)-3-(1-甲基-1-苯乙基)脲 13.
C30413 1-(2-氯乙基)-3-[1，1-二甲基-2-(甲磺酰基)乙基]脲 14.
C30414 3-氨基-N-苄基-2-(甲酰氨基)-3-亚氨基丙酰胺 15.
C30415 (2Z)-1-苯氧基丙酮缩氨基硫脲 16.
C31416 {[({[(氨基乙酰基)氨基]乙酰基}氨基)乙酰基]氨基}乙酸 17.
C31417 [({[(苄氧基)羰基]氨基}乙酰基)(甲基)氨基]乙酸 18.
C31418 ({[(2-溴丙酰基)氨基]乙酰基}氨基)乙酸 19.
C31419 (1E，1′E)-2，2′(2，4-二氧嘧啶-1，3(2H，4H)-二基)二乙酸二缩氨基硫脲 20.
C31420 ({[(3-氨基丙酰基)氨基]乙酰基}氨基)乙酸 21.
C31421 2-{[4-氟-3-(三氟甲基)苯基]氨基}乙酰肼 22.
C31422 2-[(3-碘苯基)氨基]乙酰肼 23.
C31423 N-(2，3-二羟丙基)-2-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酰胺 24.
C31424 2-({[(氨基乙酰基)氨基]乙酰基}氨基)戊酸 25.
C32425 2，2′-[(1，2-二硫代乙烷-1，2-二基)二亚氨基]二乙酸 26.
C33426 N-(2-氨乙基)-N′-{2-[(2-氨乙基)氨基]乙基}乙烷-1，2-二胺 27.
C33427 N，N′-(1，4-二氯丁烷-2，3-二基)二甲磺酰胺 28.
C34428 2-({3-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]丙基}氨基)乙醇 29.
C34429 (2，4-二羟基嘧啶-5-基)氨基磺酸 30.
C34430 1-(2，5-二氧代咪唑烷-4-基)-N-[3-(三氟甲基)苯基]甲磺酰胺 31.
C34431 N′-(2-羟乙基)异烟肼 32.
C34432 2-[(2，4-二氯苄基)硫代]-6-羟基嘧啶-4-羧酸 33.
C34433 3-氨基-N-苄基丙酰胺 34.
C34434 2-羟基琥珀酰肼 35.
C34435 2-氨基-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸 36.
C34436 2-{[氰基(苯基)甲基]氨基}苯甲酰胺 37.
C34437 S-(2-亚氨基-2-{[2-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)乙基]氨基}乙基)硫代硫酸氢 38.
C34438 2-氨基-6-[(2-羟丙基)氨基]-5-硝基嘧啶-4-醇 39.
C34439 3-[2-氨基-6-(甲硫基)-9H-嘌呤-9-基]-5-(羟甲基)环戊-1，2-二醇 40.
C34440 2-(2-肼基-2-氧代乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯 通过共有磷酸化位点的全面分子建模描述了上述分子所要求的功能(Meggio F.，Pinna L.A.(2003)One-thousand-and-onesubstrates of protein kinase CK2. The FASEB J.17349-368)，它通过与CK2酶的分子结合得到证实，并且使用近120万种化合物，通过对我们实验室中产生的化学多样性数据库的大量分子筛选进行进一步分析。
本发明还包括所述化合物的任何同源变体。将与在此所述的那些化合物的化学性质类似或不同，但所具有的化学结构使得它们达到相同的作用连同对CK2介导的磷酸化的抑制作用的任何分子定义为同源变体。
在本发明的另一个，而优选的实施方案中，药物组合物包含一种或多种所述化合物，和/或其药学上可接受的盐，单独或连同其它药学上可接受的赋形剂或添加剂。而且，所述化合物在制备用于抑制体外、体内或在身体伴联装置中的肿瘤细胞增殖，用于治疗活的生物体中的癌症和/或其中CK2酶可具有病理学作用的其它病症的药物中的用途也是本发明的一部分。
所述化学分子通过它们抑制最小氨基酸序列S/T-X-X-E/D磷酸化的能力而限定，其中X是优选不同于赖氨酸或精氨酸的一些氨基酸，且此外其它蛋白质不具有这种共有序列，不与这种类型的化合物结合并且不具有它们抑制CK2介导的磷酸化的能力。
就所述化合物对本发明的限定而言，作者已经进行了对于该酶来说明确的共有磷酸化位点的全面分子建模(Meggio F.，Pinna L.A.(2003)One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.The FASEB J.17349-368)，其通过与CK2酶的分子结合得到确认，且通过在我们实验室中，使用近120万种化合物产生的化学多样性数据库的大量分子筛选进行进一步分析。
计算的结合能值高于平均值的所有化合物在第一轮中均被选择为正值，使用更具有限制性的选择值进行第二轮筛选，并进一步分析以了解结构规则性。优化在第二轮筛选中选择的化合物的化学结构，以获得计算的结合能的最高可能值。合成所得化合物，使用高效液相色谱纯化，通过红外光谱、质谱及核磁共振分析且最终评价它们在体外和体内的有效性。根据本发明，所述化合物抑制CK2介导的磷酸化事件的能力同样有效。
本发明所述化合物以剂量依赖性方式在人肿瘤细胞中引起细胞毒性，而无需借助于任何细胞渗透剂。该证据与先前的发现一致，表明化学分子能够被细胞机构转运，并达到它们的细胞内的靶(Meggio F，Pagano MA，等人(2004)Inhibition of protein kinase CK2 bycondensed polyphenolic derivatives.An in vitro and in vivostudy.Biochemistry.4312931-12936)。
同样，振奋人心的是在体外细胞毒性研究中发现这些化合物的IC50值处于毫摩尔范围。这些结果表明与先前报道的抑制CK2磷酸化功能域的环肽相比，所述化合物的细胞毒性提高。
与体外结果一致，当局部以及全身给药时，本发明的化合物具有潜在的抗肿瘤作用。同样，证明了本发明的化合物在低至0.5和2mg/Kg剂量下可发挥抗肿瘤作用，表示所述剂量较之先前所述环肽的剂量降低10-20倍。
附图简述

图1化合物在植入小鼠的人肿瘤模型中的抗肿瘤作用。
具体实施方案/实施例的详细描述 通过下列实施例解释本发明 实施例1通过in silico分子建模选择化合物 通过使用由大量实质上的筛选开发的计算模型，基于受体-配体复合物的计算的结合能的较高值(表1)选择了若干化合物。该近似能量值是考虑到使用在我们的实验室中研制的计算程序进行的构象和若干高能组分的全面分析来估算的。
表1受体-配体复合物计算的相互作用能量 实施例2所述化合物对典型CK2底物磷酸化的作用 该测定法包括进行体外磷酸化反应，其中使用来源于16型人乳头瘤病毒(VHP-16)的癌蛋白E7作为底物，其在大肠杆菌中作为谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达。然后通过谷胱甘肽-琼脂糖(Pharmacia)亲和性色谱纯化所得E7-GST。在酶促反应之前，37℃预温育E7-GST 1小时，其中使用不同浓度的化合物。该反应在由50μl TrisHCL 25mMpH 7.5缓冲液、1μCi 32P-γATP、100μM ATP、40μl含E7-GST的树脂、0.2M NaCl、10mM MgCl和1个单位的CK2酶(Promega)组成的混合物中进行，使其在37℃下进行40分钟。反应后，用0.5ml反应缓冲液洗涤树脂3次并最后在10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中分析E7-GST的磷酸化水平。磷酸化蛋白通过使X-射线敏感胶片与干燥的PAGE凝胶接触进行显现，且通过胶片的测光密度分析进行定量。IC50值使用各剂量-效应曲线估算。IC50值被认为是影响50％酶活性的抑制浓度。包括平行对照实验作为比较，在相同条件下，测定环肽P15，其先前报道为CK2底物磷酸化位点的抑制剂。
表2的数据表明在此所述的化合物是典型CK2底物的有效抑制剂，正如从IC50值判断的那样。值得注意的事实是注意到与先前报道的环肽相比，该化合物的最高抑制能力仅在微摩尔范围内有效。
表2对CK2典型底物的抑制作用 实施例3所述化合物对CK2共有位点磷酸化的作用 该测定法包括进行体外磷酸化反应，其中使用序列RRREEETEEE作为底物，其被普遍公认为CK2底物的最优化的共有磷酸化功能域。
在酶促反应之前，37℃预培养该底物肽1小时，其中使用不同浓度的化合物。该反应在由50μl TrisHCL 25mM pH7.5缓冲液、1μCi 32P-γATP、100μM ATP、40μl含E7-GST的树脂、0.2M NaCl、10mM MgCl和1个单位的CK2酶(Promega)组成的混合物中进行，使其在37℃下进行10分钟。反应后，将5μl反应混合物涂在Whatmann PE-81滤纸上并用10mM H3PO4洗涤四次，最后测量该滤纸关联放射性并使各样品的cpm值与CK2酶促活性直接联系起来。
使用各剂量-效应曲线估算IC50值。IC50值被认为是影响50％酶活性的抑制浓度。包括平行对照实验作为比较，在相同条件下，测定先前报道为CK2底物磷酸化位点抑制剂的环肽P15。
表3的数据表明在此所述的化合物是典型CK2底物的有效抑制剂，正如从IC50值判断的那样。值得注意的事实是注意到与先前报道的环肽相比，该化合物的最高抑制能力仅在微摩尔范围内有效。
表3对CK2最优化共有底物序列的抑制作用 实施例4在此所述的化合物对人肿瘤细胞的作用 将来源于人类非小细胞肺癌的H-125细胞接种在96孔平板(Costar)中，达到2×104个细胞/ml密度，使用Dulbecco(DMEM)培养基(Gibco)并补充了胎牛血清(Gibco)。24小时后，将在此所述的化合物加入到0.5-100nM范围的培养基中，在37℃，5％CO2条件下温育该混合物72小时，最后加入20μl 1.90mg/ml MTS溶液。使平板在相同温育条件下再保持1小时并读取492nm处的吸光度。结果以与没有任何化合物的对照组相比的生长百分比来评价，并使用各剂量-效应曲线估算IC50值。IC50值被认为是影响50％酶活性的抑制浓度。包括平行对照实验作为比较，在相同条件下，测定先前报道为CK2底物磷酸化位点抑制剂的环肽P15。
表4的数据表明在此所述的化合物对培养的人肿瘤细胞具有有效力的体外细胞毒性作用，正如从IC50值判断的那样。值得注意的事实是注意到与先前报道的环肽相比，该化合物的最高抑制能力仅在微摩尔范围内有效。
表4对培养的人肿瘤细胞的细胞毒性作用 实施例5本发明的化合物对植入裸鼠移植模型中的人肿瘤的抗肿瘤作用 将6-8周大的雌性BalbC裸鼠用于该测定法中。将肿瘤植入到该模型上时，将悬浮于250μl PBS中的5000000个H-125细胞注射到动物的背部区域。一旦肿瘤具有约50mm3的可触知体积，便直接每日给予200μg的化合物C32425、C33426和C33427，共5天。如图1所示，该化合物的给药导致显著的抗肿瘤反应。这样的结果表明抑制CK2介导的磷酸化的化合物能够在用于实验肿瘤学的相关模型中引起抗肿瘤反应。
权利要求
1.阻断酪蛋白激酶2(CK2)介导的磷酸化作用的化合物，其特征在于满足任何或若干下列要求
a.结合底物磷酸化位点，以直接或间接方式阻断CK2酶与底物结合，
b.以直接或间接方式阻断磷酸基团向磷酸受体丝氨酸转移，
c.结合CK2底物蛋白，引起磷酸化功能域，其邻域，或两者的构象改变，以直接或间接方式，按照a或b起作用。
2.根据权利要求1所述的化合物和它们的同源变体，其中化学结构是通过以连续方式结合的一些化学元素在分子任何部分中的出现而定义的，其具有指示的电子杂化且选自下列5个结构基团中的至少一个
I.N-[C(sp2)]1，2，3-N
II.N-[C(sp2)]1，2-[C(sp3)]1，2，3-N
III.N-[C(sp3)]1，2，3-N
IV.N-C(sp2)-[C(sp3)]1，2-C(sp2)-N
V.N-C(sp3)-[C(sp3)]1，2-C(sp3)-N
3.一种用于治疗其中CK2酶可具有病理学作用的疾病或病症，和/或与致瘤性过程有关的其它疾病或病症的药物组合物，包含一种或多种如权利要求1和2任何一项所定义的化合物，和/或它们药学上可接受的盐，以及其它药学上可接受的赋形剂或添加剂。
4.权利要求1或2任何一项所定义的化合物在制备用作抑制体外、体内或在身体伴联装置中的肿瘤细胞增殖，用于治疗活的生物体中的癌症和/或其中CK2酶可具有病理学作用的其它病症的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及通过insilico分子建模获得且所具有的结构可用于通过使所述化合物与酪蛋白激酶II底物中的磷酸化功能域或其环境相互作用而阻断磷酸化作用的化合物。本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物及其在制备用于治疗与致瘤性过程相关的疾病的药物中的用途。
文档编号C07F9/22GK101203522SQ200680021998
公开日2008年6月18日 申请日期2006年5月5日 优先权日2005年5月12日
发明者R·E·罗德里格斯费尔南德斯, R·薇拉阿尔瓦雷斯, A·德拉努埃斯弗乌莱斯, Y·马佐洛雷耶斯, S·E·佩莱亚罗德里格斯, B·E·阿塞韦多卡斯特罗, A·穆萨基奥拉萨, R·乌维塔戈麦斯 申请人:遗传工程与生物技术中心