从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3,4’,7-三羟基二氢黄酮醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3,4'，7-=径基二氨 黄酬醇的方法，属于天然药物领域。
【背景技术】
[0002] 漆树是中国重要的特用经济林，目前国内学者对漆树栽培、生漆涂料、漆酪、漆蜡 等方面进行了大量的研究。对漆树枝哑茎材中的主要活性成分，国内研究较少。韩国学者对 漆树的化学成分和生物活性进行了详细地研究，Park等采用多次硅胶柱层析从漆树木材中 分离得到硫黄菊素、漆黄素、黄颜木素、和3,4,3'，4'，7-五径基黄烧。Kim等采用XAD-2D、娃 胶柱和ODS反向硅胶柱对漆树木材的乙酸乙醋萃取部位进行分离，得到黄颜木素、没食子 酸和漆黄素。Kang等从漆树皮中分离得到具有抗病毒作用的黄颜木素、漆黄素、硫黄菊素和 紫馴花素四种黄酬化合物。黄酬的分离绝大多数采用硅胶柱层析，由于化合物在溶解性上 存在很大差异，根据相似相溶原理，采用极性较小的洗脱体系，如不同的石油酸或乙酸与乙 酸乙醋比例洗脱极性由小大到的化合物，再逐渐增加洗脱体系的极性，如氯仿与甲醇的不 同洗脱比例。但是一些极性与分子结构相似的化合物很难通过硅胶柱层析直接获取，往往 需要与其它的分离手段进行协同，如制备型高效液相色谱(Pre-HPLC)。Pre-HPLC具有准备 确度高，分离速度快，能够使用反相C18色谱柱，大大地提高了多酪类化合物的分离度，但是 其处理样品量较小。中低压分离色谱(MPLC)，具有上样量大，高效，快速等优点，是新型的分 离纯化技术，广泛应用于天然产物、食品、生物医药等领域。 我国是漆树的原产地，主要集中在陕西、四川、重庆、湖北、贵州、甘肃和云南屯个省，在 镇雄、大方、毕节、赫章、北川、恩施等60多个县建立了漆树产业化种植基地，种植面积达 100万hm2,栽种漆树达150,000万株。但是目前漆树的产业主要集中在天然生漆涂料的生 产及开发，在漆巧的利用方面也比较薄弱，另外在漆树生长、利用过程中，大量的枝哑茎材 未得到利用，为了扩大漆树产业的规模化，延伸漆树资源的产业链，因此开展漆树多酪中具 有抗氧化活性化合物的提取和制备研究，对于漆树资源的开发利用具有指导意义。
【发明内容】
[0003] 为实现上述目的，发明了从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3,4'， 7-=径基二氨黄酬醇的方法，其特征在于由W下步骤组成： 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mU，加入质量分数为50~95%的 乙醇或甲醇水溶液，减压回流提取2~3次，每次^化，过滤，滤液合并，于40~60°C下减压蒸发 除去溶剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~l:10(g:mL)加入蒸馈水，揽拌溶解，加入石油酸萃取^5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油酸萃取物；水层继续用乙酸乙醋萃取I~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙醋萃取物； 第=步 将乙酸乙醋萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm,柱直径4-20 cm,采用不同比例石油酸与乙酸乙醋进行洗脱，收集抗氧化活性较高的石油酸：乙酸乙醋体 积比为7:3-3:7(巾:巾)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含黄颜木素和3,4'，7-^径基二 氨黄酬醇的提取物； 第四步 将富含黄颜木素和3，4 '，7-=径基二氨黄酬醇的提取物与中低压色谱填料按质量比1: 15-50吸附，中压柱柱长20-80 cm,柱直径2-8 cm,采用不同比例的洗脱剂进行洗脱，柱压为 0.5-10 MPa,检测波长220-280 nm，流速3-50 mL/min，分别收集黄颜木素和3,4'，7-S径 基二氨黄酬醇部位，真空浓缩，回收溶剂，得到黄颜木素和3，4 '，7-=径基二氨黄酬醇样品， 将黄颜木素和3，4 '，7-=径基二氨黄酬醇进行HPLC分析，含量为95% W上； 第五步 将黄颜木素和3，4 '，7-S径基二氨黄酬醇进行体外抗氧化活性测试，黄颜木素清除 DPPH自由基的ICso值为19.54mg/L，清除ABTS自由基的ICso值为25.45mg/L，清除径自由基的 ICso值为52.97 mg/L，5~50mg/L黄颜木素的总还原力为0.175~1.108,铁离子还原力为53~ 260皿ol/L; 3，4'，7-S径基二氨黄酬醇清除DPPH自由基的IC50值为28.97mg/L，清除ABTS 自由基的ICso值为27.58mg/L，清除径自由基的IC50值为57.68 mg/L，5~50mg/L3，4'，7-S 径基二氨黄酬醇的总还原力为0.177~0.875，铁离子还原力为31~144皿ol/L。 本专利采用的中低压色谱填料为孔径为60 A，20-60 ym的ODS C18、C8和S邱hedex LH-20材料中的一种，洗脱剂为甲醇、乙醇和体积比0.5%-2%(v:v)的醋酸水中的一种或几种的 混合溶液。 本专利采用HPLC分析黄颜木素和3，4 '，7-S径基二氨黄酬醇的主要含量，其HPLC分析 条件为:4.6 X 250mm, 5皿的C18 Gold AQ反相柱，流动相为体积比为40:60(v:v)的甲 醇:体积比〇.5-l%(v/v)醋酸水溶液，紫外检测器，检测波长为280 nm,流速为ImL/min。 本方法中采用醇溶液进行提取，经过萃取，硅胶柱层析与中低压柱色谱分离得到黄颜 木素和3,4'，7-S径基二氨黄酬醇，并经过MS、IR、1H-NMR和13C-NMR进行证实，两者的结构 为。 本发明的有益效果： 本发明所提供的从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3,4'，7-=径基二氨 黄酬醇的方法，还具有W下特点： (1) 本发明采用负压提取方法，可W有效地防止具有抗氧化活性的黄酬化合物的分解， 大大地提局提取得率； (2) 本发明采用硅胶柱和中低压色谱制备，可W快速有效地得到黄颜木素和3,4'，7-= 径基二氨黄酬醇； (3) 本发明工艺操作简单，易实施，产品色浅，纯度高； (4) 漆树多酪提取物具有显著的抗氧化作用，能够用于多种由于氧化应激引起的疾病。
【附图说明】
[0004] 图1黄颜木素(a)和3,4'，7-S径基二氨黄酬醇(b)的HPLC色谱图； 图2黄颜木素和3,4'，7-S径基二氨黄酬醇对DPKl自由基的清除作用； 图3黄颜木素和3,4'，7-=径基二氨黄酬醇对ABTS自由基的清除作用； 图4黄颜木素和3,4'，7-=径基二氨黄酬醇对径自由基的清除作用。
【具体实施方式】
[0005] W下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。 实施例1 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mU，加入质量分数为50~95%的 乙醇水溶液，减压回流提取2~3次，每次1~化，过滤，滤液合并，于40~60°C下减压蒸发除去溶 剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~l:10(g:mL)加入蒸馈水，揽拌溶解，加入石油酸萃取^5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油酸萃取物；水层继续用乙酸乙醋萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙醋萃取物； 第=步 将乙酸乙醋萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm,柱直径4-20 cm,采用不同比例石油酸与乙酸乙醋进行洗脱，收集抗氧化活性较高的石油酸：乙酸乙醋体 积比为7:3-3:7(巾:巾)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含黄颜木素和3,4'，7-^径基二 氨黄酬醇的提取物； 第四步 将富含黄颜木素和3,4'，7-=径基二氨黄酬醇的提取物与中低压色谱填料60 A,20-60 ym的ODS C18按质量比1:15-50吸附，中压柱柱长20-80 cm,柱直径2-8 cm,采用体积比为 0.5:9.5~5:5的甲醇和体积比0.5%-2%(V: V)的醋酸水进行洗脱，柱压为0.5-10 MPa，检测 波长220皿，流速3-50 mL/min，分别收集黄颜木素和3,4'，7-S径基二氨黄