(2) 采用清除ABTS自由基的方法来评价将黄颜木素和3,4'，7-S径基二氨黄酬醇的抗氧化 功能。如附图3所示，其清除活性与化合物的浓度呈正相关，黄颜木素拟合的线性方程为Y= 1.605X+9.154，3，4 '，7-S径基二氨黄酬醇拟合的线性方程为Y=I. 394X+11.55，黄颜木素和 3,4'，7-S径基二氨黄酬醇的IC50值分别为25.45 mg/L和27.58 mg/L，运此化合物的IC50 值均高于￥。(28.38 111邑/1)。 实施例6径自由基清除作用 依次加入60化的5mmo 1/L邻菲罗嘟，4化L的pH7.4的憐酸缓冲溶液，6化L的5mmo 1 /L硫酸 亚铁，60化的15mmol/LEDTA，60化的蒸馈水，100化的样品溶液和80化的0.1%此〇2后摇匀，37 °(：水浴加热60 min后取出，于536nm处测其吸光度Ai。对径自由基的清除率的计算按公式 (3)。
式U) 式中:Ai为加样品的吸光值； Al为不加样品和也化的吸光值； Ao为不加样品的吸光值。 采用清除径自由基的方法来评价将黄颜木素和3，4'，7-=径基二氨黄酬醇的抗氧化功 能。如附图4所示，其清除活性与化合物的浓度呈正相关，黄颜木素拟合的线性方程为Y= 0.91X+1.798，3，4 '，7-S径基二氨黄酬醇拟合的线性方程为Y=O. 939X-4.166，黄颜木素和 3，4'，7-S径基二氨黄酬醇的清除能力较Vc弱，但显著高于BHT(P<0.05)，分别为52.97 mg/ L和57.68 mg/L。 实施例7总还原力 取200化不同浓度溶液，分别加入500化的0.2M的憐酸缓冲液(P册.6)和500化的1%的铁 氯化钟溶液，混合后，在50°C保溫放置20min，分别加入50化L的10%的S氯乙酸，于5000r/ min离屯、IOmin后，取上清液1血，加入500化的0.1%的氯化铁，混合均合，常溫静置IOmin，在 TOOnm处测吸光度。吸光度值越高，说明还原能力越强，抗氧化作用越强。 黄颜木素和3,4'，7-=径基二氨黄酬醇的总还原能力如表1所示。总还原能力与样品溶 液的浓度呈现依赖关系，样品的浓度增大时，吸光度增大。化合物的总还原能力依次大小为 BHT〉黄颜木素〉Vc> 3,4'，7-S径基二氨黄酬醇。 棄1末同、沈睛黄細女畫前9 7-二粒其^氨黄M瞄的6袜盾九
实施例8还原铁离子能力 FeS〇4标准曲线的绘制：准确配制FeS〇4标准溶液的浓度为25皿〇1/L、50皿ol/L、100y mol/L、200皿ol/L和400皿ol/L，在593nm下测定吸光值，绘制吸光度与浓度的标准曲线，并 拟合得到线性回归方程Y=0.00 641X-0.0 l，相关系数R=O. 999 5。 FRAP工作液的配制：25mL的0.3mol/L醋酸盐缓冲液，2.5mL的lOmmol/L 2,4,6-S化 晚基S嗦(TPTZ)溶液和2.5mL的20mmol/L FeCb溶液组成。 取10化L待测样品，加200化预热至37°C的FRAP工作液，摇匀后放置IOmin，于593nm测其 吸光度值(Ai值）。W无水乙醇代替样品加入FRAP工作液，摇匀后放置IOmin，于593nm测其吸 光度值(Ao值）。每个样品做3次平行试验，求平均值。根据反应后Ai-Ao值，在标准曲线上求得 相应FeS化的浓度(曲lol/L)，定义为FRAP值。 黄颜木素和3,4'，7-=径基二氨黄酬醇的总还原能力如表2所示。总还原能力与样品溶 液的浓度呈现依赖关系，样品的浓度增大时，吸光度增大。化合物的总还原能力依次大小为 Vc>黄颜木素〉3,4'，7-S径基二氨黄酬醇〉BHT。 击O不同、、/啦括共細令革壬no /1' 7_二軟甘
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【主权项】
1. 从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3,4'，7_三羟基二氢黄酮醇的方 法，其特征在于由以下步骤组成： 第一步 将漆树木粉，干燥去渣，按质量体积比为1:10~1:30(g:mL)，加入质量分数为50~95%的 乙醇或甲醇水溶液，减压回流提取2~3次，每次1~3h，过滤，滤液合并，于40~60°C下减压蒸发 除去溶剂，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按质量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸馏水，搅拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分离， 在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，得到石油醚萃取物；水层继续用乙酸乙酯萃取1~5次，分 离，在40~60°C下减压蒸发除去溶剂，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 将乙酸乙酯萃取物与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集抗氧化活性较高的石油醚：乙酸乙酯体 积比为7: 3-3: 7 (v: v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到富含黄颜木素和3，4 '，7-三羟基二 氢黄酮醇的提取物； 第四步 将富含黄颜木素和3,4'，7_三羟基二氢黄酮醇的提取物与中低压色谱填料按质量比1: 15-50吸附，中压柱柱长20-80 cm，柱直径2-8 cm，采用不同比例的洗脱剂进行洗脱，柱压为 0.5-10 MPa,检测波长220-280 nm，流速3-50 mL/min，分别收集黄颜木素和3,4'，7_三羟 基二氢黄酮醇部位，真空浓缩，回收溶剂，得到黄颜木素和3，4 '，7-三羟基二氢黄酮醇样品， 将黄颜木素和3，4 '，7-三羟基二氢黄酮醇进行HPLC分析，含量为95%以上； 第五步 将黄颜木素和3，4'，7-三羟基二氢黄酮醇进行体外抗氧化活性测试，黄颜木素清除 DPPH自由基的IC5Q值为19.54mg/L，清除ABTS自由基的IC5Q值为25.45mg/L，清除羟自由基的 IC5〇值为52.97 mg/L，5~50mg/L黄颜木素的总还原力为0.175~1.108,铁离子还原力为53~ 260 ymol/L; 3，4'，7-三羟基二氢黄酮醇清除DPPH自由基的IC50值为28.97mg/L，清除ABTS 自由基的IC5〇值为27 · 58mg/L，清除羟自由基的IC50值为57 · 68 mg/L，5~50mg/L3，4'，7-三 羟基二氢黄酮醇的总还原力为0.177~0.875，铁离子还原力为31~144 ymol/L。2. 根据权利要求所述的从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3，4'，7-三羟 基二氢黄酮醇的方法，其特征在于第四步中低压色谱填料为孔径为60 Α，20-60 μπι的ODS C18、C8和Sephedex LH-20材料中的一种，洗脱剂为甲醇、乙醇和体积比0.5%-2%(ν:ν)的醋 酸水中的一种或几种的混合溶液。3. 根据权利要求1所述的从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3,4'，7_三 羟基二氢黄酮醇的方法，其特征在于冊^：分析条件为 ：4.6\250臟，5以111的(：18 6〇1(1八0 反相柱，流动相为体积比为40:60(V:V)的甲醇:体积比0.5-1%(v/v)醋酸水溶液，紫外检测 器，检测波长为280 nm,流速为lmL/min〇
【专利摘要】本发明涉及从漆树木粉中提取具有抗氧化活性的黄颜木素和3,4’,7-三羟基二氢黄酮醇的方法，属于植物提取物和天然产物化学的开发和应用领域。以漆树木粉为原料、经过提取、萃取、硅胶柱色谱和中低压色谱得到95%以上的黄颜木素和3,4’,7-三羟基二氢黄酮醇。本发明从漆树中得到具有高效抗氧化活性的成分，在50mg/L浓度以上时，对DPPH、ABTS和羟自由基的清除率高于>95%以上。该制备过程快速简单，是开发潜在的天然抗氧化剂的良好来源，具有很好的商业前景。
【IPC分类】A61P39/06, C07D311/32, C07D311/40
【公开号】CN105669627
【申请号】CN201610154914
【发明人】王成章, 陈虹霞
【申请人】中国林业科学研究院林产化学工业研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月18日