具有抗肿瘤作用的化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化合物及其制备方法和应用，具体涉一种具有抗肿瘤活性的化合 物及其制备方法和应用，属于药物化学领域。
【背景技术】
[0002] 中国专利201110055102. X公开了抗癌先导化合物Τ-0Α，药效学实验表明，先导物 Τ-0Α能较显著抑制多种肿瘤细胞的体外增殖，而对正常细胞毒性较低；体内对S180小鼠肉 瘤的生长有显著抑制活性，并可提高荷瘤小鼠的脾指数，均呈剂量依赖关系。通过计算肿瘤 横截面积，可以清晰观察到肿瘤体积、肿瘤横截面积比明显缩小，而毒副作用又显著低于环 磷酰胺。对肿瘤凋亡NF-KB信号通路研究发现，Τ-0Α给药后可以显著降低肉瘤小鼠 P65、 C0X-2和VEGF的表达，并可抑制金属蛋白酶-2的活性；此外，Τ-0Α还可明显抑制鸡胚尿囊 膜新生血管增生，具有抗血管生成的作用。单日连续给予Τ-0Α最大耐受量6000mg · kg-1， 观察14天内，小鼠未出现毒性反应，优于环磷酰胺。
[0004] 本发明以具有抗肿瘤、抗肝病生物活性的齐墩果酸（0A)、甘草次酸（GA)、熊果酸 (UA)、白桦脂酸（BA)及天然药物川芎嗪（TMP)为起始原料，进行化学拼合合成本发明化合 物。对该类化合物的活性评价主要围绕抗肿瘤（尤其肝癌）及抗肝纤维化方面展开，分别 测试了类似物对5种癌症细胞系（Bel-7402、H印6-2、肌-29、他1&、86(：-823)及肝星状细胞 系（HSC-6)的细胞毒活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一种具有结构通式1的化合物。
[0006] 本发明的目的之二是提供一种具有结构通式2的化合物。
[0007] 本发明的目的之三是提供通式化合物1、2的制备方法。
[0008] 本发明的目的之四是提供通式化合物1、2在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0009] 本发明的目的之五是提供一种具有抗肿瘤作用的药物组合物。
[0010] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
[0011] 具有抗肿瘤作用的式1化合物，
[0012]
[0013] 其中，
[0014] R!选自=0、-OH、-0C0CH3、_CH3 中的一种；
[0015] R2 选自-Η、= 0、-OH、-CH3 中的一种；
[0016] R3、R4 选自-H、-CH3 中的一种；
[0017] R5、r6 选自-ch3、-X、-Y 中的一种；
[0018] 且R5、R6中至少有一个包含-X或-Y;
[0019] 上述-X、-Y结构式如下：
[0021] 具有抗肿瘤作用的式2化合物，
[0023] 其中，R为-X、-Y中的一种；
[0024] 上述-X、-Y结构式如下：
[0025]
[0026] 进一步，本发明化合物编号及结构式如下：
[0029] 本发明化合物按如下方法制备：
[0030] 化合物T0A-X1的制备方法：将3-氧代齐墩果酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在缩 合剂、催化剂及碱性条件下生成T0A-X1 ;
[0031] 化合物T0A-X2的制备方法：将齐墩果酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在缩合剂、 催化剂及碱性条件下生成T0A-X2 ;
[0032] 化合物T0A-X3的制备方法：将3-乙酰齐墩果酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在缩 合剂、催化剂及碱性条件下生成T0A-X3 ;
[0033] 化合物T0A-X4的制备方法：将熊果酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在缩合剂、催 化剂及碱性条件下生成T0A-X4 ;
[0034] 化合物T0A-X5的制备方法：将3-氧代甘草次酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在缩 合剂、催化剂及碱性条件下生成T0A-X5 ;
[0035] 化合物T0A-X6的制备方法：将甘草次酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在缩合剂、 催化剂及碱性条件下生成T0A-X6 ;
[0036] 化合物T0A-X7的制备方法：将3-乙酰甘草次酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在缩 合剂、催化剂及碱性条件下生成T0A-X7 ;
[0037] 化合物T0A-X8和T0A-X9的制备方法：将白桦脂酸溶于有机溶剂，与氨基川芎嗪在 缩合剂、催化剂及碱性条件下生成T0A-X8和T0A-X9 ;
[0038] 其中，上述反应在_20°C至250°C下进行；所述有机溶剂是含有1-20个碳原子 的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；所述催化剂 为1-羟基苯并三唑（Η0ΒΤ);所述缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲胺丙基）碳二亚胺盐酸盐 (EDCI)或1，3_二环己基碳二亚胺（DCC);此外，所用碱中，有机碱为三乙胺，无机碱为碳酸 钾。
[0039] 进一步，上述制备方法中，相应的原料与氨基川芎嗪的摩尔比为1 : 0. 1~ 1 : 10;相应的原料与缩合剂的摩尔比为1 : 0.1~1 : 10;相应的原料与碱的摩尔此为 1 : 0.1~1 : 10;相应的原料与催化剂的摩尔比为1 : 0.1~1 : 10。
[0040] 上述方法中步骤（1)、（2)、（3)、（4)、（5)、（6)、（7)、（8)的反应式为：
[0041]
[0042] 本发明还提供式1、2化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0043] 进一步，所述肿瘤为肝癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌细胞系。
[0044] 本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，该组合物包含式1或式2化合物和药 学上可接受的载体。所述药物组合物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射剂等 常规剂型。
[0045] 本发明化合物具有明显抑制肿瘤细胞系（Bel-7402、！fepG-2、HT-29、Hela、 BGC-823)及肝星状细胞系（HSC-6)生长的活性。其中，化合物T0A-X9的抗肿瘤活性优于阳 性药Τ-0Α及顺钼，化合物T0A-X1的细胞毒活性与Τ-0Α相当。
[0046] 实验例MTT法观察本发明组合物Τ0Α-Χ对癌细胞及肝星状细胞的增殖影响
[0047] 1.仪器与材料
[0048] Thermo3111型C02培养箱；HFsafe生物安全柜；Multiskan G0酶标仪；京立牌 LD5-2B型台式低速离心机；Olympus 1X71倒置荧光显微镜改良型RPMI-1640培养基、胎牛 血清、0. 25%胰蛋白酶溶液、噻唑蓝、磷酸盐缓冲液（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公 司）；Amresco 二甲基亚讽（DMS0);
[0049] 人肝癌细胞系Bel-7402和Η印G-2 ;人胃癌细胞系BCG-823 ;人结肠癌细胞系 ΗΤ-29 ;人宫颈癌细胞系Hela ;大鼠肝星状细胞系HSC-6 ;
[0050] 实验药物：本发明化合物T0A-X1~T0A-X9 (分别按实施例8-15制备）；反应原料 齐墩果酸（0A)、甘草次酸（GA)、熊果酸（UA)、白桦脂酸（BA)及川芎嗪（TMP);阳性药物注射 用顺钼（301001CF ;齐鲁制药有限公司）；T-〇A(按201110055102. X号中国专利制备）。
[0051] 2.方法
[0052] 2· 1不同细胞株的培养
[0053] Bel-7402、！fepG-2、HT-29、BCG-823、Hela、HSC-6 细胞培养在含 10%胎牛血清的 1640培养液中，放置于37°C、5 %的C02培养箱中温育。细胞均呈贴壁状态生长，在倒置显 微镜下观察生长状况，待细胞数量适量时传代培养。
[0054] 2. 2初筛细胞抑制率
[0055] 取对数生长期的 Bel-7402、!fepG-2、HT-29、BCG-823、Hela、HSC-6 细胞，以 3X 103/ 孔的数量接种于96孔培养板中，在含5% C02的湿化培养箱中37°C培养24h。每孔分别加 入100 μ L待测化合物，使每孔浓度分别为15 μ Μ和30 μ M。设置细胞对照组及空白对照组， 药物组每浓度重复3孔，细胞对照组和空白对照组重复3孔。培养箱中继续培养72h后，每 孔加20 μ L MTT孵育4h，弃去上清，再加100 μ L DMS0,振荡lOmin，酶标仪490nm波长测得 吸光度值并记录结果，抑制率/%= [1_(A给药-A空白V(A正常-A空白）]X100%。将 30 μ Μ浓度下，抑制率大于50%的化合物进行复筛并计算IC5。值。
[0056] 2. 3复筛细胞抑制率
[0057] 操作方法如 2. 2 项，取对数生长期的 Bel-7402、！fepG-2、HT-29、BCG-823、Hela、 HSC-6细胞，以3X 103/孔的数量接种于96孔培养板中，在含5% C02的湿化培养箱中37°C 培养24h ;每孔分别加入100 μ L待测化合物，使最终浓度分别为150、50、16. 67、5. 56、1. 85、 0. 62 μ Μ。设置细胞对照组及空白对照组，药物组每浓度重复4孔，细胞对照组和空白对照 组重复3孔。培养箱中继续培养72h后，每孔加20 μ L ΜΤΤ孵育4h，弃去上清，再加100 μ L DMS0,振荡lOmin，酶标仪490nm波长测得吸光度值，记录结果，并计算化合物的IC5。值，细 胞抑制率（％ ) = [1-(A给药-A空白V(A正常-A空白）]X100%。
[0058] 3.结果
[0059] 3. 1本发明化合物8-16和反应原料0A、GA、UA、BA及TMP对5种肿瘤细胞系 (Bel-7402、!fepG-2、HT-29、BCG-823、Hela)的 IC5。值如表 1 所示。
[0060] 由表1可以看出，化合物T0A-X1、T0A-X9及熊果酸各种癌细胞均表现出较好的抑 制肿瘤细胞增殖活性；且与Τ-0Α及反应原料相比，化合物T0A-X9表现出更强的体外抗肿瘤 活性，甚至优于顺钼；化合物T0A-X1与阳性药Τ-0Α活性相当。
[0061] 化合物T0A-X2、T0A-X4对宫颈癌细胞的增殖具有抑制作用，化合物T0A-X3、 T0A-X5对结肠癌细胞的增殖具有抑制作用，化合物T0A-X8对肝癌细胞和结肠癌细胞增殖 具有抑制作用。
[0062] 表1不同药物对不同肿瘤细胞株的IC5。值
[0064] 注明："一"表明IC5。> 30.0μΜ，当IC5。> 30.0μΜ时，我们认为其活性较低； "勵"：未能测出1(：5。值。
[0065] 3. 2本发明化合物对肝星状细胞HSC-6的增殖抑制率如表2所示。化合物 Τ0Α-Χ1~Τ0Α-Χ3、Τ0Α-Χ9、Τ-0Α以及熊果酸表现出较好的体外抗肝纤维化活性。现有研究 表明，熊果酸体内外对肝星状细胞均具有良好的抑制作用。而化合物T0A-X9比T-OA及原 料表现出更强的体外抑制肝星状细胞的活性，甚至优于熊果酸。
[0066] 表2不同药物对肝星状细胞HSC-6的抑制率及IC5。值
[0068] 注明："一"表明IC5。> 30. 0 μ M，当IC5。> 30. 0 μ Μ时，我们认为其活性较低；已 有研究表明熊果酸在体内外实验中均表现出较好的抑制HSC-6细胞增殖的活性，故在本实 验中将其作为阳性对照组。
[0069] 4.结论
[0070] 本发明化合物表现出抑制肿瘤细胞系（Bel-7402、Η印G-2、HT-29、Hela、BGC-823) 及肝星状细胞系（HSC-6)增殖的活性。其中，化合物T0A-X9的活性优于阳性药顺钼及T-OA ; T0A-X1的活性与Τ-0Α相当。表明该类化合物可用于抗肿瘤药物的研究。
【具体实施方式】
[0071] 实施例1化合物2-溴代甲基-3, 5,6-三甲基吡嗪（化合物1)的制备
[0072] 按"《中间体2-溴甲基-3, 5,6-三甲基吡嗪的合成工艺优化》.绪扩，王鹏龙，韩秋 俊，等·安徽医药，2013,17 (9) : 1467-1470"方法制备。称取20. 00g(0. 15mol)无水川芎嗪、 23.54g NBS N-溴代丁二酰亚胺（0· 15mol，用前研细）置于250mL三颈瓶，100mL CC14作为 反应溶剂，4盏85W白炽灯照射，95°C回流反应lh。TLC[V(石油醚）：V(丙酮）=3 : 1] 检测反应基本完全；冷却后滤过，收集滤液，减压回收溶剂，得紫红色粘稠状液体（含量按 60%计）。HRMS (ESI)m/z :216. 00135 [M+H]+，calcd. for CsHnBrN2216. 00851。
[0073] 实施例2化合物N-(3, 5,6-三甲基吡嗪-2-亚甲基）异吲哚-1，3-二酮（化合物 2)的制备
[0074]