一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其制备和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于药用蛋白技术领域，具体而言，涉及一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合 蛋白及其制备和应用。
【背景技术】：
[0002] 临床常用的抗肿瘤药物以化疗药物为主，但由于其具有选择性低、副作用大等缺 点，其应用受到诸多限制;靶向抗肿瘤药物由于其选择性高、毒副作用小，在肿瘤靶向治疗 方面取得了巨大的成就，但依然存在不少问题，影响了临床治疗效果，如靶向效率低、易产 生肿瘤的耐药性、免疫反应等安全性问题。因此，继续寻找更加安全高效的抗肿瘤靶向药 物，是抗肿瘤药物研发需要解决的重要课题。
[0003] 巨胞饮(macropinocytosis)是一种高度保守的内吞形式，指在某些因素刺激下， 细胞膜皱褶形成大且不规则的原始巨胞饮体，其直径一般为〇.5_3μπι，比蛋白包被的内吞作 用的囊泡平均尺寸大30倍。它为快速高效地内吞细胞外营养物质和液相大分子提供了一条 有效途径。巨胞饮在肿瘤细胞中广泛存在，是癌细胞推动自身增值和生长的重要营养物质 传递途径，正常细胞不存在或存在较少。Ras、Src等一些致癌基因的突变均可以激活巨胞 饮，大部分的肺癌、结肠癌及超过90 %的胰腺癌为KRAS突变型。研究表明，Ras癌细胞尤其依 赖于巨胞饮维持生长和生存，它利用巨胞饮过程，吞噬白蛋白（albumin)，并随后利用其生 成生长必需氨基酸的机制，来满足其特殊营养需求。阻断巨胞饮摄取白蛋白途径，肿瘤即停 止生长。因此，有效地利用巨胞饮这一独特肿瘤细胞"进食机制"作为治疗靶点，设计抗肿瘤 药物，可以提高药物的选择性和输送效率。
[0004] 人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基 化的蛋白质，分子量大约为68kDa，是血液中含量最高的蛋白，无免疫原性，人体相容性好， 所以选择白蛋白作为药物传输载体具有较多优点；另外，巨胞饮是白蛋白进入肿瘤细胞的 主要途径，一些肿瘤细胞巨胞饮明显增强，并以白蛋白为主要营养来源，为其提供生长必 需氨基酸。所以，可以利用白蛋白作为靶向巨胞饮的药物输送载体。
[0005]防御素(defensins)是一类富含半胱氨酸，含有β片层折叠结构的阳离子小分子多 肽，分子量为4. OkDa-5. OkDa，通过6个或8个半胱氨酸残基形成3个或4个分子内二硫键维持 其β片层结构的稳定性。防御素广泛存在于哺乳动物、昆虫及植物体内，是一种具有抗菌、抗 病毒及抗肿瘤活性的天然抗微生物肽。人的防御素 (human defensin)是由粒细胞和上皮细 胞产生的，从遗传学上分为α-防御素和β-防御素家族。它们在天然免疫方面主要表现为杀 死病原微生物和带有包膜的病毒，而在获得性免疫方面，主要表现作为化学诱导剂和激活 免疫细胞。它是机体天然免疫系统的重要组成部分，具有很强的抗菌、抗病毒及肿瘤细胞毒 作用，其作用机制较为相似，都是通过细胞裂解的作用。防御素作为一种天然抗肿瘤活性多 肽与传统的化疗药相比，具有不良反应小，不易产生耐药性等优点。研究表明，人防御素可 以作为一种新的治疗癌症的抗肿瘤分子。
[0006] 人邱方御素 2(Human beta defensin 2，HBD2)属于人邱方御素家族具有代表性的成 员之一，对肿瘤细胞的毒性是以细胞裂解为主，伴有少量的细胞凋亡。新的研究表明，在一 些癌细胞中，HBD-2可以作为肿瘤的抑癌基因，如诱导口腔鳞癌细胞中HBD2的高表达，能够 有效抑制人口腔鳞癌细胞株SAS的增值和侵袭，对A431和M-HeLa肿瘤细胞株的生存活力和 增殖能力有很大影响。另外，HBD2可趋化未成熟的树突状细胞和记忆性T细胞，增强免疫系 统对肿瘤抗原的识别，也可促进体内免疫因子的分泌活化，从而增进机体对肿瘤细胞的免 疫监视，在肿瘤免疫中发挥一定的作用。在小鼠结肠癌细胞CT26移植瘤模型中，HBD2基因治 疗可以介导特异性抗肿瘤免疫，增强局部的抗肿瘤作用。表明，HBD2在肿瘤免疫治疗方面成 为有前景的应用分子。
[0007] 基于上述，本发明制备一类融合蛋白，是由人防御素，包括α-防御素和β-防御素家 族、连接肽、人血清白蛋白组成。本发明具体选择防御素家族中有代表性的人β防御素2 (HBD2)作为杀伤肿瘤细胞的"弹头"分子，有巨胞饮靶向性的白蛋白作为药物的输送载体， 研制得到防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白HBD2-HSA(defensin integrated albumin, DIA)。所述融合蛋白具有巨胞饮靶向性、防御素杀伤肿瘤细胞的功能、无免疫原性和不易产 生耐药性特征，迄今尚未见有国内外的相关报道。
【发明内容】
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[0008] 本发明的目的之一是，提供一类靶向巨胞饮的防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白。
[0009] 本发明的目的之二是，提供了所述融合蛋白的制备方法。
[0010] 本发明的目的之三是，提供防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白及其药物组合物在 肿瘤治疗中的用途。
[0011]研究表明，防御素作为一种阳离子多肽，其活性明显受到白蛋白的影响，随着白蛋 白浓度的增高其活性逐渐丧失，由于血液中白蛋白含量较高，这一特点限制了防御素作为 治疗药物在体内的应用；另一方面，由于防御素本身对表达宿主有毒害作用，多以无活性形 式表达或者不表达，限制了其生产应用。本发明，将防御素与白蛋白融合在一起，旨在利用 白蛋白被肿瘤细胞巨胞饮大量内吞的特点，将防御素带入癌细胞内发挥作用。白蛋白作为 癌细胞的供能对象，会很快降解，而防御素含有三对二硫键，且分子量较小，比较稳定，有希 望在肿瘤细胞内攻击其细胞器。这一设计，不仅获得了 DIA的宿主高表达，降低了制备难度， 且提高了防御素的靶向性，其对正常细胞的毒性大大降低，另外还为防御素作为杀伤肿瘤 细胞的"弹头"分子提供了一种新探索。本发明通过基因工程技术构建基于HSA，同时融合了 HBD2( defens in integrated albumin，DIA)的重组载体，并通过毕赤酵母分泌表达系统制 备目的蛋白，经纯化及相关的活性评价，获得一种抗肿瘤融合蛋白，有效避免原核表达系统 中包涵体复性的不利因素，更好地确保其生物学活性。
[0012]本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，其中，所述的人β防御素2(HBD2)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共41个氨基酸;所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列，共585个氨基酸。此外，人邱方御素2(HBD2)与HSA之间的连接肽，共10个氨基酸，具 有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
[0013]所述融合蛋白具有以下结构排列：防御素 HBD2-连接肽(G4S) 2-人血清白蛋白HSA， 或HSA-(G4S)2-HBD2;所述蛋白具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，或者相应的HSA(SEQ ID N0:2)-(G4S)2(SEQ ID N0:3)-HBD2 (SEQ ID N0:1)氨基酸序列。
[0014]所述融合蛋白的编码基因，具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列，或相应于编码HSA (SEQ ID N0:2)-(G4S)2(SEQ ID N0:3)-HBD2(SEQ ID N0:1)氨基酸序列的核苷酸序列。 [0015]其中，所述融合蛋白的防御素不限于人邱方御素 HBD2,包括所有的人α防御素和人β 防御素，本发明选择比较有代表性的人防御素 HBD2。
[0016] 本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法。所述方法是，将一类防御素如HBD2,通 过连接肽，如(G4S)2以及HSA基因序列，加入合适的酶切位点以及利于蛋白纯化的标签序 列，插入到合适的表达载体，获得重组表达载体，电转化至感受态细胞，获得含有目的基因 序列的表达菌株，表达菌株经培养、诱导表达，收取培养液，进行蛋白纯化，获得目的融合蛋 白。
[0017] 另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物，所述组合物系以本发明提供的 上述融合蛋白为活性成分。
[0018] 再一方面，本发明提供了所述融合蛋白及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 优选地，所述抗肿瘤药物用于治疗或预防人胰腺癌、肺癌或肝癌。
[0019] 综上所述，本发明通过基因工程技术构建一种新型蛋白，既含有能够靶向巨胞饮 的白蛋白HSA，又含有杀伤肿瘤细胞活性的防御素 HBD2。目前，尚未见有利用白蛋白作为靶 向巨胞饮药物输送载体的相关报道。
[0020] 本发明的优点在于，所述防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白，能够较好地保留防御素 的生物学功能，而且防御素 HBD2和白蛋白HSA均属于人体内天然存在的成分，具有无免疫原 性，应用安全的特点。此外，防御素-白蛋白新型抗肿瘤融合蛋白DIA，对人胰腺癌MIA PaCa2 裸鼠移植瘤的治疗效果显著，靶向性较好。因此，所述药物显示出较好的应用前景。
【附图说明】：
[0021] 图I-DIA基因结构示意图
[0022]图2-DIA蛋白表达、鉴定及纯度检测
[0023]其中：图A为不同酵母菌株蛋白表达电泳图谱（1:蛋白分子量标准，2-9:分别为不 同菌株的蛋白分泌情况）；
[0024] 图B为DIA纯度的SDS-PAGE检测结果；
[0025]图C为DIA的Western Blot检测结果。
[0026]图3-共聚焦方法检测胰腺癌肿瘤细胞通过巨胞饮对DIA的摄取情况 [0027]其中:A油镜显示巨胞饮摄取DIA的实验；
[0028] B定量分析EIPA对MIAPaCa-2细胞摄取DIA的抑制作用；Control:MIAPaCa-2细胞 摄取DIA或HSA量
[0029] C两种胰腺癌细胞MIA PaCa-2细胞和BxPC-3中的巨胞饮摄取DIA的定量结果。
[0030] 图4-DIA对不同肿瘤细胞的增值抑制作用
[0031] 其中：A-D分别为DIA对肿瘤细胞MIA ?&0&-2、81?(：-3、!1460^549的增值抑制作用； [0032] E为DIA对正常细