斑马鱼防御素defbl3的优化基因及其重组蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种密码子经过优化的基因，尤其涉及按照毕赤酵母偏爱密码子对斑 马鱼防御素 defbl3基因进行改造后的优化基因，以及其编码的重组蛋白的制备方法，属于 基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 综观国内养殖业，海水和淡水养殖区大多分布于沿海港湾和河口附近水域，这些 水域也是沿海陆源污染物和海上排污的主要受纳场所。据统计，我国每年直接入海的废 水量高达80亿吨，富含营养物质、病原微生物和有机农药的农业污水也随地表流进沿海水 体，致使水体水质恶化。这样的养殖环境污染导致水产养殖生物的抵抗力大大降低，目前针 对这种情况采取的主要措施是给水产生物过量服用抗生素，其直接后果就是微生物耐药性 增加、水产品质量和安全问题日渐突出，并导致我国水产品出口遭受技术性贸易壁皇。据 此，开发无微生物耐药问题、能够替代或部分替代抗生素的绿色饲料添加剂对于水产生物 的养殖安全和水产食品安全来讲刻不容缓。
[0003] 抗菌肽是由生物细胞特定基因编码的一类具有抗菌免疫功能的小分子多肽，其抗 菌谱广、不容易产生耐药性、分子量小而耐热性好，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了 重要作用，被认为是抗生素替代品的最佳候选者，因此，极具开发应用前景。目前对于抗菌 肽的研究应用比较成熟的是昆虫来源的抗菌肽，它们的应用领域主要是畜禽养殖业。相比 之下，对于水产生物来源抗菌肽的研究报道很少，更谈不上应用。水产生物因其栖息的水域 环境比其他生物复杂而更易遭遇病原微生物的侵染，它们的机体必须拥有比其他生物更强 的免疫系统才能适应这种复杂的生存环境，而这种特殊的免疫系统得益于它们机体中多种 抗菌肽的适时表达。因此，水产生物来源的抗菌肽是水产养殖中饲用抗生素替代品的最佳 候选者。
[0004] 防御素是一类可杀死细菌、真菌或者病毒等微生物并有抗肿瘤活性的多肽，是抗 菌肽家族的重要成员。关于防御素基因工程制备的研究报道主要集中在人类来源和畜禽来 源的防御素，目前已经有人α -防御素5、人α -防御素2、猪β -防御素2等在毕赤酵母中 表达的报道或专利。近几年随着对鱼类功能性基因的研究，逐渐发现了一些鱼类来源的防 御素基因，如团头鲂β-防御素、虹鳟鱼β-防御素、红鳍东方飩β-防御素等。鱼类来源 的β -防御素是一类富含精氨酸和半胱氨酸的碱性小分子肽，大部分含6个半胱氨酸残基， 可形成3对二硫键以维持其稳定性。迄今为止，采用基因工程技术制备鱼类来源防御素的 研究报道和专利很少，即便有，几乎都是通过RT-PCR或从cDNA文库获得编码抗菌肽的天然 cDNA，金俊琰等（金俊琰，周莉，桂建芳。石斑鱼β -防御素的酵母表达及其产物抗菌活性 分析，水生生物学报，2011，35 (5) :739-743)从石斑鱼cDNA文库获得编码β -防御素的天 然cDNA，在酵母菌中表达了重组β -防御素成熟肽，具有一定体外抑菌活性，但表达量非 常低。张涓（团头鲂β -防御素基因的克隆、重组表达及抗菌活性研究。华中农业大学 硕士学位论文，2014年6月，条形码Y2567756)通过RT-PCR从团头鲂中克隆到天然的编码 β -防御素的cDNA，实现了在毕赤酵母中的表达，表达上清的体外抑菌活性测定结果显示 具有一定的活性，但SDS-PAGE电泳始终未能获得表达产物重组蛋白的条带，他们分析认为 可能是表达量非常低以致无法检测到。除了 β -防御素，还有关于鱼类来源其他抗菌肽的 酵母表达研究的一些报道，如汪玉华等（汪玉华，敖敬群，陈新华。大黄鱼抗菌肽hepcidin 在巴斯德毕赤酵母中的表达及其产物的抑菌活性，应用海洋学学报，2013, 32 (3) :383-389) 从cDNA文库获得编码hepcidin的天然cDNA，在毕赤酵母中表达了重组hepcidin，表达产 物显示了一定的抑菌活性，但他们并未提供纯化的重组hepcidin的实验结果，其原因可能 就是表达产量过低不易纯化所致。迄今为止，报道的鱼类抗菌肽的重组表达较少，一般在 实验室水平进行的鱼类抗菌肽在酵母中的表达研究方面，因为目的蛋白的表达量很低或 拿不到纯品，都不太提及具体的表达量。对于其他来源的抗菌肽，虽然有文献报道了其具 体的表达量，但是表达也不理想。例如蔡晶晶等（蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克 坚。黑鲷抗菌肽h印cidin在毕赤酵母中的表达，厦门大学学报，2009,48 (5) :738-743)在 毕赤酵母中表达黑鲷抗菌肽hepcidin，其表达量在120h达到最高为I. lmg/L。Feng-Iiang Jin 等人(Feng-liang Jin，Xiao_xia Xu,Xiao-qiang Yu,Shun-xiang Ren.Expression and characterization of antimicrobial peptide CecropinAD in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Process Biochemistry 2009;44:11-16)利用密码子优化后的基 因在毕赤酵母中表达家绳和天蚕抗菌肽，他们从100ml培养液中得到I. 8mg纯肽（即表达 量约 18mg/L) 〇 Vasiliki Koliaraki 等人（Vasiliki Koliaraki, Martha Marinou, Martina Samiotaki, George Panayotou, Kostas Pantopoulos, Avgi Mamalaki. Iron regulatory and bactericidal properties of human recombinant hepcidin expressed in Pichia pastoris. Biochimie 2008 ;90:726-735)在毕赤酵母中表达得到人hepcidin，其在培养液 中的表达量为5-7mg/L。
[0005]目前，很多文献报道了蛋白质的异源表达，表达量在原始菌株基础上得到了很大 的提高，特别是利用毕赤酵母异源分泌表达蛋白质，具有高细胞密度发酵，蛋白质可分泌 到胞外表达且杂蛋白少；遗传和表达稳定性好等诸多优点（Macauley-Patrick S, Fazenda M, McNeil B, et al. , Heterologous protein production using the Pichiapastoris expression system, Yeast, 2005, 22:249-270)。但毕赤酵母作为一种异源蛋白质表达宿 主，对于外源基因的表达具有相当的局限性，提高外源基因在毕赤酵母中的表达量通常 有密码子优化、mRNA二级结构改造、GC含量调整等策略。密码子优化是一种重要的高效 重组表达手段，它是根据宿主的密码子偏爱性优化异源基因的密码子以提高重组蛋白表 达效率，这在一些原核生物和真核生物中均有报道。研究结果认为密码子优化提高了翻 译效率从而提高了蛋白表达水平，进一步的研究发现密码子优化能够提高异源基因在真 菌中的转录活性即 mRNA 水平。HugoG Menzella(HugoG Menzella. Comparision of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Menzella Microbial Cell Factories, 2011，10:15)对小牛前凝乳酶 (calf prochymosin)基因进行密码子的优化，其采用的随机密码子优化策略获得了 5条 优化序列。在大肠杆菌中的表达结果表明，经随机密码子策略优化后的序列的表达水平都 较原始序列有明显提高，其中一条优化序列更是提高了 70%。Jiangke Yang等（Jiangke Yang, Liying Liu. Codon optimization through a two-step gene synthesis leads to a high-level expression of Aspergillusniger lip2gene in Pichiapastoris. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic