专利名称：斑马鱼卵黄蛋白原－1基因调控序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生命科学领域。涉及斑马鱼卵黄蛋白原-1(vitellogenin1，vtg1)基因表达的某段调控序列。利用转基因斑马鱼实验，证明该序列在斑马鱼体内具有启动子活性，能够在雌激素诱导下，启动下游基因在肝脏特异性表达。
背景技术：
卵黄蛋白原(vitellogenin，vtg)是三种卵黄蛋白的前体，特异地存在于成熟卵生雌性动物血液中，为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和硫等营养和功能性物质。斑马鱼的vtg分为7种亚型，vtg1-vtg7，生理情况下主要只在成熟雌鱼肝脏表达；受到水体中各种环境雌激素作用后，雄鱼和幼鱼会从无到有地表达vtg。其中vtg1的mRNA表达水平比其他亚型高得多(100-1000倍)。近年来，斑马鱼体内vtg1的表达成为筛选和检测环境雌激素的重要指标[Marin MG，et al.Mar Pollut Bull.2004 May；48(9-10)835-9]。
检测斑马鱼vtg1表达水平的方法通常为RT-PCR，ELISA，Western-blot。这些方法需要提取RNA或蛋白质，实验时必须将斑马鱼杀死，采用昂贵的试剂(酶或抗体)，进行繁杂的实验，结果是静态的，不能在活体直接观察到[Nilsen BM，etal.Anal Bioanal Chem.2004 Feb；378(3)621-33]。随着斑马鱼转基因技术的逐渐成熟，构建一种能直接反映vtg1表达情况的转基因斑马鱼成为研究热点之一，如转基因斑马鱼将应该能够表达某种报告基因，如绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)，并且EGFP的表达和vtg1的表达一致。通过荧光显微镜用肉眼直接观察EGFP的绿色荧光，就可得知vtg1的表达情况，从而判断水体中是否存在雌激素活性物质。这种转基因斑马鱼具有其他方法所无法比拟的优势可直接在活体进行观察，方法十分简便，不需要专业人员，不需要任何试剂，所需要的仅仅是一台普通的荧光显微镜。故，检验成本会明显低廉，易于普及应用，尤其在许多并不具备实验条件的地区，这种转基因鱼将成为人们的“环保哨兵”。
要构建上述转基因鱼，首先必须获得调控斑马鱼vtg1表达的启动子序列，利用所获序列调控EGFP的表达。斑马鱼vtg1的cDNA和蛋白序列属已知序列，但调控其表达的启动子DNA序列尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供具有启动子活性的斑马鱼卵黄蛋白原-1(vitellogenin1，vtg1)基因调控序列，尤其是zfvtg1-1.7的DNA序列(zebrafish vitellogenin 1-1.7)。利用所获序列调控EGFP的表达，达到检测环境雌激素的目的。
本发明提供了序列1的模式生物斑卵黄蛋白原-1基因上游的一段具有表达调控作用的DNA序列，由1720个核苷酸组成，命名为zfvtg1-1.7(zebrafishvitellogenin 1-1.7)。
本发明采用已知的斑马鱼vtg1的cDNA和蛋白序列，用上述zfvtg1-1.7序列建立转基因斑马鱼，通过RT-PCR和原位杂交技术证实了zfvtg1-1.7在斑马鱼体内具有下述启动子活性1)受到雌激素诱导；2)肝脏特异性。
本发明首先在Trust Sanger Institude斑马鱼数据库中查找vtg1基因，并向上游追溯可能的启动子序列，设计引物扩增斑马鱼基因组DNA，得到一段1720bp的DNA序列。
本发明将所获的序列与增强的绿色荧光蛋白基因(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)连接，得到融合基因zfvtg1-1.7-EGFP。按照《zebrafishbook》中所描述，将zfvtg1-1.7-EGFP整合到斑马鱼基因组中，构建转基因斑马鱼。用原位杂交和RT-PCR的方法，证明了转基因斑马鱼EGFP的表达和vtg1的表达在时间和空间上一致，证实了zfvtg1-1.7的启动子活性。
采用本发明提供的zfvtg1-1.7序列与报告基因(荧光蛋白)连接，可以在转基因斑马鱼的活体内观察荧光，从而快速直观地反映vtg1的表达。而vtg1的表达是反映雌激素活性的重要指标，因此，可以通过观察鱼体的荧光来判断水体中是否存在雌激素样物质。
本发明为构建检测雌激素水平的荧光斑马鱼奠定了基础，对保护人类自身安全和健康繁衍具有积极意义。
图1肝脏中绿色荧光蛋白和vtg1的共表达(5dpf)。
图中均为5天大小的斑马鱼，红色箭头所指分别为肝脏中绿色荧光蛋白(A、B、C)和vtg1(D、E、F)的表达，其中，A、D转基因斑马鱼在含有100ng/L 17α-炔雌醇的系统水中养殖5天，B、E转基因斑马鱼在含有等体积溶剂-0.001％乙醇的系统水中养殖5天，C、F野生型斑马鱼。
具体实施例方式
实施例1 获得zfvtg1-1.7的DNA序列1.斑马鱼的养殖野生型斑马鱼(Danio rerio)购自国际斑马鱼资源中心，斑马鱼养殖系统从美国Aquatic Habitats公司引进，喂养方案按照Zebrafish Book描述进行。
2.提取斑马鱼基因组DNA采用美国promega公司的基因组DNA提取试剂盒提取斑马鱼基因组DNA。
3.引物设计根据Trust Sanger Institude斑马鱼数据库预测的vtg1基因(IDENSDARG00000016825)设计了序列2、序列3的引物，并引入HindIII和BamHI酶切位点P15′-GCTGCAAGCTTACTAATAGGAAGCCAACGAAGGACC-3′(序列2)P25’-CTCGGATCCGCTACAGTCAAGGCAAGCACAACAGC-3’ (序列3)所述引物由上海赛百盛生物技术公司合成。
4.克隆zfvtg1-1.7序列Zfvtg1-1.7序列的克隆按照《分子克隆实验指南》的方法进行。
(1)从基因组中扩增zfvtg1-1.7序列取上述提取的斑马鱼基因组DNA，用引物P1，P2进行PCR扩增，反应体系如下灭菌去离子水 32μL10×PCR缓冲液 5μLdNTP(2.5mM each) 8μLP11μLP21μL基因组DNA 2μL
Takara LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)1μL总体积 50μL反应条件94℃5分钟，(94℃1分钟，62℃1分钟，72℃2分钟)×30循环，72℃7分钟。
取PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，分析产物片断的大小。并用美国promega公司的核酸纯化试剂盒纯化上述PCR产物。
(2)构建zfvtg1-1.7-EGFP重组质粒纯化后的PCR产物用HindIII和BamHI双酶切，与同样双酶切的的pEGFP-1载体连接，反应体系如下pEGFP-11μLPCR产物4μLSolI(含连接酶) 5μL16℃连接3小时，转化大肠杆菌感受态DH5α，抽提质粒酶切鉴定，送上海基康生物技术公司测序。该重组质粒命名为zfvtg1-1.7-EGFP。
所述pEGFP-1载体购自Clontech公司；限制性内切酶购自NEB公司；快速连接试剂盒购自TaKaRa公司；DH5α菌株由本室保存。
实施例2 zfvtg1-1.7-EGFP启动子活性的鉴定(EGFP和vtg1的时空表达一致)1.构建zfvtg1-1.7-EGFP转基因斑马鱼2.斑马鱼的养殖，转基因技术和荧光观察方法参照《Zebrafish Book》。
(1)斑马鱼养殖野生型斑马鱼(Danio rerio)购自国际斑马鱼资源中心，斑马鱼养殖系统从美国Aquatic Habitats公司引进，喂养方案按照《Zebrafish Book》描述进行。
(2)转基因用限制性内切酶bgl II线性化重组质粒，纯化后溶于含酚红的磷酸盐缓冲液，浓度为50ng/μL。当受精卵发育到一至二个细胞阶段，在解剖镜下进行转基因操作，每受精卵转入外源基因量为100pg(2nL)。
(3)荧光观察转基因操作后的受精卵分三组空白组，溶剂组，EE2处理组(100ng/L)，每组800个卵。28℃恒温培养，定期在荧光显微镜下观察荧光表达情况。
(4)RT-PCR和PCR鉴定EGFP的表达和在基因组中的整合分别取转基因后观察到荧光的鱼和未观察到荧光的鱼(5dpf，每组15条)，按说明书用Trizol(Invitrogen)一步法提取总RNA。逆转录以1ug总RNA为模板，10mmol/L的oligodT 1ul，70℃，5min；冰上加10×缓冲液2ul，25mmol/L的dNTP4ul，M-MLV(Invitrogen)1ul(200U)，42℃，60min，95℃，5min，逆转录为cDNA。按Krovel AV和Islinger M等的文献[Aquat Toxicol.2003 Jan24；62(2)85-103；Biol Reprod.2002 Jun；66(6)1881-92]设计引物EGFP P1(5’-ACCACATGAAGCAGCACGACT-3’)，EGFP P2(5’-CTTCTCGTTGGGGTCTTTGC-3’)；vtg1 P1(5’-GCT GCT GCA TCTGTC AAT GT-3’)，vtg1 P2(5’-CTG CTG CTG CTTTCA GAA GA-3’)。
以1u逆转录产物为模板，PCR扩增检测EGFP基因和vtg1基因；同时以pEGFP-1质粒为模板作阳性对照。反应条件如下94℃预变性5min，每循环包括94℃变性40sec，55℃复性30sec，72℃延伸40sec，共28个循环，最后1个循环结束后再72℃延伸7min。扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳分析。
待观察到荧光的鱼长至成熟后，提取基因组DNA(promega DNA提取试剂盒)，PCR鉴定EGFP的基因组整合，引物为上述EGFP P1和EGFP P2，同时以质粒pEGFP-1为模板作为阳性对照，以野生型鱼基因组DNA为模板作为阴性对照。反应条件为94℃预变性5min，每循环包括94℃变性40sec，55℃复性40sec，72℃延伸1min，共28个循环，最后1个循环结束后再72℃延伸7min。扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2.原位杂交检测转基因鱼EGFP和vtg1的表达(1)重组质粒pGEMTzfvtg1的制备取上述实验所扩增出来的vtg1cDNA片段(801bp)，与promega公司的pGEM-T载体重组，反应体系如下2×连接酶缓冲液5μLpGEM-T(50ng) 1μLPCR产物3μL
T4 DNA连接酶 1μL4℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态DH5α，抽提质粒测序，该重组质粒命名为pGEMTzfvtg1。
(2)探针标记用限制性内切酶NcoI使pGEMTzfvtg1充分线性化，反应步骤如下反应体系pGEMTzfvtg1(1μg/μL)30μL10×反应缓冲液 10μLNcoI(10U/μL)8μL水 52μL总体积 100μL37℃反应过夜。
线性化的pGEMTzfvtg1采用promega公司的核酸纯化试剂盒纯化，具体步骤按说明书进行。
采用线性化的pGEMTzfvtg1为模板，用地高辛标记的NTP进行RNA探针标记。反应体系如下10×SP6 RNA聚合酶缓冲液 2μLDTT(50mM) 2μL地高辛标记NTP混合物(每种2.5mM)4μLRNA酶抑制剂(40U/μL) 0.5μLpGEMTzfvtg1(0.5μg/μL) 1μLSP6 RNA聚合酶(50U/μL)1μL无RNA酶水 9.5μL37℃反应2小时。
加入2μL(2U/μL)的DNA酶，37℃孵育30分钟。
加入2ul乙二胺四乙酸二钠(pH8.0，0.2mol/L)，2.5ul氯化锂(4mol/L)，75ul无水乙醇零下20摄氏度过夜。4℃12000转/分钟离心30分钟，去上清，用50ul的无RNA酶的水溶解。变性琼脂糖凝胶电泳观察探针的质量。最后加入450ul的杂交缓冲液，备用。
(3)幼鱼的处理和固定幼鱼从胚胎发育第一天开始分组处理溶剂(0.001％乙醇)，100ng/L EE2，每24小时换液。生长到第五天时，分组收集幼鱼。用0.5毫升PBST洗涤两次。加入4％的多聚甲醛0.5毫升，室温静置5分钟，去多聚甲醛。再加入0.5毫升4％多聚甲醛室温静置5分钟，再置于4℃ 12-15小时。去多聚甲醛，用PBST 0.5毫升洗涤一次。再用甲醇洗涤三次，最后加入0.5毫升甲醇冻存于零下20摄氏度。
(4)杂交(1)用表1所示的溶液和时间使固定的胚胎重新水化表1
(2)在PBST中用细针头去掉绒毛膜；(3)在室温用25μg/ml的蛋白酶K消化胚胎30分钟；(4)室温用4％的多聚甲醛重新固定胚胎20分钟；(5)用0.5ml的PBST洗5次，每次5分钟；(6)在300μL杂交液中65℃预杂交2小时，杂交完毕前30分钟用杂交液1/20稀释探针置于65℃预热30分钟；(7)去除预杂交液换成含有探针的杂交液，在65℃杂交过夜；(8)去除杂交液，用表2溶液在65℃洗涤。溶液要在65℃预热30分钟，每种溶液洗涤时间为10分钟。
表2
(9)用0.5毫升0.2×SSC在65℃洗两次，每次30分钟；(10)用表3溶液洗涤
表3
(11)在PBST中加入2mg/ml的BSA和5％的绵羊血清作为封闭液，4℃封闭胚胎1-3小时；(12)用封闭液1/2000稀释碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，使胚胎在此抗体溶液中4℃过夜；(13)用含有2mg/ml的PBST洗八次，每次15分钟；(14)用含有100mM Tris pH＝9.5、100mM的氯化钠、50mM的氯化镁和0.1％土温-20溶液平衡胚胎；(15)加入碱性磷酸酶显色液室温显色30分钟至1小时，观察结果。
本发明所采用的杂交相关试剂购自Roche诊断试剂公司。
实验结果表明，在含有100ng/L的17α-炔雌醇的系统水中，生长到第五天的转基因斑马鱼肝脏出现明显的绿色荧光，肝脏同时表达vtg1；而系统水中如果不含有17α-炔雌醇，转基因斑马鱼的肝脏不出现荧光，也没有vtg1的表达。因此zfvtg1-1.7启动的EGFP表达和vtg1的表达在时空上是一致的，而且均受到雌激素(17α-炔雌醇)的调控。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>斑马鱼卵黄蛋白原-1基因调控序列<130>Fudan-20050619<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1720<212>DNA<213>斑马鱼(Danio rerio)<220>
<221>promoter<222>(1)..(1720)<400>1actaatagga agccaacgaa ggactttaag caatgtgcaa ccaactggtt aaaagccttg60cagctgcatt cagcacaact tgcaatcaat ctacagatga ctatttagac aagtgtacag120aacattaaat agtccaaccg tgaagagata aaggaatgac aagcatctcc atcttttctt180atgaaaccat atttctagtt tttgcaatat tcctaagatg gaaaacactt gcaaacacag240attaaaacat agaactttat caaagatgac atccatattt ctgtttccac tgcaatttaa300gggtgacaga tacaaaaata ctcaatctct gggatgacat tataaaaatg caaaaatcta360catctcagtt ttgtcaggat taagttgaaa attgtcagcc atccatttgt taatggtgac420taaacaatcc tgcaagaact gtaagaaaag tacaatagca tatcatcagc atagcaatga480taagacacaa atttaaagct gctagtattg ttgcttagag aaagtgtata caaatgaaac540agaagagagc ctagcacaga aacttgaggc acgcacagga cagaggaaca gagtctgaca600
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1.斑马鱼卵黄蛋白原-1基因调控序列，其特征是具有序列1的序列，命名为zfvtg1-1.7。
2.按权利要求1所述的斑马鱼卵黄蛋白原-1基因调控序列，其特征是所述调控序列是通过设计引物扩增斑马鱼基因组DNA，得到1720bp的DNA序列，所述引物具有序列1和序列2的序列。
3.一种重组质粒，其特征是含有权利要求1中所述的调控序列和增强的绿色荧光蛋白基因，命名为zfvtg1-1.7-EGFP。
4.权利要求1或2的斑马鱼卵黄蛋白原-1基因调控序列在制备检测环境雌激素制剂中的用途。
5.权利要求3的重组质粒在制备检测环境雌激素制剂中的用途。
全文摘要
本发明属于生命科学领域。提供了序列1的斑马鱼卵黄蛋白原－1(vitellogenin1，vtg1)基因表达的调控序列。本发明利用转基因斑马鱼实验，证明该序列在斑马鱼体内具有启动子活性，能够在雌激素诱导下，启动下游基因在肝脏特异性表达。采用本发明提供的zfvtg1－1.7序列与报告基因(荧光蛋白)连接，可以在转基因斑马鱼的活体内观察荧光，从而快速直观地反映vtg1的表达。可以通过观察鱼体的荧光判断水体中是否存在雌激素样物质。本发明为构建检测雌激素水平的荧光斑马鱼奠定了基础。
文档编号C12N15/63GK1904048SQ20051002815
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月26日 优先权日2005年7月26日
发明者宋后燕, 陈浩, 杨健 申请人:复旦大学