专利名称：一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法
技术领域：
本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质或多肽药物领域，更具体的，本发明涉及大肠杆菌外分泌表达生产溶葡萄球菌酶的方法。
背景技术：
溶葡萄球菌酶于1964年由Schindler和Schuhard首次在Staphylococcussimulans菌的培养物中发现(美国专利，专利号为3,278,378；1966年)，分子量为27kDa，含246个氨基酸。其作用机制是裂解葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸五肽键桥，进而破坏细胞壁的完整性并溶解菌体，是一种肽链内切酶。在80年代国内外就已经通过分子克隆方法将溶葡萄球菌酶的基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及球形芽孢杆菌等细菌中进行表达。由于其独特的杀菌机制，因此在较低的药物浓度下能很快地裂解葡萄球菌细胞壁，抗菌作用快、抗菌活性强、不易诱导耐药株、抗菌谱专一。目前国内外已经能大规模生产高纯度的重组溶葡萄球菌酶，且已商品化，较为广泛地用于细菌学、消毒学、酶学研究，以及临床抗菌治疗等方面。
由于Staphylococus Simulans产酶少且本身属于病原菌范围以及分子生物学技术的发展，在1987年美国的Recsei等通过分子克隆方法将溶葡萄球菌酶基因在大肠杆菌JM105、枯草芽孢杆菌及球形芽孢杆菌中进行表达。在大肠杆菌JM105中溶葡萄球菌酶的表达量为3ug/ml，其中65％在上清、15％在周质、20％在胞内。1990年获得了专利，专利号为4931390；内容为将1.5kbDNA编码的溶葡球菌酶片段插入载体pUC8、pBC16、pBD64、pSPV1形成重组质粒pRG5、pjp1、pDF8、pRP1。prg5转化大肠杆菌JM105。pjp1、pDF8、pRP1转化大量芽孢杆菌(枯草杆菌BD170、球形芽孢杆菌00)，产生的溶葡球菌酶经免疫、电泳与S.Simulans产生的溶葡球菌酶进行鉴定，而且球形芽孢杆菌转化子产生的溶葡球菌酶(150mg/L)是S.simulans的5倍。该专利也提供了1.5kbDNA序列，该DNA序列编码了389个氨基酸的前溶葡球菌酶前体蛋白，翻译后被加工成成熟的溶葡球菌酶。近年来发现，该酶的N末端是不均一的，大部分比野生型的少2个丙氨酸。
1996年德国的WALTER P.HAMMES等将删除了前体的溶葡萄球菌酶基因在Meat Lactobacilli(一种乳酸菌)进行表达。其删除前体的目的是为了能在MeatLactobacilli中稳定的表达。专利号EP0759473；1997年，但该方法仍属于是胞内表达。
1999年年印度生物技术国际有限公司申请了重组成熟溶葡萄球菌酶的表达专利，专利号WO 01/29201。其方法为删除了溶葡萄球菌酶的前体以及信号肽部分，直接在重组成熟溶葡萄球菌酶基因前加上起始密码子ATG(编码第一个氨基酸甲硫氨酸)并克隆入pET11b的T7启动子之后，其表达需要通过IPTG诱导表达。该发明将溶葡萄球菌酶在大肠杆菌中是以包涵体形式表达，所表达的溶葡萄球菌酶以不溶解的包涵体的形式贮存在细胞当中，必须将细胞破碎后，才能将其分离出来，分离过程中要用蛋白质变性剂，最后还要再把蛋白质复性，复性过程中有许多分子会错接形成结构异常的分子，同时，菌体残余蛋白是基因工程药物生产过程中不易清除的物质，容易影响产品质量。
目前国外没能实现溶葡萄球菌酶基因在大肠杆菌中的高效外分泌表达，外分泌表达的优点在于表达产物以最终的活性形式存在于培养基中，无包涵体复性等步骤；从培养上清中纯化较简单，回收率高；宿主菌蛋白污染少。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，以克服现有技术的不足。
本发明的发明构思是这样的从60年代发现溶葡萄球菌酶至今，由于该酶对金黄色葡萄球菌特别是耐药性金黄色葡萄球菌的杀菌效果非常好，国内外一直都在对它进行人药用研究，并尝试申报新药。但是，由于重组溶葡萄球菌酶一直是通过球形芽孢杆菌表达，但该工程菌目前在药品中还没有得到允许使用，目前能作为人用药品的表达宿主菌主要为大肠杆菌和酵母菌，因而世界各国的研究人员为了申请新药都在试图解决这一难题。
多年来国内外一直尝试用大肠杆菌进行表达，但都表达未果。1997年德国科学家及2003年美国科学家曾经用乳酸杆菌代替球形芽孢杆菌来表达溶葡萄球菌酶，但乳酸杆菌也未批准在药品中使用，新药申报也遇到了困难，而且乳酸杆菌表达也是胞内可溶性表达且成本较高。
印度科学家将溶葡萄球菌酶在大肠杆菌中是以包涵体形式表达，所表达的溶葡萄球菌酶以不溶解的包涵体的形式贮存在细胞当中，必须将细胞破碎后，才能将其分离出来，分离过程中要用蛋白质变性剂，最后还要再把蛋白质复性，复性过程中有许多分子会错接形成结构异常的分子，同时，菌体残余蛋白是基因工程药物生产过程中不易清除的物质，容易影响产品质量。
所以目前国外在人药用溶葡萄球菌酶表达体系的研究方面一直未见突破性的进展，在产业化和申报新药方面也碰到相同的难题。因此如果能实现溶葡萄球菌酶基因在大肠杆菌中的外分泌表达，将能大大加快申报具有我国自主知识产权的一类新药的进程，并产生巨大的经济和社会效益。
本发明试图在成熟溶葡萄球菌酶的编码序列前，插入一段可在大肠杆菌中分泌表达的信号肽序列，完成成熟溶葡萄球菌酶在大肠杆菌胞外分泌表达。目前现有公开的技术中还没有关于不经过溶葡萄球菌酶原形式并在大肠杆菌中外分泌表达溶葡萄球菌酶的报道。
本发明的技术方案是这样的本发明提供了一种大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，包括如下步骤(1)表达载体的构建包括将编码信号肽的序列克隆于部分或全部成熟溶葡萄球菌酶的基因序列前，并与启动子相连；(2)转化大肠杆菌，使其含有步骤(1)所构建的载体，培养发酵；
(3)从发酵液上清液中分离溶葡萄球菌酶。
其中的溶葡萄球菌酶为与野生型溶葡萄球菌酶序列一致的，也包括其突变体，如N末端少两个丙氨酸的。
其中的信号肽为phoA、OmpA、pelB中的一种。
步骤(2)中溶葡萄球菌酶的表达为诱导表达。
所述及的载体是大肠杆菌表达用载体，可以是pUC系列、pET系列或pGEX系列中的一种，也可以是pBV220。
启动子可以是是T7启动子、PlPr启动子或lacUV5启动子中的一种。
具体步骤是，首先合成一对合适的引物，再以Staphylococus Simulans(NRRLB-2628)的总DNA为模板，利用pyrobest酶(一种高保真的DNA聚合酶)，通过PCR方法对溶葡萄球菌酶的序列进行选择性扩增。通过在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳来检测和回收扩增产物，纯化回收后的扩增产物用NdeI和HindIII进行酶切。将酶切过的片段用T 4DNA连接酶与同样用NdeI和HindIII酶切过的载体在16℃连接2小时，即连入载体的核糖体结合位点之后，连接液再转化大肠杆菌，便得到重组质粒。
重组质粒通过DNA自动测序仪测序，经过序列比较证实获得的DNA序列与已知的编码信号肽和成熟溶葡萄球菌酶的基因序列完全一致。
将重组质粒转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，接入50ml LB液体培养基(含有30mg/ml卡那霉素)37℃振荡培养，培养至光密度值(波长600nm)为0.6时，然后加入IPTG到终浓度为0.05mM诱导蛋白表达，继续培养3小时，发酵液离心，上清用比色法测定溶葡萄球菌酶活性。
本发明所提供的溶葡萄球菌酶大肠杆菌高效外分泌表达的方法，优点在于表达产物以最终的成熟溶葡萄球菌酶活性形式存在于培养基中，无包涵体复性等步骤；从培养上清中纯化较简单，宿主菌蛋白污染少；回收率高，表达量可以达到200-400mg/L，回收率大于60％。
图1为从Staphylococus Simulans(NRRL B-2628)的总DNA中PCR扩增出来的成熟溶葡萄球菌酶基因，泳道1Staphylococus Simulans(NRRL B-2628)的总DNA为模板，SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2为一对引物而得到的扩增产物的条带，大小为887bp。
泳道M蛋白分子量Marker；图2为重组溶葡萄球菌酶分泌表达载体的构建；图3为纯化后的溶葡萄球菌酶SDS-PAGE电泳；泳道1初纯样品泳道2-3二纯样品泳道4精纯样品泳道M蛋白分子量Marker图4为纯化后的溶葡萄球菌酶非还原SDS-PAGE电泳以及Western blot分析；泳道ASDS-PAGE泳道BWestern blot泳道M蛋白分子量Marker；图5为纯化后的溶葡萄球菌酶经MALDI-TOF测定分子量为26927Da具体实施方式
实施例1重组溶葡萄球菌酶分泌表达载体的构建，即OmpA信号肽和成熟溶葡萄球菌酶融合基因的克隆。
首先设计并合成如下寡核苷酸序列SEQ.ID.NO1 5′-TACATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCAGGTTTCGCTACCGTCGCTCAGGCTGCTGCAACACATGAACATTCAGCAC-3′SEQ.ID.NO2 5′-CCAAAGCTTCAACTTTAGGAATGAG-3′在设计的SEQ.ID.NO1中，5’端加上了NdeI限制性核酸内切酶位点(斜体部分)的基因序列，以及编码OmpA信号肽的基因序列(带下划线部分)；
在设计的SEQ.ID.NO2中，5’端加上了HindIII限制性核酸内切酶位点(斜体部分)的基因序列。
以Staphylococus Simulans(NRRL B-2628)的总DNA为模板，以SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2为一对引物，利用pyrobest酶(一种高保真的DNA聚合酶)，通过PCR方法对溶葡萄球菌酶的序列进行选择性扩增。通过在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳来检测和回收扩增产物，如图1所示，M表示分子量标记的泳道，泳道1表示以Staphylococus Simulans(NRRL B-2628)的总DNA为模板，SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2为一对引物而得到的扩增产物的条带，大小为887bp。
纯化回收后的扩增产物用NdeI和HindIII进行酶切。将酶切过的片段用T4DNA连接酶与同样用NdeI和HindIII酶切过的pET30a载体在16℃连接2小时，即连入pET30a载体的核糖体结合位点之后，如图2，连接液再转化大肠杆菌DH5a，便得到重组质粒pET-OmpAlss。
重组质粒通过DNA自动测序仪测序，经过序列比较证实获得的DNA序列与已知的编码OmpA信号肽和成熟溶葡萄球菌酶的基因序列完全一致。
构建的重组质粒pET-OmpAlss编码OmpA信号肽的氨基酸序列如下SEQ.ID.NO3MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ A构建的重组质粒pET-OmpAlss编码成熟溶葡萄球菌酶的氨基酸序列如下SEQ.ID.NO4AATHEHSAQW LNNYKKGYGY GPYPLGINGG MHYGVDFFMNIGTPVKAISS GKIVEAGWSN YGGGNQIGLI ENDGVHRQWY MHLSKYNVKVGDYVKAGQII GWSGSTGYST APHLHFQRMV NSFSNSTAQD PMPFLKSAGYGKAGGTVTPT PNTGWKTNKY GTLYKSESAS FTPNTDIITR TTGPFRSMPQSGVLKAGQTI HYDEVMKQDG HVWVGYTGNS GQRIYLPVRTWNKSTNTLGV LWGTIK实施例2重组溶葡萄球菌酶的分泌表达工程菌的建立将重组质粒pET-OmpAlss分别转化大肠杆菌TOP10、JM109(DE3)、BL21(DE3)。挑取阳性克隆，接入50mlLB液体培养基(含有30mg/ml卡那霉素)37℃振荡培养，培养至光密度值(波长600nm)为0.6时，然后加入IPTG到终浓度为0.05mM诱导蛋白表达，继续培养3小时，发酵液离心，上清用比色法测定溶葡萄球菌酶活性。
实施例3 比色法测定溶葡萄球菌酶活性用比色法测定实施例2中的含重组质粒pET-OmpAlss的TOP10、JM109(DE3)、BL21(DE3)的溶葡萄球菌酶表达活性，具体测定方法如下1原理溶葡萄球菌酶的定量检测用比色法，以偶联KNR艳蓝染料的金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖(KNR-PG)为色源底物，根据酶作用过程中定量地释放的带有KNR染料基团的小分子可溶性片段产物，在除去未反应的不溶性底物后，对上清液进行比色测定，以求知酶的活性。此法简便易行，灵敏直观。
2仪器与试剂2.1仪器2.1.1紫外-可见分光光度计或酶标仪；2.1.2高速冷冻台式离心机；2.1.3电子天平；2.1.4电热恒温水浴锅；2.1.5 10ul、20ul、200ul、1000ul移液枪及配套枪头；2.1.6旋涡混合仪。
2.2试剂2.2.1溶葡萄球菌酶工作参考品，本公司制备；2.2.2色源底物KNR-PG，本公司制备，用0.2mol/L Gly-NaOH缓冲液(pH10.0)以1∶5(m/v)比例均匀悬浮，备用；2.2.3甘氨酸、氢氧化钠均为分析纯，配制成0.2mol/L Gly-NaOH缓冲液备用(pH10.0)；2.2.4 Tris，配制成0.05mol/L Tris-HCl缓冲液备用(pH7.5)；2.2.5 95％乙醇，分析纯。
3试验步骤3.1溶葡萄球菌酶工作参考品溶液的制备溶葡萄球菌酶工作参考品经过标定后，贮存于-20℃，使用前取出一支，精确加入1.0ml 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)溶解，配制成90.0U/ml的溶葡萄球菌酶参考品溶液，立即分装于数个Eppendorf管，每管50ul，立即置于-30℃以下冰箱中保存，使用前取出1支，加入450ul 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)稀释成9.0U/ml的参考品溶液。每次试验用1支，避免反复冻融。
3.2标准曲线的制备取洁净干燥的Eppendorf管6只，标号，按表1顺序每管中加入对应量的溶葡萄球菌酶参考品溶液，再加入不同量的0.2mol/L Gly-NaOH缓冲液。
然后按序号加入色源底物KNR-PG 130ul，每管加入底物后迅速在旋涡混合仪上混匀。
将加好上述溶液的Eppendorf管迅速移入37℃的恒温水浴锅中定时反应20min。
从水浴中取出Eppendorf管，按序号加入300ul 95％乙醇终止反应，并于10000rpm离心10min，离心结束后，取上清液于595nm处，以0号管为空白测定吸光度。
根据测得的吸光度值及相对应的参考品浓度C(U/ml)，求得线性回归曲线A＝KC+B其中K为标准曲线的斜率，B为截距，A为吸光度，C为浓度(U/ml)。
表1标准曲线制备
3.3样品的测定待测样品的测定方法同标准曲线，样品用0.05mol/l Tris-HCl稀释液(pH7.5)预稀释后，取50ul用于测定，每个样品作2个平行管，结果取平均值。
4结果计算计算公式C0＝N×C测×0.9/0.05其中C测为样品测定值(U/ml)，N为样品稀释倍数，C0为原样品活性(U/ml)，0.9为反应体系体积(ml)，0.05为样品加入体积(ml)。
5结果含重组质粒pET-OmpAlss的TOPl0、JMl09(DE3)、BL21(DE3)的溶葡萄球菌酶表达活性分别为56U/ml、45U/ml、70U/ml。
实施例5重组溶葡萄球菌酶的鉴定将含重组质粒pET-OmpAlss的TOPl0接入50mlLB液体培养基(含有30mg/ml卡那霉素)37℃振荡培养16小时，再转接于3升的LB培养基(含有30mg/ml卡那霉素)中，37℃振荡培养5小时，加入IPTG到终浓度为0.05mM，继续培养3小时，诱导蛋白表达；发酵液经离心、阳离子纯化、疏水层析、凝胶过滤，制得纯度大于95％的溶葡萄球菌酶83mg，比活性为1103U/mg，与Sigma的溶葡萄球菌酶的比活性具有可比性。
纯化后的溶葡萄球菌酶进行SDS-PAGE电泳以及western blot，如图3和图4，其中泳道1～4分别是发酵上清液、阳离子纯化后样品、疏水层析后样品、凝胶过滤后样品，泳道5为Sigma的溶葡萄球菌酶样品，泳道M为低分子量Marker。泳道6～9为western blot。
纯化后的溶葡萄球菌酶经MALDI-TOF测定分子量为26927Da(如图5)与理论分子量26924Da非常接近，也与Sigma的溶葡萄球菌酶的分子量269l2Da接近。
纯化后的溶葡萄球菌酶经N末端氨基酸残基测定N端15个氨基酸测序结果与天然的溶葡萄球菌酶完全一致，为AATHEHSAQWLNNYK。
序列表<110>上海高科联合生物技术研发有限公司<120>一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法<130>
<160>4<170>PatentIn Version2.1<210>1<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig-peptide mat_peptide<400>1tacatatgaa aaagacagct atcgcgattg cagtggcact ggcaggtttc gctaccgtcg 60ctcaggctgc tgcaacacat gaacattcag cac 93<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>3′UTP<400>2ccaaagcttc aactttagga atgag 25<210>3<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>3Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe5 10 15Ala Thr Val Ala Gln Ala20
<210>4<211>246<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>4Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys5 10 15Lys Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly20 25 30Met His Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val35 40 45Lys Ala Ile Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser Asn50 55 60Tyr Gly Gly Gly Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val65 70 75His Arg Gln Trp Tyr Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val80 85 90Gly Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser95 100 105Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro His Leu His Phe Gln Arg Met Val110 115 120Asn Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu125 130 135Lys Ser Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly Gly Thr Val Thr Pro Thr140 145 150Pro Asn Thr Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr Gly Thr Leu Tyr Lys155 160 165Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp Ile Ile Thr Arg170 175 180Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys185 190 195Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln Asp Gly200 205 210His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile Tyr215 220 225Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val230 235 240Leu Trp Gly Thr Ile Lys24权利要求
1.一种大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)表达载体的构建包括将编码信号肽的DNA序列克隆于部分或全部成熟溶葡萄球菌酶的基因序列前，并与启动子相连；(2)转化大肠杆菌，使其含有步骤(1)所构建的载体，培养发酵；(3)从发酵液上清液中分离溶葡萄球菌酶。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，所述及的溶葡萄球菌酶还包括其突变体。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，步骤(1)中的信号肽为phoA、OmpA或pelB中的一种。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，步骤(2)中溶葡萄球菌酶的表达为诱导表达。
5.根据权利要求1至4任一所述的大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，所述及的载体是大肠杆菌表达用载体。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，所述及的大肠杆菌表达用载体是pUC系列、pET系列或pGEX中的一种。
7.根据权利要求5所述的大肠杆菌外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，所述及的大肠杆菌表达用载体是pBV220。
全文摘要
本发明提供一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，包括将适合在大肠杆菌中分泌表达的编码信号肽的序列克隆于部分或全部成熟溶葡萄球菌酶的基因序列前，并与启动子相连，构建表达载体；将表达载体转化大肠杆菌，培养发酵；从发酵液上清液中分离溶葡萄球菌酶。外分泌表达的优点在于表达产物以最终的活性形式存在于培养基中，无包涵体复性等步骤；从培养上清中纯化较简单，回收率高；宿主菌蛋白污染少。
文档编号C12N1/21GK1900290SQ200510028038
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者黄青山, 陆海荣, 陆婉英 申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司