检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种基于HRM技术检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因blaz 用的引物；本发明还设及一种包括上述引物的双重巧光PC检测试剂盒，本发明还设及一种 采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因blaz的方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄球菌是革兰氏阳性球菌中的一种，广泛分布于自然界，如空气、水、饲料 和一些食品中，也存在于人和动物的体表、鼻咽部及肠道。致病性葡萄球菌常引起各种 化脈性疾患、败血症或脈毒败血症，当污染食品时，可引起食物中毒。1974年葡萄球菌 属分为=种：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌脚。其中金黄色葡萄球菌 staphylococ州S.aureus致病力最强，也最重要。金黄色葡萄球菌除了常引起皮肤、组织及 器官的化脈性炎症外，其产生的肠毒素可沾染食物而致食物中毒。
[0003] 由于抗生素的使用，细菌也为了自身发展而不断变异，就形成了细菌对抗菌药物 的耐药性，使本来有效的抗菌药物在遇到耐药菌引起的感染时疗效下降甚至完全无效。金 黄色葡萄球菌至今仍然是国内外医院获得性感染最常见的细菌之一。随着0-内献胺类抗 生素在临床的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA在临床分离的葡萄球菌中比例 不断增加，MRSA几乎对所有0-内献胺类抗生素都耐药。1996年，又出现了首例对万古霉 素敏感性下降的MRSA。一旦对万古霉素耐药，临床可选用药物将非常有限，从而造成治疗上 的困难。研究可靠的检测方法，对其准确、及时的检出，对于控制耐药菌的播散极为重要。
[0004] 本发明选择的目的基因为谷氨酸铁还原合成酶glutamatesynthase-ferredoxin largesubunit,gltB，序列同源性相对保守，能够较好的将金黄色葡萄球菌和其他食源性 致病菌进行区分。也是1870-2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》中检测金黄色葡 萄球菌的祀基因。
[0005] 本发明选择的另外一个目的基因为blaz基因，该基因负责编码青霉素结合蛋 白2a(PBP2a)，它降低0-内酷胺抗生素亲和力，而PBP2a与固有的PBP2共同作用，使得 细菌尽管在0-内酷胺抗生素的环境中也能合成细胞壁，使细菌对青霉素、头抱菌素和碳 青霉締类抗生素耐药。blaz基因位于葡萄球菌染色体mec盒staphylococcalcassette c虹omosomemec简称seemec侧面DM的特有片段上。seemec是一个携带mec基因复合 体的可移动基因岛genomicislands，GI，甲氧西林耐药和其他抗生素耐药基因在此不断积 累，形成耐药岛resistanceisland,RI，导致MRSA对抗生素双重耐药。
[0006] 传统细菌耐药性方法虽然能够满足临床的部分需要，但该些方法仍然存在一些缺 点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术的应用，近年来 发展了一系列快速细菌鉴定或分子检测技术，该类方法的特点是快速而准确，一般在几个 小时之内就可W得到检测结果，大大缩短了检测时间。针对金黄色葡萄球菌和blaz相关基 因，研究人员已开展了常规PCR和巧光PCR方法研究，但常规PCR方法需要PCR扩增后进行 电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的巧光燃料，而探针法巧光 PCR方法虽然灵敏准确，但是其检测成本较高，而且试剂有效期短，很容易降解。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种组分和配比合理，使 用方便，检测快捷，准确，适用于双重巧光PCR检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因 blaz的试剂盒；
[0008] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌及耐药基因 blaz的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用W下方案：
[0010] 一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物，其特征在于该引物的序列分别为：
[0011] 上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[001 引 下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0013] 上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0014] 下游引物blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0015] 一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20yL反应 体系包括W下组分：
[0016]
[0017] 其中所述上游引物gl巧F的序列；TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[001引 所述下游引物gl巧R的序列；GGATAATGAAGGGAAACC
[0019] 所述上游引物blazF的序列；ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0020] 所述下游引物blazR的序列；ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0021] 如上所述的一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其特征在于该试剂盒 中20yL反应体系包括W下组分：
[0022]
[0023] 一种检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于包括W下步骤：
[0024] A、提取样品DNA;
[0025] B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0026] C、扩增后对产物进行高分辨率烙解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0027] 如上所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反 应程序按W下步骤进行：
[0028] (1)92°C~96°C预变性 30s;
[0029] (2)92°C~95°C变性 10s~30s，54°C~64°C退火 10s~30s，72°C10s~30s，共 进行35~45个循环；
[0030] (3) 72°C延伸 10s~30s。
[0031] 如上所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率 烙解曲线分析，按W下步骤进行：
[0032] (1)92°C~96°C变性Imin;
[0033] (2)40^复性1111111;
[0034](3)然后初始烙解温度60°C~65°C，开始程序升温烙解至90°C~95°C，并在烙解 过程中实时检测巧光信号，15~25次/秒。
[00巧]如上所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下；
[0036] 取1. 5血培养物1000化pm离屯、2min;沉淀物加入500yL的TE缓冲液，反复吹打 使之重新悬浮，800化/min离屯、3min，去尽上清，向沉淀中加入200y1的50mg/mL的溶菌 酶溶液30化10%SDS和15化的蛋白酶K，祸旋混匀后，于37°C温育比；加入100化的 5mol/L化C1,充分混匀，再加入80ulCTAB/化C1溶液，混匀后再65°C温育lOmin;加入等 体积的酪或氯仿或异戊醇混匀，离屯、4-5min，将上清转入一只新管中，加入0. 8倍体积的异 丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用ImL的70%己醇洗漆后，加入TE溶液溶解沉淀。
[0037] 本发明中标准品模板的制备：
[0038] W常规PCR方法扩增耐药基因目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR 产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体PMD18-T连接，将连接产 物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养， 提取质粒，W提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取 验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0039] 本发明中敏感性和特异性试验；
[0040] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于0.Ipg，且具有很好 重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0. 95,说明该 方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0041] 本发明与现有技术相比，具有W下优点：
[0042] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于巧光PCR检 测金黄色葡萄球菌和blaz基因；
[0043] 2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养 分析方法缩短两天左右；
[0044] 3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作， 避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
[0045] 4)采用本发明检测方法同一反应管即可实现同时金黄色葡萄球菌和blaz基因同 时检测，操作简便、快速，成本低，结果准确。
【附图说明】
[004引图1;仅有金黄色葡萄球菌gl巧基因检出的扩增曲线图；
[0047]图2;仅有金黄色葡萄球菌gl巧基因检出的HRM分析图；
[004引图3;仅有耐药基因blaz检出的扩增曲线图；
[0049] 图4;仅有耐药基因blaz检出的的HRM分析图；
[0050] 图5 ;g；UB基因和blaz基因同时检出的扩增曲线图；
[0051] 图6 ;gl巧基因和blaz基因同时检出的HRM分析图；
【具体实施方式】
[0052] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0053] 实施例1
[0054] 1、本发明一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物，其中该引物的序列分别为： [00巧]上游引物gl巧F ;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0056] 下游引物gl巧R ;GGATAATGAAGGGAAACC
[0057] 上游引物blazF ;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0058] 下游引物blazR ;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[00则 实施例2
[0060] 本发明一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其中该试剂盒中20 UL反应 体系包括W下组分：
[0061]
[0062] 其中上下游引物序列为：
[0063] 上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0064] 下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0065] 上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0066] 下游引物blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0067] 实施例3
[0068] 本发明检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其中20.OuL
[0069] 反应体系由W下组分组成：
[0070]
[ocm] 其中：
[0072] 其中引物序列如下：
[0073] 上游引物gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0074] 下游引物gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC [00巧]上游引物blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0076] 下游引物blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[0077] 实施例4
[0078] 本发明试剂盒中制备20uL反应体系由W下组分组成：
[0079]
[0080]
[0081] 其中引物序列如下：
[0082] 上游引物 gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0083] 下游引物 gl巧R;GGATAATGAAGGGAAACC
[0084] 上游引物 blazF;ACTTCAACACCTGCTGCTT
[0085] 下游引物 blazR;ACTCTTGGCGGTTTCACT。
[008引 实施例5
[0087] 本发明试剂盒中制备20UL反应体系由W下组分组成：
[0088]
[0089] 其中引物序列如下：
[0090] 上游引物 gl巧F;TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
[0091]