强冬性白菜型冬油菜cat酶分子标记及qtl定位的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体设及一种强冬性白菜型冬油菜 CAT酶活性基因WL位点，同时还设及与强冬性白菜型冬油菜CAT酶活性基因WL位点连锁 的分子标记。
【背景技术】
[0002] 白菜型油菜在我国栽培历史悠久，种质资源丰富，是我国重要的油料作物之一。但 白菜型油菜W春性为主，冬性白菜型冬油菜种质缺乏，适宜北方旱寒区种植的强冬性冬油 菜品种尤其缺乏。我国北方气候严寒，冬油菜具备优异的抗寒性才能安全越冬，因此抗寒品 种改良是北方冬油菜发展的关键。采用常规育种方法选育抗寒材料费时费力，且选择效率 较低，如果借助分子标记辅助育种，可W在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高 选择效率。
[0003]CAT是植物重要的保护性酶之一，在抵御外界低温环境中起着积极作用。因此CAT 酶活性的高低是衡量植物抗寒性强弱的指标之一。关于CAT酶活性及其基因的研究很多， 研究认为其符合数量性状的遗传特点。但不同作物中，其基因序列，表达模式、遗传效益有 所不同。近年强冬性白菜型冬油菜中CAT酶活性的研究甚多，但对其分子标记及WL定位的 研究尚未见报道。本研究通过Q化定位，旨在筛选出CAT的giL位点和分子标记，用于CAT 基因的克隆和强冬性白菜型冬油菜抗寒育种的分子标记辅助选择。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供3个强冬性白菜型 冬油菜CAT酶活性giL位点，该3个位点的效应值都比较高，对强冬性白菜型冬油菜CAT酶 活性调控起着重要作用，可用作定位克隆和分子标记辅助选择。
[0005] 本发明还提供多个强冬性白菜型冬油菜油CAT酶活性的giL位点连锁的分子标 记，该些分子标记与Q化位点的遗传距离较近且是基于PCR技术的SSR和InDel标记，因 而可靠且使用方便，将对强冬性白菜型冬油菜抗寒育种提供便利。
[0006]为解决本发明的技术问题采用如下技术方案： 强冬性白菜型冬油菜CAT酶分子标记及giL定位，其筛选包括有W下步骤： (1)构建分离群体；利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'晚油7号'和强 抗寒冬油菜'晚油9号'配置杂交组合，杂交F1代自交产生巧代分离群体。本发明用到 的实验材料由甘肃农业大学油菜遗传育种课题组提供。
[0007] (2)油菜叶片DNA提取；采用CTAB法提取亲本'晚油7号'和'晚油9号'及巧 代分离群体的叶片DNA。
[0008] (3)引物来源及合成；由上海生物工程技术有限公司合成315对引物，引物来源 于WWW.UKcrop,net发表的油菜微卫星引物序列W及化assicaDat油ase网站ht化：// brassica化.org/上公布的10个染色体上的所有引物，其中SSR引物51对，InDel引物264 对。
[0009] (4)多态性引物筛选；利用合成的引物对两亲本DM进行PCR扩增，筛选出具有多 态性的引物，该过程设及PCR扩增、聚丙締酷胺凝胶电泳、银染、照相等步骤。
[0010] (5)多态性引物在巧代检测；将筛选出的多态性引物在巧代中进行检测，获得基 因型数据，该过程与（4 )步骤基本相同。
[0011] (6)遗传连锁图构建及giL定位；根据巧代基因型数据，利用QTLIciMapping V3. 3软件进行遗传连锁图构建及giL定位。
[0012] 通过筛选步骤得到强冬性白菜型冬油菜CAT酶的3个giL位点，分别命名为： Qcat.gsau-2A-l、Qcat.gsau-2A-2 和Qcat.gsau-2A-3,与 3 个强冬性白菜型冬油菜CAT酶 Q化位点连锁的3个分子标记分别为；BrID90127、BrID10421和化ID10709, 3个分子标记的 序列分别如下： BrID90127-F；CGCTTTATGGGTTGATCGTA化ID90127-R;GATTMCAGAACTAAGTAAAGCCACTT BrID10421-F；GCATTATTTTGTCGGTTGAG 化ID10421-R;GACGATGTTATGAACGACAG BrID10709-F；TGAGGAAGAAACAAGTAGCTG BrID10709-R；ATGATGTGCTCGTGTGTTAT Qcat.gsau-2A-l位点位于2A染色体上，与分子标记化ID90127和化ID10421连锁，可 解释39. 2403%的表型变异，加性效应为0. 4611，显性效应12. 0654。
[0013]Qcat.gsau-2A-2位于2A染色体上，与分子标记化ID90127和化ID10421连锁，可 解释37. 3135%的表型变异，加性效应为0. 1505,显性效应11. 6888。
[0014]Qcat.gsau-2A-3位于2A染色体上，与分子标记化ID10421和化ID10709连锁，可 解释38. 2068%的表型变异，加性效应为0. 1846,显性效应11. 3414。
[0015] 本发明的有益效果；本发明首次定位得到3个强冬性白菜型冬油菜CAT酶活性 Q化位点，并给出3个与强冬性白菜型冬油菜CAT酶活性giL位点连锁的3个标记，解释 39. 2403%、37. 3135%和38. 2068%的表型变异。在常规抗寒育种中，试验材料需通过越冬来 判断其抗寒性的强弱，费时费力。通过检测CAT酶活性giL位点，在苗期就可W筛选材料， 大大提高了筛选效率，节约生产成本，加快育种进程。同时CAT酶活性giL位点的获得，可 进一步进行CAT酶基因的克隆，为强冬性白菜型冬油菜抗寒机理的探索提供技术支撑。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明强冬性超强抗寒冬油菜晚油7号和强抗寒冬油菜晚油9号杂交巧 代群体CAT酶活性分布图； 图2为本发明利用两亲本筛选多态性引物； 图3为本发明多态性引物RalFOe在巧代中的检测结果； 图 4 为本发明Qcat.gsau-2A-l、Qcat.gsau-2A-2 和Qcat.gsau-2A-3 位点在 2A染色体 的位置及LOD曲线示意图。
【具体实施方式】
[0017]W下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0018] 实施例1;强冬性白菜型冬油菜分离群体的构建及CAT酶活性测定。
[0019] 本实施例中使用的分离群体具体构建如下； (1)2010年8月利用多代套袋自交的亲本强冬性超强抗寒冬油菜'晚油7号'和强抗 寒冬油菜'晚油9号'配置杂交组合，2011年5月收获F1代种子。
[0020] (2) 2011年8月播种F1种子，2012年4月套袋自交，获得巧代种子。
[0021] 2012年8月播种巧代种子。待苗期随机选取103株挂牌标记，于11月初采集新 鲜幼叶，用冰盒带回实验室并保存于-70°C超低温冰箱。采用紫外吸收法测定CAT酶活性。 结果表明；巧代CAT酶活性均呈正态分布，且变异范围很宽，证明CAT酶性状属于数量性状 (图 1)。
[002引实施例2;亲本和巧代分离群体叶片总DNA的提取。
[0023] 采用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下； (1)采摘健康幼叶作为提取油菜基因组DNA的材料，用蒸馈水洗净，用纸吸干。
[0024] (2)取新鲜的叶片0.5g左右置于研鉢中，加入液氮，迅速研磨至发白粉末状后立 即装入2ml离屯、管。
[0025] (3)加入已预热的2XCTAB提取缓冲液700ul浸透粉末并倒转离屯、管，使粉末充分 散开，于65°C水浴60min，其间轻柔混合2-3次。
[0026] (4)取出离屯、管，冷却至室温，加入700ul的氯仿/异戊醇（24/1)，轻缓颠倒混匀， 静置10min。
[0027] (5) 13000巧m离屯、lOmin。
[0028] (6)取上清600ul转移至新离屯、管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1)，轻缓颠 倒混匀，室温放置lOmin。
[0029] (7) 1300化pm离屯、lOmin，取上清400ul转移至新离屯、管中，加等体积已预冷的异 丙醇，保存于-20°C，静置20min。
[0030] (8)13000巧m离屯、lOmin，将离屯、管倒置于吸水纸上，控干上清，用600ul70%的己 醇洗漆沉淀2次，室温下微干。加入300ul去离子水溶解沉淀。
[0031] (9)加入lulRNase(lOmg/ml)置于37°C水浴60min,每个离屯、管加300ul去离 子水，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。
[0032] (10)吸取上清400ul转入新离屯、管，加入上清体积1/10的3mol/LNaAC溶液，2. 5 倍体积的预冷无水己醇沉淀DNA，置于-20°C，20min左右，12000巧m离屯、lOmin，弃上清。
[0033] (11)用600ul70%的己醇洗漆沉淀2次，通风干燥或者自然干燥。
[0034] (12)加入30ulTE缓冲液溶解DNA，4°C保存备用。（-20°C长期保存） 实施例3;SSR和InDel引物来源、合成及多态性筛选。
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