一种大肠杆菌的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，尤其是一种大肠杆菌的检测方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌(Escherichia coli)，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，与人类疾病有关的大肠杆菌一般包括五种，即肠毒素性大肠杆菌(ETEC)，致病性大肠杆菌(SPEC)、出血性大肠杆菌(EHEC)，侵袭性大肠杆菌(EIEC)和粘附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌常随粪便从人及动物体排出，广泛散播于自然界中，所以一旦检出大肠杆菌，即意味着直接或间接地被粪便污染，在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；并且由于大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近，它的出现也可能预示着某些肠道病原菌的存在，因此该细菌是国际上公认的卫生监测指示菌。现有技术，一般采用无菌操作，将食品检样经过相应的处理后，做一定的倍比稀释，然后在一定条件下培养(如培养基成分、培养温度和时间、PH值、需氧性质等)，最后在电镜、显微镜下观察，根据菌落的颜色、形态等生化指标进行分辨，并计算平板的菌落数。该方法成本低，特别是对检测实验室的硬件设备要求低，曾一度被认为是微生物检测的经典方法，也是后来各种检测方法的基础平台，在各个国家都被认可，该标准在我国一直沿续至今，特别是一些病原细菌的检测。但是，该方法非常繁琐，需要耗费大量的人力物力，而且检测周期长、灵敏度低，难以满足目前国内外对食品安全检测的要求。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的问题是:克服现有技术的不足，提供一种方便、快捷，成本低，灵敏度高，便于操作的大肠杆菌的检测方法。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种大肠杆菌的检测方法，包括以下步骤:
[0005](I)样品的准备
[0006]a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解，再用过滤膜进行多膜离心过滤，所述过滤膜为2-5层，过滤后得滤液，将滤液分装至五个无菌容器内；
[0007]b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌容器内的滤液分别进行稀释，依次做成I:5梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为al、a2、a3、a4和a5 ;
[0008](2)乳糖发酵试验
[0009]c.在无菌条件下，取出三份ImL的稀释液al，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a2，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a3，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a4，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a5，分别移至培养基上培养；
[0010]d.观察所述步骤c中的培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性；
[0011]若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。
[0012]进一步地，所述步骤a中多膜离心过滤的离心速率为5000_8000r/min。
[0013]进一步地，所述步骤a中过滤膜的厚度为0.2-0.44 μ m。
[0014]进一步地，所述步骤c中三份稀释液al的培养温度为30-34°C，培养时间为15-20ho
[0015]进一步地，所述步骤c中三份稀释液a2的培养温度为30-34°C，培养时间为15-20ho
[0016]进一步地，所述步骤c中三份稀释液a3的培养温度为30-34°C，培养时间为15-20ho
[0017]进一步地，所述步骤c中三份稀释液a4的培养温度为30-34°C，培养时间为15-20ho
[0018]进一步地，所述步骤c中三份稀释液a5的培养温度为30-34°C，培养时间为15-20ho
[0019]本发明具有的优点和积极效果是:
[0020]本发明方便、快捷，成本低，灵敏度高，便于操作。
【具体实施方式】
[0021]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0022]一种大肠杆菌的检测方法，包括以下步骤:
[0023](I)样品的准备
[0024]a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解，再用过滤膜进行多膜离心过滤，过滤膜为4层，过滤膜的厚度为0.3 μ m，多膜离心过滤的离心速率为6000r/min，过滤后得滤液，将滤液分装至五个无菌容器内；
[0025]b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌容器内的滤液分别进行稀释，依次做成I:5梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为al、a2、a3、a4和a5 ;
[0026](2)乳糖发酵试验
[0027]c.在无菌条件下，取出三份ImL的稀释液al，分别移至培养基上，32°C下培养18h ;取出三份ImL的稀释液a2，分别移至培养基上培养，32°C下培养18h ;取出三份ImL的稀释液a3，分别移至培养基上培养，32°C下培养18h ;取出三份ImL的稀释液a4，分别移至培养基上，32°C下培养18h ;取出三份ImL的稀释液a5，分别移至培养基上，32°C下培养18h ；
[0028]d.观察所述步骤c中的培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性；
[0029]若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。
[0030]以上所述，仅为本发明的较佳实例，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定的范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种大肠杆菌的检测方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)样品的准备 a.在无菌条件下，将样品用生理盐水溶解，再用过滤膜进行多膜离心过滤，所述过滤膜为2-5层，过滤后得滤液，将滤液分装至五个无菌容器内； b.在无菌条件下，将步骤a中的五个无菌容器内的滤液分别进行稀释，依次做成1:5梯度的稀释液，所述五个稀释液分别为al、a2、a3、a4和a5 ; (2)乳糖发酵试验 c.在无菌条件下，取出三份ImL的稀释液al，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a2，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a3，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a4，分别移至培养基上培养；取出三份ImL的稀释液a5，分别移至培养基上培养； d.观察所述步骤c中的培养基有无气体产生，若无气体产生，则为大肠杆菌阴性； 若有气体产生，则将培养基上的菌落进行革兰氏染色，同时接种在乳糖发酵管中培养，观察菌落，若乳糖发酵管中产气，革兰氏染色为阴性无芽孢杆菌，即为大肠杆菌阳性。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于:所述步骤a中多膜离心过滤的离心速率为5000-8000r/min。3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于:所述步骤a中过滤膜的厚度为0.2-0.44 μ m。4.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于:所述步骤c中三份稀释液al的培养温度为30-34°C，培养时间为15_20h。5.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于:所述步骤c中三份稀释液a2的培养温度为30-34°C，培养时间为15_20h。6.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于:所述步骤c中三份稀释液a3的培养温度为30-34°C，培养时间为15_20h。7.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于:所述步骤c中三份稀释液a4的培养温度为30-34°C，培养时间为15_20h。8.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于:所述步骤c中三份稀释液a5的培养温度为30-34°C，培养时间为15_20h。
【专利摘要】本发明涉及一种大肠杆菌的检测方法，属于生物检测技术领域，包括以下步骤：(1)样品的准备：a.将样品用生理盐水溶解，过滤，将滤液分装至五个无菌容器内；b.将五个无菌容器内的滤液进行稀释，五个稀释液分别为a1、a2、a3、a4和a5；(2)乳糖发酵试验：c.取出三份1mL的稀释液a1，分别移至培养基上培养；取出三份1mL的稀释液a2，分别移至培养基上培养；取出三份1mL的稀释液a3，分别移至培养基上培养；取出三份1mL的稀释液a4，分别移至培养基上培养；取出三份1mL的稀释液a5，分别移至培养基上培养；d.观察所述步骤c中的培养基有无气体产生。本发明方便、快捷，成本低，灵敏度高，便于操作。
【IPC分类】C12Q1/10
【公开号】CN104988205
【申请号】CN201510382606
【发明人】尹少华
【申请人】天津市秦柳食品科技有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月2日