一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌及其在生物基化学品合成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌及其在生物基化学品合成中的应用，将来自真养产碱杆菌（Alcaligenes?eutrophus）的分泌型脂酶（slipase）基因构建到原核表达载体pUC19上，然后导入敲除了fadR基因的大肠杆菌得到的重组菌，利用该菌株以甘油三酯为底物进行发酵，结果表明，在甘油三酯作为唯一碳源的培养基中，该菌株能够正常生长。本发明为脂类化合物的生物利用开辟了一条新的途径。
【专利说明】一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌及其在生物基化学品合成中的应用
【技术领域】[0001]本发明涉及一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌的构建方法及其构建得到的基因工程菌，以及利用该基因工程菌在以甘油三酯为碳源发酵生产目标产物的应用。
【背景技术】
[0002]废弃油脂是指餐饮业、食品加工业在生产过程中产生的不能再食用的动植物油月旨，包括煎炸废油、泔水油和地沟油等。废弃油脂主要指常见的植物油、动物油两大剩余和排放的废弃油渣和泔水，据专家计算，这些废弃油脂的量约占食用油消费总量的20-30%。以我国年均消费食用油量为2100万吨计,则每年产生废油400-600万吨。目前,我国废弃食用油脂没有得到合理利用，相反，废弃食用油脂已成为一种环境污染物，并冲击食品安全。
[0003]废弃油脂的主要成分为甘油三酯，目前其主要利用技术是制备生物柴油(中国发明专利201210329282.0)，但其成本过高，限制了生物柴油工业的发展。因此，探索餐饮废弃油高值化利用新途径具有十分重要的意义。从资源利用及经济合理性的角度看，把餐饮废弃油脂转化为高附加值产物是值得探索的研究方向。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌，是将分泌型脂酶导入大肠杆菌得到的重组菌。
[0005]所述分泌型脂酶导入可以是通过载体导入宿主细胞，也可直接将分泌型脂酶整合到大肠杆菌染色体上，优选将分泌型脂酶整合到大肠杆菌染色体上。
[0006]所述编码分泌型脂酶的基因来源于真养产碱杆菌或与该基因具有类似功能的基因。
[0007]优选地，所述编码分泌型脂酶的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该基因来源于真养产碱杆菌H16 (Alcaligenes eutrophus H16)或与该基因具有类似功能的基因。
[0008]所述大肠杆菌为已知常用大肠杆菌，优选大肠杆菌K-12或大肠杆菌BW25113，更进一步地，优选上述大肠杆菌为敲除了 fadR基因的大肠杆菌。
[0009]本发明还提供了一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌的构建方法，是将分泌型脂酶导入大肠杆菌。
[0010]所述构建方法，步骤如下:
[0011]I)将脂酶基因连接到原核表达载体相应的多克隆位点上；
[0012]2)将该表达载体导入大肠杆菌。
[0013]上述大肠杆菌为大肠杆菌缺失突变株，通过如下方法改造得到:(a)采用Red重组敲除大肠杆菌基因组上的fadR基因，(b)采用翻转酶消除抗性标记。
[0014]本发明还提供了一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌用于生产发酵产品的应用，是将甲羟戊酸合成酶基因导入上述重组大肠杆菌。[0015]具体而言，构建表达质粒pACY-mva (Yang et al., 2012PL0S ONE, 7: e33509)。将表达载体pACY-mva通过传统的热激转化法转入上述大肠杆菌基因工程菌，利用得到的重组菌发酵生产甲羟戊酸。
[0016]本发明还提供以甘油三脂作为唯一碳源对大肠杆菌进行发酵的方法，包括(a)在适宜条件下培养大肠杆菌，活化菌株，(b)将大肠杆菌转接至添加甘油三酯的M9培养基中，(c)加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导脂酶的表达，Cd)大肠杆菌利用外源甘油三酯生长。
[0017]-
[0018]有益效果:
[0019]I)本发明所提供的工程大肠杆菌可以高效利用甘油三酯，而甘油三酯是废弃油脂的主要成分，因此，本发明提供的工程菌株为废弃油脂的再利用提供了一条新的途径；
[0020]2)大肠杆菌作为一种模式生物，其遗传背景清楚，易于进行基因操作，因此，与常见的废弃油脂降解菌株相比，本发明提高的大肠杆菌可以进行进一步改造，用于合成高附加值的化合物。
[0021]3)在本发明中，我们将甲羟戊酸合成的代谢途径与甘油三酯分解的代谢途径进行整合，实现了工程大肠杆菌利用甘油三酯直接合成甲羟戊酸，为废弃油脂的高值化利用提供了一条新的出路。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图lpUC-slipase表达载体图谱。
[0023]图2pUC-slipase载体的酶切鉴定图；
[0024](M =DNA分子量标记，1:对照质粒pUC19经HindIII和EcoRI双酶切，2:重组质粒pUC-slipase 经 HindIII 和 EcoRI 双酶切)。
[0025]图3大肠杆菌fadR基因敲除的PCR验证图；
[0026](M:DNA分子量标记，1:敲除fadR后菌株BW25113 Λ fadR的PCR扩增图谱，2:对照菌株BW25113的PCR扩增图谱)。
[0027]图4不同菌株利用甘油三酯发酵的情况。
[0028]图5不同菌株利用甘油三酯的生长曲线。
[0029]图6不同菌株发酵液中残留甘油三酯的检测；
[0030](A:对照菌株 BW25113，B:工程菌株 BW25113 Λ fadR/pUC-slipase)。
【具体实施方式】
[0031]实施例1:
[0032]真养产喊杆菌H16 (Alcaligenes eutrophus H16)分泌型脂酶基因(slipase, Genbank 登录号:AM260479REG10N:965025..966251)的克隆及表达载体构建，具体过程如下:
[0033]以寡核苷酸5’-CCCAAG CTT GAT GTC TCG CGC TCC TGG CAT G-3’和5’_CCG GAATTC CTA TGG GCA CTC GGA TAC CGC-3’为引物，以真养产碱杆菌H16(购自德国微生物菌种保藏中心，DSM N0.:428)的总DNA为模版，采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出真养产碱杆菌的分泌型脂酶基因(序列1)，并在5’端和3’端分别引入HindIII和EcoRI酶切位点，扩增体系和条件如下:
[0034]PCR扩增体系:
[0035]
【权利要求】
1.一种以甘油三酯为碳源的大肠杆菌，是将分泌型脂酶基因导入大肠杆菌得到的重组菌。
2.如权利要求1所述大肠杆菌，其特征在于，是将来源于真养产碱杆菌的分泌型脂酶基因导入敲除了 fadR基因的大肠杆菌。
3.如权利要求1所述大肠杆菌，其特征在于，所述分泌型脂酶整合到大肠杆菌染色体上，编码分泌型脂酶的基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述大肠杆菌为敲除了 fadR基因的大肠杆菌。
4.权利要求1所述大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤如下: 1)将来源于真养产碱杆菌的分泌型脂酶基因连接到原核表达载体相应的多克隆位点上； 2)将该表达载体导入敲除了fadR基因的大肠杆菌得到重组菌。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述敲除了fadR基因的大肠杆菌为大肠杆菌缺失突变株，通过如下方法改造得到:(a)采用Red重组敲除大肠杆菌基因组上的fadR基因，(b)采用翻转酶消除抗性标记。
6.如权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)以真养产碱杆菌Hl6的总DNA为模版,扩增出真养产碱杆菌的分泌型脂酶基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，将上述PCR产物及载体pUC19酶切后的产物进行电泳回收，然后进行连接反应构建重组质粒pUC-slipase ；· 2)利用Red重组系统对fadR基因(GeneID:948652)进行敲除，根据基因序列设计带有50bp的fadR基因同源臂的引物，以pKD4质粒为模板，通过PCR扩增带有卡那霉素抗性的重组片段，扩增产物采用DpnI内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳回收浓缩，采用电击转化法将浓缩后的扩增片段转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，电击后的细胞涂布含卡那霉素的选择性平板，筛选阳性克隆，将用于消除卡那霉素抗性的质粒PCP20热击转化阳性菌落的感受态细胞，诱导翻转酶的表达，消除卡那抗性片段，得到工程菌株BW25113 Δ fadR ； 3)提取pUC-slipase质粒，将重组质粒pUC_slipase转化步骤2)构建的工程菌株BW25113 Δ fadR的感受态细胞，制得最终工程菌株BW25113 Δ fadR/pUC-slipase。
7.权利要求1所述大肠杆菌利用甘油三酯为碳源发酵生产生物基化学品。
8.一种利用权利要求1所述大肠杆菌发酵生产甲羟戊酸的方法，其特征在于，步骤如下: 1)敲除大肠杆菌fadR基因； 2)将来源于真养产碱杆菌的分泌型脂酶基因导入敲除了fadR基因的大肠杆菌； 3 )将羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因导入步骤2)构建的重组大肠杆菌； 4)步骤4)构建的重组大肠杆菌利用甘油三酯发酵生产甲羟戊酸。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，编码分泌型脂酶的基因核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
10.如权利要求8所述方法，其特征在于，具体步骤如下: I)以真养产碱杆菌Hl6的总DNA为模版,扩增出真养产碱杆菌的分泌型脂酶基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，将上述PCR产物及载体pUC19酶切后的产物进行电泳回收，然后进行连接反应构建重组质粒pUC-slipase ； 2)利用Red重组系统对fadR基因(GeneID:948652)进行敲除，根据基因序列设计带有50bp的fadR基因同源臂的引物，以pKD4质粒为模板，通过PCR扩增带有卡那霉素抗性的重组片段，扩增产物采用DpnI内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳回收浓缩，采用电击转化法将浓缩后的扩增片段转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，电击后的细胞涂布含卡那霉素的选择性平板，筛选阳性克隆，将用于消除卡那霉素抗性的质粒PCP20热击转化阳性菌落的感受态细胞，诱导翻转酶的表达，消除卡那抗性片段，得到工程菌株BW25113 Δ fadR ； 3)提取pUC-slipase质粒，将重组质粒pUC-slipase转化步骤2)构建的工程菌株BW25113AfadR的感受态细胞，制得最终工程菌株BW25113 Λ fadR/pUC-slipase ； 4)根据粪肠球菌羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因序列，构建表达质粒pACY-mva,将pACY_mva通过传统的热激转化法转入大肠杆菌BW25113AfadR/pUC-slipase来构建利用甘油三酯为底物产甲羟戊酸的工程菌，重组菌利用甘油三酯发酵生产甲羟戊 酸。
【文档编号】C12N1/21GK103571786SQ201310474480
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】咸漠, 曹玉锦, 张汝兵, 曹志峰 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所