一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法
【专利摘要】本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种人γδT细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法。用于检测制成的人γδT细胞。本发明包括以下步骤：制备人γδT细胞后通过显微镜进行形态学观察、流式细胞仪进行纯度和免疫表型分析。本发明的优点是：检验获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而确保制成的人γδT细胞能够满足临床的需要，而且实现了IPP等非肽磷酸类抗原、抗TCRγδ抗体等刺激剂相比培养成本大大降低；解决了现有技术体外培养γδT细胞数量低、毒性弱、成本高等问题的效果。
【专利说明】—种人Y S T细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法
[0001]本申请是2012年2月10日、申请号为201210030197.4的发明专利《一种简单高效制备人Y δ T细胞的方法》的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种体外大量优势扩增人外周血
YS T细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法。
【背景技术】
[0003]T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(Τ cell receptor, TCR)的不同分为两类:TCRa β T细胞和TCR Y δ T细胞，分别简称为α β T细胞和Y δΤ细胞。其中Y δ T细胞是介于特异性免疫与非特异性免疫之间的一种特殊类型的细胞，大多数为CD4和CD8分子双阴性，少数可表达⑶8分子。Y δ T细胞主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过T细胞总数的5%。Y δ T细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视的第一道防线。但由于Y ST细胞在外周血和肿瘤组织中含量不高，要获得大量高细胞毒活性的Y ST细胞是十分困难的。虽然已有技术通过抗TCRy δ抗体或非肽磷酸类抗原获得大量Y S T细胞，这无疑会增加其制备的成本。经广泛查阅国内外专利文献和各种出版物，迄今为止，均未见有实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血Y δT细胞的发明或报道。因此发明一种实用、高效、快速体外大量优势扩增人外周血
YS T细胞的方法，对于Y δ T细胞免疫功能的研究，并用其提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力是非常重要的， 对于攻克人类渴望解决的恶性肿瘤性疾病这一难题也是十分有价值的。在人外周血Y S T细胞制备后需要对其进行形态学、纯度及免疫表型检测，确保成品符合要求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了提供一种人Y δ T细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法。用于检测人Y S T细胞。
[0005]本发明所采用的技术方案是:一种制备人Y δΤ细胞的方法，包括如下步骤:培养结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)并制备结核杆菌耐热性抗原(Mycobacterium tuberculosis heated antigen, Mtb-HAg),米集并分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),用 Mtb-HAg 激活，同时加入细胞因子rhIL-2和rhIL-21，置于37°C，5%C02和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2~3天进行补加含有等量rhIL_2的培养液，以维持细胞密度为(0.5~2.0) X 106/ml。10~15天即可以获得大量、高细胞毒活性的Y S T细胞。所述的Mtb培养基为苏通式液体培养基或者Middlebrook7H9，Mtb经过高压蒸汽处理，并经离心超滤制备成Mtb-HAg。所述的PBMCs是采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得。所述Mtb-HAg的终浓度为5~10μ g/ml，rhIL-2的终浓度为50~500IU/ml，rhIL_21的终浓度为5~20ng/ml ο根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10~15天。
[0006]本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
[0007]细胞培养24小时即可见Y δ T细胞沉于培养器皿的底部，并趋于集落化，48小时集落开始变大，培养6~10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞。对培养10天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见I个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养10天的细胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。
[0008]分别取第0、7、14、21和28天的细胞，用含5%新生牛血清和0.1%叠氮纳的PBS洗涤2次，调整细胞密度为I XlOfVml，每个检测管内加入50 μ I细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗CD3-FITC、抗TCR y δ -PE)染色，4°C避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件分析。
[0009]本发明的有益效果是:检验获得的Y δ T细胞具有数量大、纯度高、细胞毒性强等特点，从而确保制成的人Y S T细胞能够满足临床的需要，而且实现了 IPP等非肽磷酸类抗原、抗TCR Y δ抗体等刺激剂相比培养成本大大降低；解决了现有技术体外培养Y δΤ细胞数量低、毒性弱、成本高等问题的效果。 【具体实施方式】
[0010]下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
[0011]首先本发明是用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原。包括以下步骤:
[0012]1.将结核杆菌菌体种子湿重50~100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于37°C培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10%~30%新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37°C培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体。
[0013]2.将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115°C高压蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb-HAg。
[0014]用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，以获取大量、高纯度、高细胞毒活性的Y δ T细胞。具体操作包括以下步骤:
[0015]1.无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为:1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞。
[0016]2.将上述分离的PBMCs置于含有I~10 μ g/ml的Mtb_HAg、50~500IU/mlrhIL-2、5 ~20ng/ml rhIL-21 和 1% ~10% 自体血浆的 RPMI1640、AIM-V 或 GT-T551 培养基内，调细胞密度为(I~2) X106/ml，优选的刺激剂和细胞因子的浓度分别为Ayg/ml Mtb-HAg、200IU/ml rhIL-2、10ng/ml rhIL-21，自体血浆的浓度为 5%，细胞的初始密度2 X 106/ml，转入细胞培养板、培养瓶或培养袋内，优选细胞培养袋，于37°C、5%C02和饱和湿度的培养箱内培养，72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2~3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为(0.5~2.0)X 106/ml。根据PBMCs的生长状态，细胞培养时间约为10~15天。在细胞培养的第14天，培养增殖的人Y δ T细胞绝对扩增细胞倍数平均高达500倍(η=8)。[0017]对上述培养的Y δ T细胞进行形态学、纯度及免疫表型和细胞毒活性检测。具体操作包括以下步骤:[0018]1.细胞培养24小时即可见Y δ T细胞沉于培养器皿的底部，并趋于集落化，48小时集落开始变大，培养6~10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞。对培养10天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见I个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养10天的细胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。通过本发明可以观察到制备的细胞活力大于95%。[0019]2.分别取第0、7、14、21和28天的细胞，用含5%新生牛血清和0.1%叠氮纳的PBS洗涤2次，调整细胞密度为1父1071111，每个检测管内加入5(^1细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗⑶3-FITC、抗TCR Y δ -PE)染色，4°C避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件分析。通过本发明可以检测到制备的细胞制剂，⑶3+T细胞高度富集纯度达到98%，Y δΤ细胞从第10~14天达到峰值平均为80% (η=8)。[0020]3.取对数生长期的Κ562细胞株作为靶细胞，并调整细胞密度为lX105/ml、5XioVml,2.5X104/ml，每孔取100 μ I铺于96孔培养板中，培养24小时，取本发明制备的细胞调密度为IX 106/ml，加入96孔培养板中，使效靶比分别为10:1、20:1和40:1，各密度设3个复孔并分别设置空白对照，培养48小时后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT20 μ 1，继续培养4小时后弃上清，每孔加入DMS0100 μ 1，于A570nm和A630nm处测吸光度(A)值，计算出绝对A值(A=A570-A630)，按下式计算杀伤活性:杀伤活性(％) = (A靶细胞+A效应细胞一 A效靶混合细胞)/A靶细胞X 100%。结果显示本发明制备的Y δΤ细胞对K562细胞株具有较高的杀伤活性，杀伤率平均为82% (n=8)。
【权利要求】
1.一种人Y S T细胞的形态学、纯度及免疫表型检测方法，其特征在于: 首先制备一种人Y ST细胞，包括:(1)用培养的结核杆菌制备结核杆菌耐热性抗原，其具体步骤为: 步骤1:将结核杆菌菌体种子湿重50~100克接种于200ml的苏通式液体培养基内，于37°C培养箱内静止培养2周，然后将其分装到含有10%~30%新生牛血清的250ml的苏通式液体培养基内，每瓶50ml，分装成4瓶，再继续于37°C培养箱内静止培养4周，收集培养的细菌悬液，经4000转/分，离心30分钟以收获结核杆菌菌体； 步骤2:将收集的菌体经生理盐水洗涤2次，再用2倍体积的蒸馏水重悬浮菌体，115°C高压蒸汽处理20分钟，4000转/分，离心30分钟收集上清液，即为Mtb-Hag ； (2)用制备的Mtb-HAg刺激PBMCs，同时加入细胞因子rhIL_2和rhIL_21，其具体步骤为: 无菌条件下用血细胞分离机或50ml注射器采集患者外周静脉血，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞，具体步骤为:1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞；将上述分离的PBMCs置于含有刺激剂和细胞因子为I~10μ g/ml的Mtb_HAg、.50 ~500IU/ml rhIL_2、5 ~20ng/ml rhIL-21 和 1% ~10% 自体血浆的 RPMI1640,AIM-V 或GT-T551培养基内，调细胞密度为(I~2) X 106/ml，转入细胞培养板、培养瓶或培养袋内，于37°C、5%C02和饱和湿度的培养箱内培养； (3)细胞培养72小时后进行半量更换培养液并补加等量的rhIL-2，以后根据细胞生长状态每2~3天进行补加含有等量rhIL-2的培养液，以维持细胞密度为(0.5~2.0)X IO6/ml ； (4)根据细胞生长状态，第10~15天收获细胞； 将细胞培养24小时即可见Y δ T细胞沉于培养器皿的底部，并趋于集落化，48小时集落开始变大，培养6~10天即可以看到大的集落和不规则的单个核细胞，对培养10天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见I个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规则，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形；取培养10天的细胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数； 分别取第0、7、14、21和28天的细胞，用含5%新生牛血清和0.1%叠氮纳的PBS洗涤2次，调整细胞密度为I X 106/ml，每个检测管内加入50 μ I细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗CD3-FITC、抗TCRy δ -PE)染色，4°C避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1%多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用WinMDI软件分析。
【文档编号】C12N5/0783GK103571791SQ201310474485
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年2月10日 优先权日:2012年2月10日
【发明者】马飞, 王宇环, 罗晓玲 申请人:深圳市合一康生物科技有限公司