一种骨髓液涂片的制备方法
【专利摘要】本发明属于骨髓细胞学检验领域，具体涉及一种骨髓液涂片的制备方法。本发明提供的骨髓液涂片的制备方法为抽取骨髓液，加入抗凝剂，将骨髓液涂片并染色，即得。本发明提供的骨髓液涂片的制备方法能有效维持骨髓细胞的形态，使骨髓细胞分布更均匀，有利于骨髓细胞的分类，大大的提高了骨髓细胞学检测的准确性。同时本发明提供的骨髓液涂片的制备方法还具有操作简单、方便，质量易于控制的优点，而且制备得到的涂片着色均匀，细胞着色后鲜艳、匀称、结构清晰，细胞浆颜色及透明度能反应各类各期细胞的相应特性，细胞浆与细胞核着色的对比度好，是一种较为理想的骨髓液涂片的制备方法。
【专利说明】
_种骨髓液涂片的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于骨髓细胞学检验领域，具体涉及一种骨髓液涂片的制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着科学的不断发展，学科间的相互渗透，血液学领域不断扩大，检测手段愈来愈 丰富。细胞生物化学、免疫、遗传、细胞动力学及电镜等检查使形态学检查达到了分子水平， 而且在日常临床工作中，光镜下的细胞形态学检查是首选和必不可少的手段。骨髓检查可 用于造血系统疾病的诊断，如对白血病的鉴别诊断、各种贫血的鉴别诊断、多发性骨髓瘤和 血小板增加或减少性疾病的诊断;骨髓检查还可用于某些感染性疾病，如感染性心内膜炎， 骨髓培养有助于提高该病诊断的阳性率;骨髓检查还可以用于骨髓干细胞培养、染色体核 型检查、骨髓细胞免疫学分型试验等。
[0003] 通过骨髓细胞学检验可了解骨髓造血功能及其病理变化，是血液病诊断、鉴别诊 断、疗效观察、判断预后的主要检测手段。在骨髓细胞学检查过程中，骨髓的取材、涂片、染 色的质量可直接影响细胞的形态观察和分析，尤其是涂片染色失真会直接影响骨髓细胞的 误判和误诊。因此，提高骨髓液涂片的质量是骨髓细胞学检查的关键。
[0004] 范洪等发表了一篇题目为"骨髓涂片常规检验与应用"的文章，该文章详细的描述 了骨髓取材、涂片、染色的具体步骤，同时还写明了骨髓涂片制备的注意事项，可以有效的 提高骨髓细胞学检查中骨髓取材、涂片、染色的质量。但是，该方法的染色法是采用滴染法， 滴染时容易出现染料沉积在玻片上，有较多的染料颗粒存在，而且滴染法在操作时缓冲液 和染液滴加的比例难以控制，容易出现染色过深或过浅的现象，导致整个骨髓涂片着色不 均匀，细胞结构模糊，有沉渣颗粒，不利于骨髓细胞的检查。
[0005] 因此，研究和开发出一种可以使骨髓涂片着色均匀，视野清晰，细胞鲜艳、匀称、结 构清晰，无沉渣颗粒，便于观察的骨髓涂片仍是当前研究的重点。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种可以使骨髓涂片着色均 匀，视野清晰，细胞鲜艳、匀称、结构清晰，无沉渣颗粒，便于观察的骨髓液涂片的制备方法， 以解决上述缺陷。
[0007] 本发明提供了一种骨髓液涂片的制备方法，包括以下步骤：
[0008] S1抽取骨髓液，加入骨髓液体积的0.2-0.3 %的抗凝剂反应30-60s，得抗凝骨髓 液；
[0009] S2将步骤S1得到抗凝骨髓液滴到载玻片的一端，用推玻片将骨髓液涂成薄片，得 涂片；
[0010] S3将步骤S2得到的涂片排列在玻片架上，将玻片架放入染色缸I内固定l-3min，所 述染色缸I内为染色液，所述染色液的高度为恰好淹没血膜；
[0011] S4将步骤S3处理过的玻片架转入染色缸II内染色25-35min;所述染色缸II内为染 色液与缓冲液的混合液，所述染色液与缓冲液的混合液高度为恰好淹没血膜；
[0012] S5将步骤S4处理后的玻片冲洗5-15S，以冲洗后的水无颜色残留为宜，干燥，即得。 所述干燥方式为自然晾干或冷风吹干等。
[0013 ]进一步地，所述步骤S1中的抗凝剂的浓度为2-4mg/ml。
[0014] 进一步地，所述步骤S1中的抗凝剂由肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:2-4组 成。
[0015] 进一步地，所述步骤S1中的抗凝剂由肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:3组成。
[0016] 进一步地，所述步骤S2中的抗凝骨髓液的添加量为5-7yL，所述推玻片与载玻片的 角度为35°。
[0017] 进一步地，所述步骤S3中的染色液的制备方法为：取瑞氏染粉lg，姬姆萨染粉 0.3g，加入500ml甲醇中，再加入10ml甘油混匀，将配置好的染色液放置37°C水浴箱内孵育 1-2天，并在常温下存放6-8天，即得。
[0018]进一步地，所述步骤S4中的染色液与缓冲液的混合液的制备方法:将30ml质量浓 度为1 %的磷酸二氢钾溶液与20ml质量浓度为1 %的磷酸氢二钠溶液混匀，并加入950ml的 蒸馏水混匀，得缓冲液;将缓冲液与权利要求6制备得到的染色液混合均匀，得染色液与缓 冲液的混合液。
[0019] 进一步地，所述染色液与缓冲液的混合液由染色液和缓冲液按体积1:3-3.5组成。
[0020] 进一步地，所述染色液与缓冲液的混合液由染色液和缓冲液按体积1:3.3组成。
[0021] 本发明提供的由肝素和乙二胺四乙酸二钾按一定重量比组成的抗凝剂可以有效 的防止骨髓细胞出现凝块，能有效维持骨髓细胞的形态，使骨髓细胞分布更均匀，有利于骨 髓细胞的分类，大大的提高了骨髓细胞学检测的准确性。
[0022] 进一步地，本发明提供的浸染色法具有操作简单、方便，质量易于控制的优点，而 且制备得到的涂片着色均匀，细胞着色后鲜艳、匀称、结构清晰，细胞浆颜色及透明度能反 应各类各期细胞的相应特性，细胞浆与细胞核着色的对比度好，是一种较为理想的骨髓液 涂片的制备方法。
[0023]进一步地，本发明提供的浸染法染色100张骨髓涂片用时，耗时80min，消耗染液 40ml，而传统的滴染染色100张骨髓涂片用时，耗时155min，消耗染液160ml，与传统的滴染 法相比，本发明的浸染法在染色100张骨髓涂片时，可以节省48%的时间，节约75%的染液。 进一步地，经试验发现，对两种方法染色的100张骨髓涂片进行严格的效果评估，滴染法涂 片的合格率为93%。浸染法涂片的合格率为97%，说明本发明提供的浸染法是一种操作简 单、染色质量高的染色方法。
[0024] 与现有技术相比，本发明提供的骨髓液涂片的制备方法具有以下优势：
[0025] (1)本发明提供的骨髓液涂片的制备方法能有效维持骨髓细胞的形态，使骨髓细 胞分布更均匀，有利于骨髓细胞的分类，大大的提高了骨髓细胞学检测的准确性；
[0026] (2)本发明提供的骨髓液涂片的制备方法具有操作简单、方便，质量易于控制的优 点，而且涂片着色均匀，细胞着色后鲜艳、匀称、结构清晰，细胞浆颜色及透明度能反应各类 各期细胞的相应特性，细胞浆与细胞核着色的对比度好，是一种较为理想的骨髓液涂片的 制备方法。
[0027] (3)本发明提供的骨髓液涂片的制备方法的浸染法可以对染料、缓冲液进行精确 定量，可以显著的减少标本染色质量的批间差异及不同操作人员对染色结果的影响即提高 标本染色的整体合格率。
【附图说明】 图1为实施例2制备的骨髓涂片的显微镜图； 图2为对比例5制备的骨髓涂片的显微镜图。
【具体实施方式】：
[0028] 以下通过【具体实施方式】的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限 制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本 发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0029] 实施例1、一种骨髓液涂片的制备
[0030] S1抽取骨髓液，加入骨髓液体积的0.2%，浓度为浓度为2mg/ml的抗凝剂反应35s， 所述抗凝剂由肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:2组成，得抗凝骨髓液；
[0031] S2取5yL步骤S1得到抗凝骨髓液滴到载玻片的一端，用推玻片将骨髓液涂成薄片， 所述推玻片与载玻片的角度为35°，得涂片；
[0032] S3将步骤S2得到的涂片排列在玻片架上，将玻片架放入染色缸I内固定lmin，所述 染色缸I内为染色液，所述染色液是取瑞氏染粉lg，姬姆萨染粉0.3g，加入500ml甲醇中，再 加入10ml甘油混匀，将配置好的染色液放置37°C水浴箱内孵育1天，并在常温下存放6天制 备得到；
[0033] S4将步骤S3处理过的玻片架转入染色缸II内染色25min;所述染色缸II内为染色 液与缓冲液的混合液，所述染色液与缓冲液的混合液是将30ml质量浓度为1 %的磷酸二氢 钾溶液与20ml质量浓度为1 %的磷酸氢二钠溶液混匀，并加入950ml的蒸馏水混匀，得缓冲 液;将缓冲液与步骤S3制备得到的染色液按体积1:3混合均匀，得染色液与缓冲液的混合 液；
[0034] S5将步骤S4处理后的玻片冲洗8s，干燥，即得。
[0035]实施例2、一种骨髓液涂片的制备
[0036] S1抽取骨髓液，加入骨髓液体积的0.2%，浓度为浓度为3mg/ml的抗凝剂反应45s， 所述抗凝剂由肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:3组成，得抗凝骨髓液；
[0037] S2取6yL步骤S1得到抗凝骨髓液滴到载玻片的一端，用推玻片将骨髓液涂成薄片， 所述推玻片与载玻片的角度为35°，得涂片；
[0038] S3将步骤S2得到的涂片排列在玻片架上，将玻片架放入染色缸I内固定2min，所述 染色缸I内为染色液，所述染色液是取瑞氏染粉lg，姬姆萨染粉0.3g，加入500ml甲醇中，再 加入10ml甘油混匀，将配置好的染色液放置37°C水浴箱内孵育1天，并在常温下存放7天制 备得到；
[0039] S4将步骤S3处理过的玻片架转入染色缸II内染色30min;所述染色缸II内为染色 液与缓冲液的混合液，所述染色液与缓冲液的混合液是将30ml质量浓度为1 %的磷酸二氢 钾溶液与20ml质量浓度为1 %的磷酸氢二钠溶液混匀，并加入950ml的蒸馏水混匀，得缓冲 液;将缓冲液与步骤S3制备得到的染色液按体积1:3.3混合均匀，得染色液与缓冲液的混合 液；
[0040] S5将步骤S4处理后的玻片冲洗10s，干燥，即得。
[0041] 实施例3、一种骨髓液涂片的制备
[0042] S1抽取骨髓液，加入骨髓液体积的0.3%，浓度为浓度为4mg/ml的抗凝剂反应55s， 所述抗凝剂由肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:4组成，得抗凝骨髓液；
[0043] S2取7yL步骤S1得到抗凝骨髓液滴到载玻片的一端，用推玻片将骨髓液涂成薄片， 所述推玻片与载玻片的角度为35°，得涂片；
[0044] S3将步骤S2得到的涂片排列在玻片架上，将玻片架放入染色缸I内固定3min，所述 染色缸I内为染色液，所述染色液是取瑞氏染粉lg，姬姆萨染粉0.3g，加入500ml甲醇中，再 加入10ml甘油混匀，将配置好的染色液放置37°C水浴箱内孵育2天，并在常温下存放8天制 备得到；
[0045] S4将步骤S3处理过的玻片架转入染色缸II内染色35min;所述染色缸II内为染色 液与缓冲液的混合液，所述染色液与缓冲液的混合液是将30ml质量浓度为1 %的磷酸二氢 钾溶液与20ml质量浓度为1 %的磷酸氢二钠溶液混匀，并加入950ml的蒸馏水混匀，得缓冲 液;将缓冲液与步骤S3制备得到的染色液按体积1:3.5混合均匀，得染色液与缓冲液的混合 液；
[0046] S5将步骤S4处理后的玻片冲洗12s，干燥，即得。
[0047]对比例1、一种骨髓液涂片的制备
[0048]制备方法的不同：所述步骤S1中的抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾，其余步骤如实施 例2类似。
[0049] 对比例2、一种骨髓液涂片的制备
[0050] 制备方法的不同：所述步骤S1中的抗凝剂由肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1: 1组成，其余步骤如实施例2类似。
[00511对比例3、一种骨髓液涂片的制备
[0052]制备方法的不同：所述步骤S4中的染色液与缓冲液的混合液由缓冲液与染色液按 体积1:2.7混合均匀，其余步骤如实施例2类似。
[0053]对比例4、一种骨髓液涂片的制备
[0054]制备方法的不同：所述步骤S4中的染色液与缓冲液的混合液由缓冲液与染色液按 体积1:3.7混合均匀，其余步骤如实施例2类似。
[0055]对比例5、一种骨髓液涂片的制备
[0056] S1抽取骨髓液，加入骨髓液体积的0.2%，浓度为浓度为3mg/ml的抗凝剂反应45s， 所述抗凝剂由肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:3组成，得抗凝骨髓液；
[0057] S2取6yL步骤S1得到抗凝骨髓液滴到载玻片的一端，用推玻片将骨髓液涂成薄片， 所述推玻片与载玻片的角度为35°，得涂片；
[0058] S3将步骤S2得到的涂片放平，滴4滴染色液固定2min，所述染色液是取瑞氏染粉 lg，姬姆萨染粉〇. 3g，加入500ml甲醇中，再加入10ml甘油混匀，将配置好的染色液放置37°C 水浴箱内孵育1天，并在常温下存放7天制备得到；
[0059] S4将步骤S3处理过的涂片加入等量的缓冲液，混合均匀，染色30min，所述缓冲液 是将30ml质量浓度为1 %的磷酸二氢钾溶液与20ml质量浓度为1 %的磷酸氢二钠溶液混匀， 并加入950ml的蒸馏水混匀制备得到；
[0060] S5将步骤S4处理后的玻片冲洗10s，干燥，即得。
[0061]试验例一、骨髓液涂片的质量检测试验
[0062] 1、试验材料:实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和 对比例5制备得到的骨髓液涂片。
[0063] 2、试验方法：
[0064] 对实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5制 备得到的骨髓液涂片进行显微镜观察。
[0065] 3 ?试验结果：
[0066]试验结果如表1所示。
[0067]表1骨髓液涂片的质量检测试验
[0070]由表1可知，本发明实施例1 -3制备得到的骨髓液涂片细胞分布均匀，无重叠;细胞 着色均匀，涂片背景清晰;细胞结构清晰，匀称，细胞浆与细胞核着色的对比度好;无沉渣颗 粒，是一种较为理想的骨髓液涂片。而对比例1-5制备得到的骨髓液涂片质量均比本发明实 施例1-3制备的骨髓液涂片质量差，说明本发明提供的骨髓液涂片制备方法制备的骨髓液 涂片效果好，大大的提高了骨髓细胞学检查的准确度。
[0071 ]试验例二、骨髓液涂片中的滴染法和浸染法的对比试验 [0072 ] 1、试验材料:实施例2和对比例5制备的骨髓液涂片。
[0073] 2、试验方法:对实施例2和对比例5制备的骨髓液涂片进行显微镜检查，并进行拍 照。
[0074] 2、试验结果
[0075]试验结果如图1和图2所示，其中图1为实施例2制备的骨髓涂片，图2为对比例5制 备的骨髓涂片。从涂片可知，图片1中的骨髓液细胞分布均匀，无重叠;细胞着色均匀，涂片 背景清晰;细胞结构清晰，匀称，细胞浆与细胞核着色的对比度好;无沉渣颗粒。与图2相比， 图1中的细胞分布更均匀，无重叠，细胞核染色质更加清晰，细胞着色更加鲜艳，更有利于骨 髓细胞学的检查，可以大大提高骨髓细胞学检查的准确度。
【主权项】
1. 一种骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1抽取骨髓液，加入骨髓液体积的0.2-0.3 %的抗凝剂反应30-60S，得抗凝骨髓液； S2将步骤S1得到抗凝骨髓液滴到载玻片的一端，用推玻片将骨髓液涂成薄片，得涂片； S3将步骤S2得到的涂片排列在玻片架上，将玻片架放入染色缸I内固定l-3min，所述染 色缸I内为染色液； S4将步骤S3处理过的玻片架转入染色缸II内染色25-35min;所述染色缸II内为染色液 与缓冲液的混合液； S5将步骤S4处理后的玻片冲洗5-15s，干燥，即得。2. 如权利要求1所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的抗凝剂的 浓度为2_4mg/ml。3. 如权利要求1所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的抗凝剂由 肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:2-4组成。4. 如权利要求3所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的抗凝剂由 肝素和乙二胺四乙酸二钾按重量比1:3组成。5. 如权利要求1所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的抗凝骨髓 液的添加量为5-7yL，所述推玻片与载玻片的角度为35°。6. 如权利要求1所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的染色液的 制备方法为： 取瑞氏染粉lg，姬姆萨染粉〇.3g，加入500ml甲醇中，再加入10ml甘油混匀，将配置好的 染色液放置37°C水浴箱内孵育1-2天，并在常温下存放6-8天，即得。7. 如权利要求1所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的染色液与 缓冲液的混合液的制备方法： 将30ml质量浓度为1 %的磷酸二氢钾溶液与20ml质量浓度为1 %的磷酸氢二钠溶液混 匀，并加入950ml的蒸馏水混匀，得缓冲液;将缓冲液与权利要求6制备得到的染色液混合均 匀，得染色液与缓冲液混合液。8. 如权利要求7所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述染色液与缓冲液的混 合液由染色液和缓冲液按体积1:3-3.5组成。9. 如权利要求8所述的骨髓液涂片的制备方法，其特征在于，所述染色液与缓冲液的混 合液由染色液和缓冲液按体积1:3.3组成。
【文档编号】G01N1/30GK106053167SQ201610333190
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】王茂书, 欧阳小峰, 彭宇
【申请人】四川金域医学检验中心有限公司