一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及α_醋酸萘酚酯酶(α-ΝΑΕ)染色液（化学染色 法），即一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒。
【背景技术】
[0002] 细胞化学染色技术是结合细胞学和化学，以形态学为基础，通过化学染色处理，在 显微镜下对细胞内的酶类、脂类、糖类、蛋白质、核酸等成分进行定性、定量、定位分析的一 种技术。该技术应用于血液和骨髓涂片及淋巴结组织切片，在血细胞的识别、血液病诊断和 鉴别诊断中发挥重要的作用。目前，常用的与血液系统疾病有关的细胞化学染色有过氧化 物酶染色、糖原染色、酯酶染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色及铁染色等。
[0003] 单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，前髓细胞是单核细胞的前体。单核细胞作 为血液中的清道夫细胞，具有活跃的吞噬或卷入外来物如细菌等，并将其清除的作用。单核 细胞数量的增多见于血液紊乱(如急性或慢性感染）、热带疾病(如梅毒、锥虫病、肺结核）、 骨髓增生异常疾病及单核细胞系白血病等。
[0004] 与其他血细胞比较，单核细胞内含有更多的非特异性酯酶。非特异性酯酶是血细 胞中作用于短链脂肪酸的酯酶。根据酯酶水解的底物不同，血细胞中常见酯酶包括醋酸 萘酸酯酶( a_naphthol acetate esterace ,α-NAE)、乙酸AS-D萘酸酯酶、醋酸AS萘酸酯酶、 氯化醋酸AS-D萘酚酯酶等。非特异性酯酶α-ΝΑΕ主要存在于单核系细胞中，被称之为单核细 胞型酯酶，其活性测定及氟化钠 (NaF)抑制试验主要用于急性单核细胞白血病与急性粒细 胞白血病的鉴别，对诊断单核细胞相关疾病具有重要作用。
[0005] 采用化学染色法对血细胞中α-醋酸萘酚酯酶进行染色测定，其原理是α-ΝΑΕ能将 基质液中的醋酸萘酚水解，产生α-萘酚，再与重氮染料偶联，形成不溶性的有色沉淀，定 位于胞质内酶活性处，沉淀物显色的深浅与α-ΝΑΕ活性呈正比。因所用的重氮盐不同，阳性 反应的沉淀可分灰黑色或棕黑色。α-ΝΑΕ在正常单核-吞噬细胞系统中含量较高，可呈阳性 或强阳性反应，且可被NaF抑制。正常粒细胞部分呈弱阳性或阳性反应，但不被NaF所抑制。 正常幼红细胞、巨核细胞、部分淋巴细胞均能见到弱阳性。在白血病细胞的FAB亚型分型中， 依据阳性反应及NaF抑制率可鉴定M1-M5可能性。
[0006] 在现有的血细胞α-ΝΑΕ染色中，重氮染料常使用坚固蓝B盐、固紫盐等，使用甲基绿 或苏木素进行复染，单核细胞的α-ΝΑΕ活性表现为强阳性，而未成熟粒细胞如myelocytes和 metamyelocy tes也能显示阳性反应，早幼粒细胞白血病(M3)阳性强度可比急性单核细胞白 血病(M5 )、急性粒-单核细胞白血病(M4)更高。现有染色方法可以观察α-ΝΑΕ活性强弱，但在 急性白血病分型时，现有染色方法难以直接区分单核细胞和早幼粒细胞，需要通过NaF抑制 试验来区分单核细胞系和粒细胞系白血病，而NaF抑制率大小的判断受人为主观因素影响 较大，常给白血病分型和鉴别带来一定困扰。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供α-醋酸萘酚酯酶(α-ΝΑΕ)染色液(化学染色法）， 即醋酸萘酚酯酶染色试剂盒，使所述试剂盒应用于检测时能够根据细胞核染后的颜色区 分出单核细胞和早幼粒细胞，无需经NaF抑制试验即可快速辅助诊断出单核细胞白血病和 粒细胞白血病。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒，使所述试剂盒应 用于检测时缩短染色时间，提高检测效率。
[0009 ]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0010] -种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒，包括固定液、α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶 液、缓冲液及漂洗液，所述偶氮染料溶液为碱性蓝54水溶液。
[0011] 针对现有α-ΝΑΕ染色法无法区分单核细胞和早幼粒细胞，需要额外借助NaF抑制试 验诊断单核细胞白血病和粒细胞白血病以及检测过程中染色时间过长的缺陷，本发明选择 碱性蓝54作为本发明试剂盒的偶氮染料，碱性蓝54具有如下化学结构：
[0012]
[0013] 在现w万法中，里m染科芾便用竖回监B盐、回紫盐等，最后处米用甲基绿或苏木 素复染，本发明采用水溶性季偶氮染料碱性蓝54,不仅能与细胞内酯酶水解产物α-萘酚产 生黑色沉淀，还可以将单核细胞的细胞核染成红紫色，而其他细胞如粒细胞、淋巴细胞等的 细胞核为棕色或深棕色，从而能够更直观、更准确地显示、鉴别出单核细胞，并消除粒细胞 对单核细胞系鉴别的干扰影响，同时无需进行复染程序。
[0014] 在本发明所述试剂盒中，所述固定液可以采用同类方法或试剂盒中常用的固定 液，例如甲醛类的固定液，而本发明给出了采用甲醛-丙酮磷酸盐缓冲液作为固定液优选方 案，其pH值范围为6.0-7.0，在本发明的【具体实施方式】中该pH值可以具体选择为6.6。更为优 选地，所述固定液中的磷酸盐缓冲液以Na 2HP〇4 · 12H20、KH2P〇4来配制，继而再和甲醛、丙酮 混合配制。更为优选地，固定液中甲醛和丙酮的体积比为5:9。
[0015] 本发明试剂盒中的α_醋酸萘酚酯溶液优选采用α_醋酸萘酚酯的丙酮水溶液，其中 醋酸萘酚酯质量体积百分比浓度为0.5-1.5 % (α-醋酸萘酚酯质量/α-醋酸萘酚酯溶液体 积的百分比），丙酮体积百分比浓度为40%_60% (丙酮体积/α-醋酸萘酚酯溶液体积的百分 比）。在本发明具体的实施方式中，α-醋酸萘酚酯质量体积百分比浓度为1.0%，例如100mg 醋酸萘酚酯溶于10mL丙酮水溶液中即为1.0%浓度，其他类似的描述方式均可换算成α-醋酸萘酚酯质量体积百分比浓度;而丙酮体积百分比浓度在【具体实施方式】中为50%。
[0016] 本发明所述碱性蓝54水溶液中碱性蓝54质量体积百分比浓度为0.5-5.0% (碱性 蓝54质量/碱性蓝54水溶液体积的百分比）。在本发明的【具体实施方式】中碱性蓝54质量体积 百分比浓度为3.0%，例如300mg碱性蓝54溶于10ml蒸馏水即为3.0%浓度，其他类似的描述 方式均可换算成碱性蓝54质量体积百分比浓度。
[0017] 本发明所述缓冲液也叫基础液，优选采用磷酸盐缓冲液，摩尔浓度为0.04-0.08M， pH值为7.0-8.0。在本发明的【具体实施方式】中，所述缓冲液为pH7.6的0.067M磷酸盐缓冲液， 以Na2HP〇4 · 12Η20、ΚΗ2Ρ〇4来配制。
[0018] 本发明所述漂洗液优选酸性缓冲液，可选自醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸 钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中的一种，摩尔浓度可选择为〇. 05Μ-0.15Μ，ρΗ 值范围为2.0~6.0。在本发明的【具体实施方式】中，所述漂洗液为ρΗ3.6的0.1Μ醋酸-醋酸钠 缓冲液。
[0019] 以本发明提供的试剂盒进行α-ME染色时的步骤可参照如下：
[0020] 步骤1:取干燥的新鲜血涂片标本，滴加固定液5~8滴，盖满血膜即可，（4°C )30s， 水洗；
[0021] 步骤2:将试剂盒中α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶液置入缓冲液中，混匀后即为 基质液，将涂片置入基质液中，37°C染色20min后，吸水纸吸掉多余的染料；
[0022] 步骤3:染色的血涂片置入漂洗液2s后，立即用吸水纸吸干漂洗液，血涂片用水漂 洗3次，待干后即可进行镜检。
[0023]上述步骤2中所述基质液中α-醋酸萘酚酯的参考浓度为0.1-0.5mg/mL，碱性蓝54 与α_醋酸萘酚酯的参考摩尔浓度比为1:1~4:1，但不仅限于上述所述参考浓度和比例，可 视具体检测环境调整。
[0024]以本发明提供的试剂盒检测急性单核细胞白血病(Μ5)和急性早幼粒细胞白血病 (M3)患者血细胞，镜检结果显示Μ5型白血病血细胞中单核细胞系细胞核为亮红紫色，细胞 质为红紫色，且单核细胞内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀;M3型白血病血细胞中早 幼粒细胞系细胞核为棕色或深棕色，胞质内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀。检测结 果表明本发明试剂盒染色后镜检可以直接区分单核细胞和早幼粒细胞。
[0025]而采用现有的α-ΝΑΕ染色方法时，Μ5型白血病血细胞中单核细胞系细胞核为绿色， 单核细胞内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色沉淀;M3型白血病血细胞中早幼粒细胞系细胞核为 绿色，胞质内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀。检测结果表明现有的方法无法直接区 分单核细胞和早幼粒细胞，需要借助NaF抑制试验进一步区分。