一种利用纤维素水解液合成生物基化学品的恶臭假单胞菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用纤维素水解液合成生物基化学品的恶臭假单胞菌及其应用，该菌株可以利用木质纤维素水解液发酵生产生物基化学品，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.8027。该菌株具有很好的木质纤维素水解液耐受性，能够高效的直接利用木质纤维素水解液，可作为宿主通过代谢工程改造生产生物基化学品甲羟戊酸等。
【专利说明】—种利用纤维素水解液合成生物基化学品的恶臭假单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于合成生物基化学品的恶臭假单胞菌，具体涉及恶臭假单胞菌利用纤维类生物质水解液发酵生产生物基化学品。
【背景技术】
[0002]随着生物化工技术的发展，大量的生物基化学品的代谢途径在菌宿主内构建，以实现该化学品的生物合成，并因为生物基化学品的高附加值受到了生物化工学家的青睐。生物化工中存在的一个重要的问题是原料的价格。在木质纤维素稀酸水解技术能够有效的降低发酵原料的成本，但是产物中会形成多种发酵抑制剂，如糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物等。此外还有大量的有机废水都是以化学氧化或者生物氧化的方式处理掉，在处理过程中并没有实现废水可利用成分的再利用。寻找具有有毒物质耐受性的宿主菌是目前生物化工行业的一个重要突破口。
[0003]随着合成生物学的发展，越来越多的菌株被用作宿主应用于生物化工领域，其中包括明星宿主大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等。此外，一些新宿主也被人们开发并应用与生物合成领域如，乳酸菌、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2442等。大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等常规宿主菌具有遗传背景清晰的优点，但是其有毒物质的耐受性不足也成为它们在废弃物生物质利用中的一个瓶颈。1.4g/L的醋酸能够对酿酒酵母产生50%生长抑制，而对乙酸耐受性较好的菌株树干毕赤酵母在含有lg/L的糠醛的发酵液中生长速度能够被抑制50%以上。1.0g/L的肉桂醛能够完全抑制酿酒酵母的生长，0.4g/L的对羟基苯甲醛能够抑制克氏肺炎杆菌生长速度的50%等。由于木质纤维素烯酸水解液中含有各种有毒物质，缺乏对其耐受性较好的菌株。恶臭假单胞菌是一种有机物有毒物质耐受性菌株，能够有效的利用糠醛及芳香族化合物，常作为有机废液处理及环境修复的模式菌株。但是，利用对木质纤维素水解液和有机废液具有耐受性的恶臭假单胞菌合成生物基化学品的研究还比较少。
【发明内容】
[0004]本发明针对目前生物基化学品合成领域中宿主菌不能满足利用木质纤维素水解液、有机废液发酵的不足，提供一种不受纤维素水解液抑制的假单胞菌，该菌株能够通过代谢工程改造，利用该木质纤维素水解液生产生物基化学品甲羟戊酸。
[0005]该菌株命名为qibebt-2已于2013年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8027，建议分类命名为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明涉及的以纤维素水解液作为碳源的假单胞菌是从染料废水处理好氧污泥中通过选择性培养基分离得到的。
[0006]本发明涉及的能够利用木质纤维素水解液作为碳源合成生物基化学品的恶臭假单胞菌具有如下生物学特征:
[0007]该菌株在LB固体培养基中生长迅速。
[0008]上述LB培养基的配方:蛋白胨9~llg/L，酵母粉4.5~5.5g/L，氯化钠I~4g/L, ρΗ7.0 ~7.5，112°C灭菌 30 分钟。
[0009]上述恶臭假单胞菌菌株的经通用引物PCR获得16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所
[0010]其中上述PCR 的引物为引物为 fDl:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，rP2:CGGCTACCTTGTTACGACTT。
[0011]本发明涉及的能够在木质纤维素水解液作为碳源的培养基里快速生长生产生物基化学品，培养时间为15~24小时，摇床转速为120~180转/分钟。
[0012]木质纤维素水解液培养基通过如下方法获得:IL烧杯中加入450mL蒸馏水和下各成份将其溶解于水中NH4Cl 0.3~0.5g，Na2HPO4 2~3g，KH2PO4 I~2g用IM NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至450~550mL灭菌，获得培养基成分A ;制备以下溶液各IOOmL:1MMgSO4.7H20 ；20%(w/v)木质纤维素烯酸水解液；1M CaCl2 ；40%的葡萄糖水溶液。
[0013]在无菌情况下把ImL MgS047H20(lM)和ImL氯化韩(IM), 40~60mL木质纤维素烯酸水解液添加到培养基成分A中，配置成纤维素水解液培养基。
[0014]另外，在无菌情况下把ImL MgS047H20(lM)和ImL氯化钙(IM)，20~30mL葡萄糖水溶液添加到培养基成分A中，配置成含葡萄糖培养基。
[0015]纤维素水解液制备方法:纤维素水解液的制备:利用20~40目的秸杆粉碎物按照40~60g/L用蒸馏水浸泡，添加0.5~1.5%的硫酸中，90~100°C水解2~4小时，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用NaOH调节pH值和浓度至含糖量至18~22%后，用做发酵用的碳源。
[0016]上述木质纤维素水解液培养基的灭菌条件为112°C灭菌30分钟。
[0017]本发明有益效果如下:
[0018]I)该恶臭假单胞菌能够利用木质纤维素水解液作为碳源的培养基上快速生长。
[0019]2)该恶臭假单胞菌能够作为宿主构建生产生物基化学品的工程菌株。
[0020]3)本发明提供的利用恶臭假单胞菌生产的生物基化学品的生产方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1纤维素水解液对恶臭假单胞菌与大肠杆菌的影响；
[0022](A，纤维素水解液对于恶臭假单胞菌生长影响；B，纤维素水解液对于大肠杆菌生长影响)。
[0023]图2pUCP18-mvaE_mvaS 质粒图谱。
[0024]图3甲羟戊酸气相检测图谱。
【具体实施方式】
[0025]实施例一:菌株筛选
[0026]木质纤维素水解液培养基通过如下方法获得:1L烧杯中加入450mL蒸馏水和下各成份将其溶解于水中NH4Cl 0.3-0.5g，Na2HPO4 2~3g，KH2PO4 I~2g用IM NaOH调整pH到7.4并将整体积调整至450~550mL灭菌，获得培养基成分A ;制备以下溶液各IOOmL:1MMgSO4.7H20 ；20%(w/v)木质纤维素烯酸水解液；1M CaCl2 ；40%的葡萄糖水溶液。
[0027]在无菌情况下把ImL MgS047H20 (IM)和ImL氯化钙(IM)，40~60mL木质纤维素烯酸水解液添加到培养基成分A中，配置成纤维素水解液培养基。
[0028]另外，在无菌情况下把ImL MgS047H20 (IM)和ImL氯化钙(IM), 20~30mL葡萄糖水溶液添加到培养基成分A中，配置成含葡萄糖培养基。
[0029]纤维素水解液制备方法:纤维素水解液的制备:利用20~40目的秸杆粉碎物按照40~60g/L用蒸馏水浸泡，添加0.5~1.5%的硫酸中，90~100°C水解2~4小时，过滤除去剩余物，离心除残渣后，利用NaOH调节pH值和浓度至含糖量至18~22%后，用做发酵用的碳源。
[0030]取土样按照Ig样品IOml水溶解，将水样置于室温24小时活化然后用无菌吸管从此试管中吸取Iml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10'10_2、10'10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤。
[0031]取不同浓度的稀释土壤菌液涂布到以添加木质纤维素水解液作为碳源的平板上，培养72小时后挑取单菌落进行液体培养。液体培养12~24小时对比其对木质纤维素烯酸水解液的耐受性。经筛选获得5株对木质纤维素水解液抗性较好的菌株进行进一步三角瓶发酵验证。
[0032]实施例二:菌株16S rDNA鉴定
[0033]LB培养基:蛋白胨9~l lg/L,酵母粉4.5~5.5g/L，氯化钠I~4g/L, ρΗ7.0~
7.5，112°C灭菌30分钟。
[0034]LA培养基:在LB培养基中添加50 μ g到100 μ g氨苄青霉素。
[0035]LB/LA固体培养基:在上述LB/LA培养基中添加1.5%的琼脂。
[0036]TAE:50 倍 tris-acetate - EDTA(2M tris-acetate, 0.05M EDTA, pH8.3)。
[0037]琼脂糖电泳凝胶:I倍TAE电泳缓冲液添加0.8~1.2%的琼脂糖凝胶。
[0038]基因组DNA的提取，在LB液体培养基中生长的菌体(约12~24小时)离心。提取基因组DNA，然后用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的电泳检测。经检测合格的DNA进行PCR基因扩增，PCR采用的引物为fD1: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, rP2:CGGCTACCTTGTTACGACTT ；PCR模板DNA添加0.5 μ I调节到合适浓度，引物浓度为0.4 μ Μ，dNTP浓度为0.2mM, DNA聚合酶大约2.5U，反应总体积50 μ 1，变性温度为94°C，退火温度为55°C，延伸温度72°C，共30个循环。PCR产物约为1.5kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，经PCR扩增得到的DNA电泳检测后连接到PMD18-T转化大肠杆菌，转化的DH5a菌株经过添加LA (Luria-Bertani培养基添加50mg氨苄青霉素)培养基筛选后，提取质粒进行电泳验证，将正确质粒进行测序。
[0039]将本发明的菌株肠杆菌的16S rDNA序列与GenBank中已登录的16S rDNA序列进行同源比较，其16S rDNA序列。结合该菌的形态学观察:该菌为革兰阴性杆菌，有些菌株为卵圆形，单端丛毛菌，运动活泼。专性需氧，最适生长温度25°C~30°C，不产绿脓素。鉴定为恶臭假单胞菌。
[0040]实施例三:纤维素水解液耐受性的验证[0041]所述葡萄糖为碳源的培养基如实施例一所示，将碳源由纤维素水解液替换为葡萄糖，终浓度为10g/L。
[0042]挑取筛选获得的木质纤维素水解液耐受性菌株，接种于装有2ml LB培养基的试管中，生长到菌体密度为0D600大约I左右时接种于装有50ml以木质纤维素水解液作为唯一碳源的250ml的摇瓶中，120转每分钟的摇床中，37°C培养。
[0043]每隔lh,3h,5h,7h,9h, Ilh测定菌株的生长速度,对比与对照菌株在木质纤维素水解液作为碳源的培养基里生长速度(图1)。结果表明，木质纤维素水解液能够强烈抑制大肠杆菌的生长，而经筛选获得的恶臭假单胞菌在木质纤维素水解液为碳源的培养基上的生长速度高于葡萄糖为碳源的培养基上的生长速度。
[0044]恶臭假单胞菌在葡萄糖为唯一碳源培养基中为0D_为0.6~0.8，在纤维素水解液为唯一碳源培养基中OD6tltl为为0.8~1.2 ;大肠杆菌在葡萄糖为唯一碳源培养基中0D_为1.2~1.6，在纤维素水解液为唯一碳源培养基中OD6tltl为为0.05~0.1。
[0045]实施例四:生物基化学品生产菌株的构建与验证
[0046]感受态制备:(I).取恶臭假单胞菌单菌落于LB试管中培养，待其0D_分别为约
0.3转接三角瓶接种量约为1% ;待摇瓶中0D600长至小于0.4~0.6时进行感受态细胞制备。感受态细胞制备方法(塔卡拉感受态制备试剂盒Competent Cell Preparetion kit):取菌液Iml于1.5ml Microtube (无菌)中;4，OOOrmp, 4°C离心5min,弃上清(尽量弃尽)；重复上述沉淀菌体步骤，直至获得合适量的菌体；同样条件下离心，用无菌枪尖将残余上清吸净；在Microtube中加100 μ I冰中预冷的Solution A,用枪尖吹打沉淀,使其均匀悬浮；
4,OOOrmp, 4°C离心5min,用200 μ I枪尖吸净上清；在Microtube中加入100 μ I冰中预冷的Solution B，用枪尖吹打沉淀，使其均匀悬浮；感受态细胞制作完成，可直接用于DNA转化，也可于-80°C保存。
[0047]质粒构建:利用甲羟戊酸合成相关蛋白羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，可来源于动物、植物以及细菌等生物体，更优选为来自产气肠球菌(Enterococcus faecalis)的甲轻戍酸代谢途径的上游途径的相关蛋白的HMG-CoA合成酶基因mvaS (G1:9937382)和HMG-CoA还原酶基因mvaE (G1:9937382)。利用连接到商品化质粒pUCP 18连接到Eco RI和Hin dill酶切位点。
[0048]转化:将_80°C保存的感受态细胞置于冰中融化IOmin ;取100 μ I的感受态细胞移至新的转化管中；想感受态细胞中加入7μ I的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30min ；42°C水浴中热激90s后，立即于冰中放置3-5min ;加入450 μ 137°C预温的LB培养基；37°C振荡培养Ih ;分别取20μ 1、50μ 1、100μ 1、200μ I涂平板后，将平板倒置于37°C培养箱中培养过夜。
[0049]三角瓶培养
[0050]上述菌株接种到以纤维素水解液为碳源的培养基中培养，菌液0D600至0.5左右时，补加20%的IPTG诱导，至终浓度为0.05~0.25mM。将摇瓶转入28~37°C、100~160rpm摇瓶中培养12~24h,利用气相-质谱测定甲轻戍酸。
[0051]产物测定
[0052]不同发酵时间样品5ml, 6500rpm离心IOmin,剩余上清用3M HCl酸化至pH2,45°C水浴lh，以便甲羟戊酸内酯的形成。取出温浴后样品，加2.5g无水Na2SO4饱和溶液，加入IOml乙酸乙酯，漩涡震荡5min，静置至样品分层，上层为乙酸乙酯层，取溶剂层GC检测甲羟戊酸的产生。
[0053]GC条件:分离柱型号RTX1701毛细管柱(30*0.32mm)，载气恒流lml/min，进样口温度 250°C。柱升温程序:75°C，0.5min，25°C /min tol50°C, 15°C /min to200°C,30°C /minto250°C，250°C 5min，FID检测器温度280°C。经检测有甲羟戊酸产生(图3)，甲羟戊酸产量为 0.5 ~L 5mg/L。`
【权利要求】
1.一种恶臭假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC N0.8027。
2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌，其特征在于，16SrDNA序列如SEQ ID N0.1所/Jn ο
3.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌，其特征在于，该菌株具有如下生物学特征:菌株在LB固体平板培养基上菌落特点该菌为革兰阴性杆菌，有些菌株为卵圆形，单端丛毛菌，运动活泼，专性需氧，最适生长温度25°C~30°C，不产绿脓素。
4.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌，其特征在于，该菌株可以在木质纤维素水解液作为碳源的培养基中生长。
5.如权利要求4所述的恶臭假单胞菌，其特征在于，所述木质纤维素水解液是利用秸杆粉碎物，在硫酸中水解，过滤除去剩余物，除残渣后，利用NaOH调节pH值得到的水解液。
6.权利要求1所述恶臭假单胞菌在合成生物基化学品中的应用。
7.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将外源基因导入权利要求1所述恶臭假单胞菌，利用重组恶臭假单胞菌发酵生产生物基化学品。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将与合成甲羟戊酸相关基因导入恶臭假单胞菌，重组恶臭假单胞菌利用木质纤维水解液为碳源合成甲羟戊酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，是通过质粒pUCP18将羟甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因导入恶臭假单胞菌得到重组菌，重组菌在以木质纤维水解液为碳源的培养基中发酵生产甲羟戊酸。
10.如权利要求8或9所述的方`法，其特征在于，所述木质纤维素水解液是利用秸杆粉碎物，在硫酸中水解，过滤除去剩余物，除残渣后，利用NaOH调节pH值得到的水解液。
【文档编号】C12P7/42GK103571774SQ201310474455
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】咸漠, 张海波, 冯德鑫, 冯璐 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所