用于木质纤维素和相关低聚物的水解的β-葡糖苷酶的表达的制作方法
【专利说明】用于木质纤维素和相关低聚物的水解的（3-葡糖昔酶的表 达
[0001] 发巧背景
[0002] 普遍认为木质纤维素生物质是有希望的用于生产可再生燃料和化学品的原料来 源。妨碍由生物质原料更广泛产生能量的主要障碍是普遍缺少克服运些材料转化成有用的 燃料的抗降解性的低成本技术。木质纤维素生物质包含碳水化合物组分（例如，纤维素和 半纤维素），其可转化成乙醇。为了转化运些组分，纤维素和半纤维素必须最终转化或水解 成单糖；历史上已经证明该水解是有问题的。
[0003] 生物介导的工艺有希望用于能量转化，尤其是用于将木质纤维素生物质转化成燃 料。设及酶或微生物水解的生物质加工方案通常设及四种生物介导的转化：（1)产生糖解 酶（纤维素酶和半纤维素酶）；(2)将预处理的生物质中存在的碳水化合物组分水解成糖； (3) 发酵己糖（例如，葡萄糖、甘露糖和半乳糖）；和（4)发酵戊糖（例如，木糖和阿拉伯 糖）。运四种转化发生在被称为联合生物加工（CB巧的工艺配置中的单个步骤中，其与其他 较不高度整合的配置的区别在于其不设及用于纤维素酶和/或半纤维素酶生产的专用加 工步骤。与特征为专用纤维素酶生产的工艺相比，CBP提供更低的成本和更高效率的潜力。 运些益处的部分原因是避免了资本成本、底物和其他原料和与纤维素酶生产相关的设备。
[0004] 烘赔酵母（酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)或酿酒酵母 (S.cerevisiae))仍然是用于生产乙醇的优选微生物（VanZ}d等，Adv.Biochem.化邑. Biotechnol. 108:205-235,2007)。有利于该微生物的属性是（i)接近理论产率的高产率 (0.51克产生的乙醇/克使用的葡萄糖），（ii)高渗透和乙醇耐受，（iii)工业过程中的天 然稳健性，（iv)由于其与葡萄酒和面包制作W及啤酒酿造的长期关联而通常被视为安全的 (GRA巧。此外，酿酒酵母显示对源自生物质预处理的水解产物中常见的抑制剂的耐受。酿 酒酵母的主要缺点是其不能使用复杂多糖，如纤维素，或其降解产物，如纤维二糖和纤维糊 精。开发能够CBP的微生物比如酿酒酵母的一个策略是通过对它们工程化W表达异源纤维 素酶和/或半纤维素酶系统。 阳0化]天然纤维素降解需要S种主要类型的酶活性。一种类型是内切葡聚糖酶 (1，4-0-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶；酶学委员会巧03. 2. 1.4)。内切葡聚糖酶（Eg或 EG)在无定形纤维素的纤维素多糖链中随机切割，产生不同长度的寡糖并且从而产生新 链末端。另一类型是外切葡聚糖酶。外切葡聚糖酶包括纤维糊精酶（l，4-e-D-葡聚糖 葡聚糖水解酶；EC3. 2. 1. 74)和纤维二糖水解酶（1，4-0 -D-葡聚糖纤维二糖水解酶；EC 3. 2. 1. 91)。外切葡聚糖酶W前进方式作用于纤维素多糖链的还原或非还原末端，释放葡萄 糖（葡聚糖水解酶）或纤维二糖（纤维二糖水解酶）作为主要产物。外切葡聚糖酶也可作 用于微晶纤维素，可能是从微晶结构剥离纤维素链。典型地，外切葡聚糖酶如纤维二糖水解 酶（CBH)具备隧道样活性位点，其可经其末端区域仅接受底物链。运些外切作用CBH酶通 过使纤维素链穿过隧道起作用，其中W连续方式相继去除纤维二糖单位。纤维素链的连续 水解被称为"持续合成能力"。
[0006] 再另一类型是0-葡糖巧酶（0葡萄糖巧葡糖水解酶，0-葡糖巧酶或BGL;EC 3.2. 1.21)。B化在水解包含纤维素或葡萄糖的可溶性低聚物的材料中起重要的作用。已 经报道了B化在水解期间的作用和重要性（参见，例如，Vi化ari等，Adv.Biochem.化g. Biotechnol. ,108:121-145,2007;和趾atia等，Grit.Rev.Biotechnol. ,22:375-407， 2002)。运些酶通常作用于经e1-4型键连接的葡萄糖的可溶性低聚物，包括它们通常具有 最高活性的二聚体（纤维二糖），W及它们通常活性较低的更长链低聚物。已经描述了BGL 结构域的实例并且包括，例如，糖基水解酶家族3n-末端结构域、糖基水解酶家族3c-末端 结构域和纤连蛋白III型样结构域。
[0007] 在结构上，纤维素酶一般由经富含脯氨酸和/或径基氨基酸的连接体区域结合到 纤维素结合模块（CBM)的催化结构域构成。在I型外切葡聚糖酶中，CBM结构域出现在运 些酶的C-末端（该短的结构域形成由2个二硫键稳定的发夹环结构）。在2型CBH中， CBM出现在N-末端。但是，在一些情况下，纤维素酶不包含CBM，并且仅仅包含催化结构域。 运样缺少CBM的纤维素酶的实例包括来自灰腐质霉（Humicolagrisea)，黄抱原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)和黑曲霉（Aspergillusniger)的CBM。Grassick等， 化1\J.Biochem.，271:4495-4506, 2004。
[0008] 在重组DNA技术的帮助下，来自细菌和真菌来源的数个运些异源纤维素酶已经被 转移至酿酒酵母，使得能够降解纤维素衍生物（VanRensburg等，Yeast, 14:67-76,1998)， 或在纤维二糖上生长（VanRooyen等，JBiotech. ,120:284 - 295, 2005;和McBride等， EnzymeMicrob.Techol. 37:93-101，200f5)。
[0009] F'ujita等描述了相关的工作（Appl.Environ.Microbiol.，70:1207-1212, 2004)， 其中固定在酵母细胞表面上的纤维素酶具有明显的限制。首先，化jita等不能使用仅仅表 达重组Bgll和EgII的酵母实现无定形的纤维素的发酵。化jita等方法的第二限制是细胞 必须在标准碳源上预生长至高细胞密度，之后该细胞用于使用无定形的纤维素的乙醇生产 (例如，化jita等使用~15g/L的高生物质载荷实现乙醇生产）。
[0010] 如上所述的，产生乙醇的酵母，如酿酒酵母当在纤维素底物，如预处理的木材上培 养时，需要添加另外的纤维素酶，因为该酵母不产生内源性纤维素酶。已经显示，真菌纤维 素酶如里氏木霉（Trichodermareesei，T.reesei)Cbhl和Cbh2在酵母酿酒酵母中的表达 是有功能的。Den化an等，EnzymeandMicrobialTechnology,40:1291-1299,2007。但 是，酵母中异源表达的纤维素酶的目前表达水平和比活性仍不足W在没有外部添加酶的 情况下实现酵母在纤维素底物上的生长和乙醇生产。尽管研究已经显示可能某些纤维素 酶，如里氏木霉Cbhl当异源表达时具有一些活性，但是仍非常需要改善异源表达的纤维素 酶的比活性，W便达到下述目标：实现能够有效和成本有效地将纤维素底物转化成乙醇的 CBP系统。
[0011] 目前，没有可靠的方式预测哪种纤维素酶将有效地在异源生物体中表达。例如， 尽管有里氏木霉Cbhl和埃默森篮状菌Cbhl都W高水平内源表达的事实，但是运些蛋白质 在酵母中的异源表达产生不同的结果。而且，在类似条件下，埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii，T.emersonii)Cbhl在酵母中的表达明显大于里氏木霉Cbhl在酵母中的表达。 参见第WO2009/138877号国际公开申请。有效的表达可取决于，例如，在异源生物体和纤 维素酶天然生物体中不同的伴侣蛋白。此外，甚至W高水平表达的纤维素酶可能在异源生 物体中不是特别有活性。例如，纤维素酶可在异源宿主生物体中经历与在纤维素酶来源的 天然生物体中不同的翻译后修饰。蛋白质折叠和分泌也可能是异源纤维素酶表达的障碍。 阳〇1引因此，为了解决CBP系统中异源纤维素酶表达的局限，本发明提供了数个B化在宿 主细胞，如酵母酿酒酵母中的表达。表征了B化的表达水平和分泌活性水平。另外，纯化 B化并且测定它们对硬木衍生的预处理固体（C6固体）和硬木衍生的半纤维素液体（巧液 体）的比活性。运样的宿主细胞中相应的B化基因，或其变体和组合良好表达并且获得改 善的表达的B化的比活性。而且，纯化的B化与一种或多种其他纤维素酶，或表达B化的宿 主细胞和一种或多种其他纤维素酶的组合，也获得改善的表达的B化的比活性。因此，运样 的基因和表达系统用于有效和成本有效的CBP系统。 柳1引发巧概沐
[0014] 本发明提供了灰腐质霉（Humicolagrisea)、魏氏假丝酵母（Candida wickerhamii)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、 斜邸青霉（Penicilliumdecumbens)、球毛壳菌（Qiaetomiumglobosum)、瘤胃真菌 (化ocallimastixfrontalis)、汉逊德己利酵母值ebaryomyceshansenii)、马克斯克鲁维 酵母化Iuyveromycesmarxianus)或致病疫霉（Phyto地thorainfestans) 0-葡糖巧酶 度GL)或其片段在宿主细胞中的异源表达。宿主细胞可包括编码BGL的一种或多种多核巧 酸，其具有Q)与沈QIDN0:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30或31-40中的任何一条至少约 90%的同一性，（U)与沈QIDN0:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 或 31-40 中的任何一条 至少约 95% 的同一性，或（iii)与沈QIDN0:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 或 31-40 中 的任何一条相同。宿主细胞可包括编码BGL的一种或多种多核巧酸，所述B化具有（i)与 沈QIDN0:l、4、7、10、13、16、19、22、25或28中的任何一条具有至少约90%的同一性的氨 基酸序列，（ii)与没有信号肤序列的SEQIDN0:l、4、7、10、13、16、19、22、25或28中的任 何一条具有至少约90%的同一性的氨基酸序列，（iU)与沈9IDNO: 1、4、7、10、13、16、19、 22、25或28中的任何一条具有至少约95%的同一性的氨基酸序列，或（iv)与没有信号肤 序列的沈QIDN0:l、4、7、10、13、16、19、22、25或28中的任何一条具有至少约95%的同一 性的氨基酸序列。
[0015] 在本发明的一些实施方案中，B化的片段可W是B化信号肤。信号肤可包括具有 a)与沈QIDN0:2、5、ll、14、17、20、23、26或29中的任何一条至少约90%的同一性的氨 基酸序列，（U)与沈QIDN0:2、5、ll、14、17、20、23、26或29中的任何一条至少约95%的 同一性的氨基酸序列，或（iU)与沈0IDN0:2、5、ll、14、17、20、23、26或29中的任何一条 相同的氨基酸序列。
[0016] 在本发明的一些实施方案中，宿主细胞进一步包括编码异源纤维素酶的一种或 多种另外的多核巧酸。异源纤维素酶可W是木聚糖酶、木糖巧酶、乙酷木聚糖醋酶（AXE)、 内切葡聚糖酶、a-半乳糖巧酶、葡糖巧酶、甘露聚糖酶、a-葡糖醒酸酶、乙酷醋酶、 0-甘露糖巧酶、葡糖醒酸基醋酶或纤维二糖水解酶（CBH)。内切葡聚糖酶可W是烟曲霉 (A.fumigatus)内切葡聚糖酶I、费希新萨托菌（N.fischeri)内切葡聚糖酶III、里氏木霉 内切葡聚糖酶I或家白蚁杞化rmosanus)内切葡聚糖酶I。CBH可W是CB化或CB肥。CBH 也可W是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I、卢克诺文思金抱子菌杞Iucknowense)纤维二 糖水解酶IIb或里氏木霉纤维二糖水解酶II。宿主细胞可进一步包括编码扣囊复膜抱酵 母（S.fibuligera)BGL的多核巧酸。宿主细胞也可进一步包括编码埃默森篮状菌CB化、里 氏木霉CBD、卢克诺文思金抱子菌CB肥、烟曲霉EGl、费希新萨托菌EG3、扣囊复膜抱酵母BGL或黑曲霉木聚糖酶的一种或多种多核巧酸。宿主细胞可进一步包括编码黑曲霉木聚糖酶， P.t.r.木糖巧酶、费希新萨托菌AXE、烟曲霉EGl、里氏木霉AGLl、里氏木霉0-甘露聚糖 酶、烟曲霉a-葡糖醒酸酶（FCllO)、烟曲霉乙酷醋酶（FC136)、费希新萨托菌0-甘露糖巧 酶（FC124)或扣囊复膜抱酵母BGL的一种或多种多核巧酸。
[0017] 在本发明的一些实施方案中，宿主细胞可使结晶纤维素糖化和/或发酵。在其他 实施方案中，宿主细胞可水解源自硬木的硬木固体或巧液体。
[0018] 在本发明的一些实施方案中，酵母选自酿酒酵母、己氏酵母（Saccharomyces pastorianus)、贝酵母（Saccharomycesbayanus)、乳酸克鲁维酵母化Iuyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、白色假丝酵母（Candidaa化icans)、毕赤酵母（Pichia pastoris)、树干毕赤酵母（Pichiastipitis)、解脂耶氏酵母（Yarrowialipoidica)、 多形汉逊酵母（Hansenulapolymo;rpha)、红法夫酵母（Phaffiarhodozyma)、产航 假丝酵母（CandidaUtilis)、耐盐酵母（Arxulaadeninivorans)、汉逊德己利酵母 值ebaryomyceshansenii)、多形德己利酵母值ebaryomycespolymo巧bus)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、西方许旺酉奉母（Schwanniomycesoccidentalis)或其衍生 物。在一些实施方案中，酵母是酿酒酵母。
[0019] 本发明的其他实施方案设及从本发明的宿主细胞分离的B化肤，或从本发明的宿 主细胞分离的纯化的BCiL肤。本发明的其他实施方案包括共培养物，其包含（i)本发明的宿 主细胞和（ii)第二宿主细胞，其包含编码木聚糖酶、木糖巧酶、AXE、内切葡聚糖酶、a-半 乳糖巧酶、葡糖巧酶、甘露聚糖酶、a-葡糖醒酸酶、乙酷醋酶、0-甘露糖巧酶、葡糖醒酸基 醋酶或CBH的一种或多种多核巧酸。在其他实施方案中，本发明设及组合物，其包括（i)本 发明的肤或纯化肤和（ii)宿主细胞，其包括编码木聚糖酶、木糖巧酶、AXE、内切葡聚糖酶、 a-半乳糖巧酶、葡糖巧酶、甘露聚糖酶、a-葡糖醒酸酶、乙酷醋酶、0-甘露糖巧酶、葡糖 醒酸基醋酶或CBH的一种或多种多核巧酸。
[0020] 本发明也提供了水解纤维素底物的方法，所述方法包括使纤维素底物接触本发明 的宿主细胞、共培养物、组合物、肤或纯化肤。纤维素底物可包括木质纤维素生物质。木质 纤维素生物质可W是草、柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残渣、甘薦渣、农业废 物、稻草、稻壳、大麦賴杆、玉米忍、谷类賴杆、小麦賴杆、油菜賴杆、燕麦賴杆、燕麦壳、玉米 纤维、賴杆、大豆賴杆、玉米賴杆、林业废物、回收的木浆纤维、造纸污泥、银屑、硬木、软木或 其组合。纤维素底物可水解成木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖或其组合。在一些实 施方案中，纤维素底物水解成木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或阿拉伯糖，其速率比包括编码 来自扣囊复膜抱酵母的B化的多核巧酸的宿主细胞的速率高至少约10%。在方法的一些实 施方案中，B化存在的量是约每克木糖0. 2mg或更少。
[0021] 本发明也提供了发酵纤维素的方法，包括在适当的条件下在包含结晶纤维素的培 养基中培养本发明的宿主细胞、共培养物、组合物、肤或纯化肤足W允许纤维素糖化和发酵 的时间。在一些实施方案中，宿主细胞产生乙醇。
[0022]本发明也提供了酵母菌株M4860、M4861、M4862、M4863、M4864和M4865，和表达载 体PMU3557、PMU3558、PMU3559、PMU3560、PMU3561、PMU3562、PMU3563、PMU3564、PMU3565 和 PMU3566。
[0023] 本发明也提供了通过本发明的宿主细胞、共培养物或酵母菌株产生的发酵产物。 发酵产物可W是乙醇。
【附图说明】
[0024] 图1描绘了 PMU3557的质粒图谱。 阳0巧]图2描绘了PMU3558的质粒图谱。 阳0%] 图3描绘了 PMU3559的质粒图谱。
[0027] 图4描绘了 PMU3560的质粒图谱。
[0028] 图5描绘了 PMU3561的质粒图谱。
[0029] 图6描绘了 PMU3562的质粒图谱。
[0030] 图7描绘了 PMU3563的质粒图谱。 阳03U 图8描绘了 PMU3564的质粒图谱。 阳03引 图9描绘了 PMU3565的质粒图谱。 阳03引图10描绘了PMU3566的质粒图谱。
[0034]图11描绘了实施例1中描述的转化株的纤维二糖0-葡糖巧酶活性试验。 阳03引图12A-12B描绘了来自产生0-葡糖巧酶度化）的菌株的上清液的SDS-PAGE和 蛋白质印迹分析。左图是SDS-PAGE凝胶结果。右图是蛋白质印迹结果。
[0036] 图13描绘了几种B化酶在几种蛋白质载荷下针对纤维二糖的活性的比较。由图 例中来源生物体的两个字母缩写识别酶。
[0037] 图14描绘了几种B化酶在加g/血蛋白质载荷下针对纤维二糖的活性的比较。由 图例中来源生物体的两个字母缩写识别酶。
[0038] 图15描绘了几种B化酶在低浓度（2%总固体）下对预处理的硬木水解的影响的 比较。"Big6"指酵母制备和纯化的纤维素酶，里氏木霉CBD和埃默森篮状菌CBH1、卢克诺 文思金抱子菌CB肥、烟曲霉EGl、费希新萨托菌EG3、扣囊复膜抱酵母B化和黑曲霉木聚糖 酶。在该试验中装载2mg/g该混合物的总固体W及4mg/g的被称为"flashzyme"的商业酶 制剂，并且除了W每克总固体4mg酶蛋白的典型载荷装载的商业酶制剂W外，W小量添加 另外纯化的BGL(每克总固体0.Img酶蛋白）。通过HPLC测量释放的糖。
[0039] 图16描绘在使用纯化的B化酶的酶试验期间来自预处理的硬木衍生的巧液体 的木糖（木糖、半乳糖和甘露糖的组合）释放。除了其他酵母制备的纯化的酶（所有的W 0. 2mg/g木糖添加，例外是Xld= 0.6mg/g木糖）W外，W小量添加BGL(每克木糖0. 2mg 酶蛋白）。"原始组"表示W下组的基因：黑曲霉木聚糖酶、P.t.r.木糖巧酶、费希新萨 托菌AXE、烟曲霉EG1、里氏木霉AGL1、里氏木霉0-甘露聚糖酶、烟曲霉a-葡糖醒酸酶 (FCllO)、烟曲霉乙酷醋酶（FC136)、费希新萨托菌0 -甘露糖巧酶（FC124)和扣囊复膜抱酵 母BGL。"原始组+AoBGL"表示原始组，不同之处是不包括扣囊复膜抱酵母BGL并且用米 曲霉（A.oryzae)B化代替。通过HPLC测量释放的糖。
[0040] 图17描绘在使用纯化的B化酶的酶试验期间来自预处理的硬木衍生的巧液体 的葡萄糖释放。除了其他酵母制备的纯化的酶（所有W0. 2mg/g木糖添加，例外是Xld= 0. 6mg/g木糖）W外，W小量添加BGL(每克木糖0. 2mg酶蛋白）。除了W每克总固体4mg酶 蛋白的典型载荷装载的商业酶制剂W外，W小量添加BGL(每克总固体0.Img酶蛋白）。通 过HPLC测量释放的糖。 阳0川图18描绘了在使用纯化的B化酶的酶试验期间来自预处理的硬木衍生的巧液体 的糖释放。除了其他酵母制备的纯化的酶（所有WO.2mg/g木糖添加，例外是Xld=O.6g/ g木糖）W外，W小量添加BGL(每克木糖0.2mg酶蛋白）。除了W每克总固体4mg酶蛋白 的典型载荷装载的商业酶制剂W外，W小量添加BGL(每克总固体0.Img酶蛋白）。使用分 离木糖、半乳糖和甘露糖的BioRadAminex87P柱，使用HPLC测量释放的糖。
[00创图19描绘在使用纯化的B化酶的酶试验期间来自预处理的硬木衍生的巧液体的 糖释放。除了其他酵母制备的纯化的酶（所有W0. 2mg/g木糖添加，例外是xld= 0. 6mg/ g木糖）W外，W小量添加BGL(每克木糖0. 2mg酶蛋白）。此外，除了W每克总固体4mg酶 蛋白的典型载荷装载的商业酶制剂W外，W小量添加BGL(每克总固体0.Img酶蛋白）。通 过针对所述具体BGL向反应添加另外的0. 2mg/g木糖蛋白质载荷，产生如图例中显示的具 有多于一种B化的组。使用分离木糖、半乳糖和甘露糖的BioRadAminex87H柱，使用HPLC 测量释放的糖。
[0043] 发巧详沐
[0044] 本发明尤其设及来自灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛 壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母和致病疫霉的B化基因在宿主细胞， 包括酵母，例如，酿酒酵母中的异源表达。本发明提供了使酵母能够在纤维素底物上生长W 用于产生产物如乙醇的重要工具。 阳045] 定义
[0046] 除非另外定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技 术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，W本申请包括的定义为准。此外，除非上下 文另外要求，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
[0047] 如本文使用的，术语"包含（comprises)"、"包含（comprising)"、"包括 (includes)"、"包括（including)"、"具有化as)"、"具有化aving)"、"含有（contains)"、 "含有（containing)"或其任何其他变型应理解暗示包括所述的整数或整数组，但是不排 除任何其他整数或整数组。例如，包含未明确列举的或仅仅那些要素的固有要素的一系列 要素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或装置可包括未明确列举的或运样的组合物、混合 物、工艺、方法、制品或装置固有的其他要素。此外，除非相反地明确指出，"或"指包括性的 "或"，不指排他性的"或"。例如，下述任一满足条件A或B:A真（或存在）和B假（或不存 在），A假（或不存在）和B真（或存在），和A和B都真（或存在）。
[0048] 而且，本发明的要素或组分之前的不定冠词"一个（a)"和"一个（an)"旨在就实 例的数量，即要素或组分的存在而言是非限制的。所W，"一个（a)"和"一个（an)"应理