蛋白质的表达中采用的微生物细胞，所述方法包括 冻融循环、超声法、机械破坏或使用细胞裂解试剂，运样的方法是本领域技术人员熟知的。 阳192]可如下操作在蛋白质的表达中采用的酵母细胞，例如，酿酒酵母。可通过细胞分泌B化多肤并且因此可容易地使用本领域技术人员已知的方法从上清液回收。也可通过W下 方法从重组细胞培养物回收和纯化蛋白质，所述方法例如包括原生质球制备和裂解，使用 玻璃珠的细胞破坏，和使用液氮的细胞破坏。
[0193] 也可采用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白。表达载体包括复制起点、适合的 启动子和增强子，并且也包括任何必要的核糖体结合位点、多腺巧酸化位点、剪接供体和受 体位点、转录终止序列，和5'侧翼非转录的序列。
[0194] 另外的方法包括硫酸锭或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、憐酸纤维 素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、径憐灰石色谱和凝集素色谱。必要时，在完成成熟蛋 白质的构型时，可使用蛋白质重折叠步骤。最后，高效液相色谱化化C)可用于最终的纯化 步骤。
[0195] 可WW任何适合的方式制备B化多肤。运样的多肤包括分离的天然存在的多肤、 重组产生的多肤、合成产生的多肤或通过运些方法的组合产生的多肤。制备运样的多肤的 方式是本领域熟知的。
[0196] W分离形式提供B化多肤，并且，在某些方面，B化多肤基本上是经纯化的。可 基本上使用本文所述的技术或另外的本领域已知的技术，如，例如，通过Smith等，Gene, 67:31-40,1988描述的一步法，纯化重组产生形式的B化多肤。也可使用本文所述的技术或 另外的本领域已知的技术由天然、合成或重组来源纯化B化多肤。
[0197] 本发明的BGL多肤可W为成熟的形式，或可W是较大蛋白质如融合蛋白的一部 分。其可有利地包括另外的氨基酸序列，其包含分泌或前导序列、原序列、帮助纯化的序列， 如多个组氨酸残基，或用于重组产生期间稳定性的另外序列。 阳19引期望的蛋白质分泌至生长培养基的优点是简化的和成本较低的纯化程序。本领域 熟知的是分泌信号序列通常用于帮助可表达的蛋白质跨细胞膜主动运输。可通过引入编 码在宿主产生宿主中起作用的分泌信号的DNA序列，实现能够分泌的转化宿主的产生。选 择适当的信号序列的方法是本领域熟知的（参见，例如，第546049号欧洲公开申请；第WO 93/24631号国际公开申请）。分泌信号DNA或促进子可位于控制表达的DNA和该基因或基 因片段之间，并且与后者在相同的阅读框中。 阳199] 宿主细胞中B化多肤的异源表达 阳200] 为了解决之前系统的局限，本发明提供了可有效益和有效率地在联合生物加工系 统中使用的灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉 逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化多肤，和其结构域、变体和衍生物。 阳201] 特别地，本发明设及在宿主生物体中产生异源0 -葡糖巧酶度化)。在某些实施方 案中，该宿主生物体是酵母，如酿酒酵母。 阳202] 在本发明的某些实施方案中，包括编码和表达用于联合生物加工的灰腐质霉、魏 氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克 鲁维酵母或致病疫霉BGL的载体的宿主细胞与表达一种或多种另外的异源纤维素酶的另 外的宿主细胞共培养。另外的异源纤维素酶可源自例如，真菌或细菌来源。 阳203] 在一些实施方案中，纤维素酶是木聚糖酶、木糖巧酶、乙酷木聚糖醋酶（AXE)、 内切葡聚糖酶、a-半乳糖巧酶、葡糖巧酶、甘露聚糖酶、a-葡糖醒酸酶、乙酷醋酶、P-甘露糖巧酶、葡糖醒酸基醋酶、纤维二糖水解酶（CBH)或其组合。在其他实施方案 中，内切葡聚糖酶是烟曲霉（A.fumigatus)内切葡聚糖酶I、费希新萨托菌（Neosartcxrya fische;ri，N.fischeri)内切葡聚糖酶III、里氏木霉（T.reesei)内切葡聚糖酶I、家白蚁 (Coptotermes化rmosanus，C.formosanus)内切葡聚糖酶I或其组合。在一些实施方案中， CBH是CB化或CB肥，或其组合。在一些实施方案中，CBH是埃默森篮状菌化emersonii)纤 维二糖水解酶I，卢克诺文思金抱子菌杞Iucknowense)纤维二糖水解酶Ilb、里氏木霉纤 维二糖水解酶II或其组合。在本发明的其他实施方案中，CBH是CBHl或CBH2亚型、旁系 同源物或直系同源物。 阳204] 在本发明的某些实施方案中，内切葡聚糖酶可W是内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖 酶II亚型、旁系同源物或直系同源物。在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞表达的内 切葡聚糖酶可W是重组内切-1,4-0-葡聚糖酶。在本发明的某些实施方案中，内切葡聚糖 酶是来自里氏木霉、烟曲霉EGl、费希新萨托菌EG3、家白蚁内切葡聚糖酶I或其组合的内切 葡聚糖酶I。 阳205] 在一些实施方案中，本发明的宿主细胞可进一步包括编码扣囊复膜抱酵母 仅fibuligera)B化的多核巧酸。 阳206] 在一些实施方案中，本发明的宿主细胞可进一步包括一种或多种多核巧酸，其编 码埃默森篮状菌CBH1、里氏木霉CBD、卢克诺文思金抱子菌CBH2、烟曲霉EG1、费希新萨托 菌EG3、扣囊复膜抱酵母B化或黑曲霉木聚糖酶。在其他实施方案中，本发明的宿主细胞 可进一步包括一种或多种多核巧酸，其编码黑曲霉木聚糖酶、P.t.r.木糖巧酶、费希新萨 托菌AXE、烟曲霉EG1、里氏木霉AGL1、里氏木霉0-甘露聚糖酶、烟曲霉a-葡糖醒酸酶 (FCllO)、烟曲霉乙酷醋酶（FC136)、费希新萨托菌0 -甘露糖巧酶（FC124)或扣囊复膜抱酵 母B化。
[0207] 编码运些纤维素酶和其他示例性纤维素酶的DNA和多肤序列可获自GenBank并且 描述在例如第WO2011/051806号国际公开申请、第WO2011/153516号国际公开申请、第WO2010/005553号国际公开申请、第WO2009/139839号国际公开申请、第WO2009/138877 号国际公开申请、第WO2010/060056号国际公开申请、2012年9月28日提交的第PCT/ US2012/057952号国际申请和2012年8月28日提交的第61/694,690号美国申请中，其通 过引用W它们的整体并入本文。 阳20引测量本文所述的转化的宿主细胞或细胞培养物的重组蛋白含量。对于分泌的纤维 素酶的用途，可通过分析宿主（例如，酵母）细胞上清液测定蛋白质含量。蛋白质，包括束缚 的异源生物质降解酶，也可通过包括例如原生质球制备和裂解、使用玻璃珠的细胞破坏和 使用液氮的细胞破坏的方法从重组细胞培养物回收和纯化。另外的蛋白质纯化方法包括= 氯乙酸、硫酸锭或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、憐酸纤维素色谱、疏水相互 作用色谱、亲和色谱、径憐灰石色谱、凝胶过滤和凝集素色谱。在完成成熟蛋白质的构型时， 如必要，可使用蛋白质重折叠步骤。最后，高效液相色谱OPLC)可用于最终的纯化步骤。 阳209]蛋白质分析方法包括的方法如传统的Low巧法、二辛可宁酸蛋白质试验试剂(Pierce)或根据BioRad制造商的方案的蛋白质试验方法。使用运样的方法可估算糖解酶 的蛋白质含量。另外，为了精确测量蛋白质浓度，可用标签，例如His标签或HA标签表达 B化并且通过使用，例如，针对标签的抗体的标准方法、标准儀树脂纯化技术或类似的方法 纯化。
[0210] 可进一步分析本文所述的转化的宿主细胞或细胞培养物的纤维素酶的水解（例 如，通过糖检测试验），具体类型的纤维素酶活性（例如，通过测量单个酶活性）或总纤维素 酶活性。可例如，通过测量内切葡聚糖酶特异性簇甲基纤维素（CMC)底物中还原末端的增 加来测定内切葡聚糖酶活性。可例如通过使用不溶性纤维素底物如无定形的底物憐酸膨胀 纤维素（PASC)或微晶纤维素（Avicel),并测定底物水解的程度来测量纤维二糖水解酶活 性。可通过多种试验，例如，使用纤维二糖测量本文所述的B化活性如"比活性"。B化活性 和水解的计量单位包括，例如，umol葡萄糖/mol或mgBGL/时间（例如，秒）。供选择地， 一个B化活性单位可定义为在试验条件下每分钟从pNP0 -糖巧或纤维二糖释放Iumol的 对硝基苯酪（PNP)需要的酶的量。 悦11] 可包括，例如，内切葡聚糖酶、CBHIXBHII和B化活性的总的纤维素酶活性可协同 水解结晶纤维素。因此可使用不溶性底物测量总纤维素酶活性，所述不溶性底物包括纯纤 维素底物，如Whatman1号滤纸、棉绒、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素和包含纤维素 的底物，如染色的纤维素、a-纤维素或预处理的木质纤维素。
[0212] 认识到适合的木质纤维素材料可W是包含可溶性和/或不溶性纤维素的任何原 料，其中不溶性纤维素可W为结晶或非结晶形式。在各种实施方案中，木质纤维素生物质 包括例如木材、玉米、玉米忍、玉米賴杆、玉米纤维、银屑、树皮、树叶、农业和深林残渣、草如 柳枝稷、大米草、黑麦草或草芦、芒草、反当动物消化产物、城市垃圾、造纸厂流出物、报纸、 卡纸、芒草、糖加工残渣、甘薦渣、农业废物、稻草、稻壳、大麦賴杆、谷类賴杆、小麦賴杆、油 菜賴杆、燕麦賴杆、燕麦壳、賴杆、大豆賴杆、林业废物、回收的木浆纤维、造纸污泥、银屑、硬 木、软木或其组合。
[0213] 在本发明的某些实施方案中，包括编码和表达用于联合生物加工的灰腐质霉、魏 氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克 鲁维酵母或致病疫霉BGL的载体的宿主细胞与表达一种或多种另外的异源纤维素酶的另 外的宿主细胞共培养。在本发明的其他实施方案中，用灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲 霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫 霉B化转化的宿主细胞用一种或多种其他异源木聚糖酶、木糖巧酶、AXE、内切葡聚糖酶、a-半乳糖巧酶、葡糖巧酶、甘露聚糖酶、a-葡糖醒酸酶、乙酷醋酶、0-甘露糖巧酶、葡糖 醒酸基醋酶或CBH转化和/或表达一种或多种其他异源木聚糖酶、木糖巧酶、AXE、内切葡聚 糖酶、a-半乳糖巧酶、葡糖巧酶、甘露聚糖酶、a-葡糖醒酸酶、乙酷醋酶、0 -甘露糖巧酶、 葡糖醒酸基醋酶或CBH，如本文进一步描述的。
[0214] 也可通过本领域普通技术人员已知的方法检测纤维素酶的比活性。为了精确测量 蛋白质浓度，可用标签，例如化S标签或血细胞凝集素（HA)标签表达灰腐质霉、魏氏假丝酵 母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母 或致病疫霉B化并且通过使用，例如，针对标签的抗体的标准方法、标准儀树脂纯化技术或 类似的方法纯化。
[0215] 在其他实施方案中，宿主细胞在培养物中产生BGL。在一些实施方案中，B化产 生的量为至少约0. 6mg、至少约0. 7mg、至少约0. 8mg、至少约0. 9mg、至少约Img、至少约 1. 5mg、至少约2mg、至少约2. 5mg、至少约3mg、至少约3. 5mg、至少约4mg、至少约4. 5mg、至 少约5mg、至少约6mg、至少约7mg、至少约8mg、至少约9mg或至少约IOmg,或其任何范围。在 其他实施方案中，B化产生的量为约0. 6mg至约lOmg、约Img至约IOmg,或约Img至约5mg。
[0216] 在其他实施方案中，宿主细胞在培养物中产生的B化浓度为至少约0. 2mg/ml。在 一些实施方案中，浓度是至少约0. 2mg/ml、至少约0. 5mg/ml、至少约Img/ml、至少约1. 5mg/ ml、至少约2mg/ml、至少约2. 5mg/ml、至少约3mg/ml、至少约3. 5mg/ml、至少约4mg/ml、至少 约4. 5mg/ml、至少约5mg/ml、至少约5. 5mg/ml或至少约6mg/ml，或其值的任何范围。在一 些实施方案中，浓度是约0. 2mg/ml至约6mg/ml、约0. 2mg/ml至约5mg/ml、约0. 2mg/ml至 约 0. 2mg/ml至约 3mg/ml。
[0217] 在其他实施方案中，本发明也提供了水解纤维素底物的方法。在实施方案中，方 法包括使纤维素底物接触本发明的宿主细胞、共培养物、组合物、肤或纯化肤。在一些实施 方案中，纤维素底物包括木质纤维素生物质。在其他实施方案中，木质纤维素生物质是草、 柳枝稷、大米草、黑麦草、草芦、芒草、糖加工残渣、甘薦渣、农业废物、稻草、稻壳、大麦賴杆、 玉米忍、谷类賴杆、小麦賴杆、油菜賴杆、燕麦賴杆、燕麦壳、玉米纤维、賴杆、大豆賴杆、玉米 賴杆、林业废物、回收的木浆纤维、造纸污泥、银屑、硬木、软木或其组合。在其他实施方案 中，纤维素底物可水解成木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖或其组合。在一些实施方 案中，纤维素底物水解成纤维质底物，所述纤维质底物水解成木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖 或阿拉伯糖，其速率比包括编码来自扣囊复膜抱酵母的B化的多核巧酸的宿主细胞的速率 的高至少约10%。在其他实施方案中，速率高至少约10%、高至少约20%、高至少约30%、 高至少约40%、高至少约50%、高至少约60%、高至少约70%、高至少约80%、高至少约 90%，或高至少约100%，或其值的任何范围。在其他实施方案中，速率高约10%至高约 100%、高约10%至高约70%、高约10%至高约60%、高约10%至高约50%、高约20%至高 约70%、高约30%至高约70%，或高约30%至高约60%。
[0218] 在本发明方法的一些实施方案中，B化存在的量为每克木糖约0.2mg或更少。
[0219]本发明也提供发酵纤维素的方法，包括在培养基中培养本发明的宿主细胞、共培 养物、组合物、肤或纯化肤。在一些实施方案中，培养基包含结晶纤维素。在一些实施方案 中，在适当的条件下培养足够的时间，W允许纤维素糖化和发酵。在其他实施方案中，宿主 细胞产生乙醇。
[0220] 在另外的实施方案中，分析转化的宿主细胞或细胞培养物的乙醇产生。可通过本 领域普通技术人员已知的技术测量乙醇产生。例如，可使用HPLC分析评估发酵样品中的乙 醇的量。许多乙醇试验试剂盒是商业上可得的，其使用例如基于醇氧化酶的试验。确定乙 醇产生的方法根据本文的教导在本领域技术人员的范围内。 阳221] 共培养物 阳222] 本发明也设及包括至少两种酵母宿主细胞的共培养物，其中至少一种酵母宿主细 胞包括编码灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉 逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化多肤的多核巧酸，W及至少一种包括编 码异源纤维素酶的多核巧酸的其他酵母宿主细胞。如本文所使用的，"共培养物"指两个 不同宿主细胞菌株或物种在相同的容器中一起生长。在本发明的一些实施方案中，共培养 物的至少一种宿主细胞包括异源多核巧酸，其包括编码内切葡聚糖酶的核酸，共培养物的 至少一种宿主细胞包括异源多核巧酸，其包括编码P-葡糖巧酶的核酸，W及至少一种宿 主细胞包括异源多核巧酸，其包括编码灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青 霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化多肤的核酸。 在进一步的实施方案中，共培养物进一步包括宿主细胞，其包括包含编码第二B化的核酸 的异源多核巧酸。 阳223] 共培养物可包括两种或更多种酵母宿主细胞的菌株并且异源纤维素酶可WW任 何组合在两种或更多种宿主细胞的菌株中表达。例如，根据本发明，共培养物可包括两种菌 株：宿主细胞的一种菌株，其表达一种或多种本文所述的纤维素酶；和宿主细胞的第二种 菌株，其表达灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、 汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉BGL。供选择地，共培养物可包括S、四、五、 六、屯、八或更多种宿主细胞的菌株，其每个表达本文所述的一种或多种纤维素酶和/或灰 腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵 母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉BGL。
[0224] 共培养物中的各种宿主细胞菌株可WW相等数量存在，或宿主细胞的一个菌株或 物种可明显比宿主细胞的另一第二菌株或物种更多。例如，在包括宿主细胞的两个菌株或 物种的共培养物中，一个宿主细胞与另一种的比例可W是约1: 1、1: 2、1: 3、1: 4、1: 5、1:10、 1:100、1:500或1:1000。类似地，在包括宿主细胞的=种或更多种菌株或物种的共培养物 中，宿主细胞的菌株或物种可WW相等或不相等的数量存在。
[02巧]本发明的共培养物可包括束缚的纤维素酶、分泌的纤维素酶或束缚的和分泌的纤 维素酶二者。另外，其他纤维素酶，如外部添加的纤维素酶可存在于共培养物中。 阳226] 根据本文所述的方法，宿主细胞或宿主细胞组可包括编码和表达包括一种或多种 纤维素酶的异源纤维素酶组合的一种或多种载体，所述纤维素酶选自灰腐质霉、魏氏假丝 酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵 母或致病疫霉BGL。例如，单个宿主细胞可表达内切葡聚糖酶、BGLCBHl和CBH2。供选择 地，细胞组可表达纤维素酶的组合，例如使得第一宿主细胞表达内切葡聚糖酶，第二宿主细 胞表达BGL第^宿主细胞表达CB化，和第四宿主细胞表达CB肥。类似地，第一宿主细胞可 表达内切葡聚糖酶和B化二者，W及第二宿主细胞可表达CB化和CB肥二者。 实施例 阳227] 材料和方法
[0228] 培养基和菌株培养
[0229] 除非另有规定，酵母菌株在YPD(l〇g/L酵母提取物、20g/L蛋白腺、20g/L葡萄糖）、 YPC(l〇g/L酵母提取物、20g/L蛋白腺、20g/L纤维二糖）、或YNB+葡萄糖化7g/L没有氨基 酸的酵母氮源基础，且针对菌株补充适当的氨基酸，20g/L葡萄糖）培养基中常规生长，并 且如果需要，添加用于选择的抗生素。为固体培养基添加15g/L琼脂。
[0230] 分子方法 阳231] 除非另有规定，根据标准方案进行DNA操作（Sambrook等1989)。使用用于克隆的 Phusion聚合酶（New!EnglandBiol油S)，和用于筛选转化株的Taq聚合酶（New!England Biol油s)，和在一些情况下用于纠正营养缺陷型的基因的PCR的优势聚合酶（Clontech)进 行聚合酶链反应（PCR)。按照提供的制造商指导。限制酶购买自化W化glandBiol油S并 且根据提供的指导设置消化。使用如ick连接试剂盒（New化glandBiol油S)，如制造商 规定进行连接。使用Qiagen或幻mo研究试剂盒进行凝胶纯化，使用幻mo研究试剂盒进行 PCR产物和消化纯化，和Qiagenmidi和minipr巧试剂盒用于纯化质粒DNA。 阳2巧酵母转化 阳23引基于Qio等巧nzymeAndMicrobialTechnology, 25:23-30, 1999)和Ausubel等 (CurrentProtocolsinMolecularBiology.USA:JohnWileyandSons,Inc. , 1994)开发 了用于电转化酵母的方案。利用质粒中独特的限制酶切位点通过限制酶切产生DM的线性 片段。通过用3M醋酸钢和冰冷乙醇沉淀，随后用70%乙醇清洗，并且在70°C真空烘箱中干 燥之后重悬在USB地20 (无DNA酶和RNA酶，无菌水）来纯化片段。
[0234] 除非另有规定，通过在5mLYTO培养物中生长至饱和制备用于转化的酵母细胞，例 如，酿酒酵母。取4ml的培养物样品，用冷蒸馈水清洗2X，并且重悬在640yL冷蒸馈水中。 添加SOyL的IOOmMTris-HCUlOmM邸TA,pH7.5 (10XTE缓冲液-过滤器灭菌）和SOyL 的IM乙酸裡，pH7. 5 (10XIiAc-过滤器灭菌）并且在30°C下在溫和振摇下解育细胞悬液 45分钟。添加20yL的IMDTT并且继续解育15分钟。然后离屯、细胞，用冷蒸馈水清洗一 次，并且用电穿孔缓冲液（1M山梨糖醇，20mM肥阳巧清洗一次，并且最后重悬在267yL电 穿孔缓冲液中。
[0235] 为了电穿孔，将10yg线性化的DNA(在凝胶上通过评估测量）在无菌的1. 5血微 离屯、管中与50yL细胞悬液合并。混合物然后转移至0. 2cm电穿孔试管，并且使用，例如， BioRadGene化Iser设备将1. 4kV(200Q，25y巧脉冲施加至样品。将用IM山梨糖醇调整 至抑7. 0的1血的YPD灯ro巧放置在试管中并且允许细胞恢复~化r。将100-200yL的 细胞悬液涂布在具有适当选择的YPDS琼脂板上，其在30°C下解育3-4天直到出现菌落。
[0236]SDS-PAGE和凝胶染色 阳237] 除非另有规定，如Laemmli(化Uire, 227:680-685,1970)所述在10 %凝胶上在 IOOV下进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钢聚丙締酷胺凝胶电泳）。将20y1培养物上清液的 样品与SDS-PAGE载荷缓冲液混合并且在95°C下解育5分钟，然后上样在凝胶上。蛋白质分 离之后，凝胶被银染色。通过在室溫下振摇的同时在1)30%乙醇和0.5%乙酸（3x30min); 2) 20% 乙醇（IOmin) ;3)水（IOmin) ;4)硫代硫酸钢（0.2g/L) (Imin) ;5)水（2x20 秒）；6) 硝酸银（2g/L) (30min) ;7)水（5-10 秒）；8)37% 甲醒 0). 7ml/L)和碳酸钟（无水）（30g/ L)和硫代硫酸钢（lOmg/L) (2x3min或至期望的强度）；9)Tris碱（50g/L)和2. 5%乙酸 (Imin);和10)水中解育凝胶进行银染色。 阳23引确定蛋白质浓度
[0239] 为了估算B化的比活性，使用化a壯ord方法度ioRad蛋白质试验），因为其规定用 于微量滴定板，使用T球蛋白标准品。在确定蛋白质浓度之前，上清液样品首先进行缓冲 液交换程序，如2血Zeba脱盐离屯、柱（ThermoScientific)所指导的。
[0240] 菌株上清液的蛋白质印迹方案： 阳241] 1.测试表现好的菌株的活性，W及随机选择的a-葡糖醒酸酶菌株（无活性试验 可用）并且在4-20%Tris甘氨酸SDS-PAGE凝胶（Invitrogen，EC6025B0X)上运行，转移至PVDF膜（AmershamHybondP，GEHealthcare,RPN303巧并在TBSdOmMTris, 150mM化Cl, pH7. 5