用于细胞培养的器皿的制作方法
【专利说明】用于细胞培养的器皿
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求美国临时专利申请N0.61/735，841的优先权，其公开内容在此通过引用的方式并入。
技术领域
[0003]本公开涉及用于细胞培养的器皿、包括用于细胞培养的器皿的生物反应器、制造这种器皿或生物反应器的方法、以及使用该器皿或生物反应器的方法，例如培养细胞。
【背景技术】
[0004]在现今的细胞培养中，包括一个或多个器皿的生物反应器的产量是生物产业的多个主要关注点之一。当前方法的复杂性也可能会提高成本。因而，确定需要进行改进。
【发明内容】
[0005]本文公开的实施例的一个目的是提供优良的用于细胞培养的器皿及方法。其优点在于，当用于细胞生长时，所述器皿的产量可至少等于或甚至大于当前已知器皿的产量，且不会增加复杂性或成本。一个优点是提供具有更高细胞密度的器皿，从而提供增加的“体积产量”，即每器皿体积的产量。有利的是，提供当用于细胞生长时可具有在整个器皿中基本一致的细胞培养的器皿。有利的是提供如下的器皿:当用于细胞生长时，沿着细胞所生长的整个表面具有更均匀的介质通气和更新。有利的是提供如下的器皿:该器皿提供良好的细胞生长和/或改善的生存能力维护。有利的是提供能用于制造一次性器皿和生物反应器的器皿。
[0006]一种方法和器皿可实现上述目的中的一个或多个。
[0007]根据第一方面，根据本公开的用于细胞培养的器皿的实施例具有内部空间，该内部空间包含适合细胞生长的填充物。该内部空间由下列部件限定:
[0008]-外管状壁，该外管状壁具有第一外端和第二外端，
[0009]-内伸长壁，该内伸长壁的第一外端朝着外管状壁的第一外端定向，该内伸长壁的第二外端朝着外管状壁的第二外端定向，该内伸长壁位于外管状壁内，以及
[0010]-第一封盖和第二封盖，该第一封盖和第二封盖用于封闭所述内部空间。
[0011]用于细胞培养的器皿可具有环状内部空间，该环状内部空间包含适合细胞生长的填充物。当存在时，此环状内部空间具有由以下部件限定的环状体积:
[0012]-外管状壁，该外管状壁具有第一外端和第二外端以及在纵向方向上延伸的纵向壁，该外管状壁在纵向方向上划定了所述环状体积的外边界；
[0013]-第一封盖和第二封盖，该第一封盖和第二封盖分别在外管状壁的第一外端和第二外端处对所述环状体积进行限界和封闭；
[0014]-内伸长壁，该内伸长壁的第一外端朝着外管状壁的第一外端定向，该内伸长壁的第二外端朝着外管状壁的第二外端定向，该内伸长壁位于外管状壁内，该内伸长壁在纵向方向上延伸且划定了所述环状体积的内边界，该内边界被所述外边界包围。
[0015]可选地，该内边界被所述外边界封闭。
[0016]该内伸长壁的第一外端可与第一封盖对齐。该内伸长壁的第二外端可与第二封盖对齐。
[0017]该内伸长壁可由内伸长元件提供。该外管状壁可由外管状元件提供。
[0018]有利的是，可迫使设置在所述器皿中以允许细胞培养的基本全部体积的培养介质(例如细胞培养介质）流经所述填充物。
[0019]根据一个实施例，与所述外边界相切并具有在纵向方向上的轴线的最小圆柱体可具有直径Dmax ;所述内边界与外边界之间的沿径向方向的距离可在Dmax的5%至45%的范围内。
[0020]具有环状体积的环状内部空间具有下列优点，即：在细胞生长期间，一旦旋转至少部分填充有培养介质（例如细胞培养介质）的器皿，介质就能够以基本均一和/或恒定的速度流过所述填充物。该介质甚至能够以柱塞流的形式流过所述填充物。可获得更均匀且可预测的细胞生长。可选地，获得了更高的产量。在将介质与气体（例如氧气或二氧化碳）混合以允许细胞生长的情况下，介质经由所述填充物的可预测且更均一的流动可引起对所述填充物的更均匀的通气，因此可提高整个填充物上的细胞生长效率。当培养介质（例如细胞培养介质）作为柱塞流流过所述填充物时尤其如此。
[0021]在培养介质（例如细胞培养介质)穿入到所述填充物的给定区域中时，迫使所存在的气体或空气移位，例如流出该区域。一旦一定体积的培养介质（例如细胞培养介质）已经穿过该区域，就在所排出的一定体积的培养介质（例如细胞培养介质）后方产生低压。这种低压导致相邻的填充物区域中存在的气体或空气被吸入到存在低压的区域中。这样，不仅培养介质（例如细胞培养介质）穿过所述填充物移位，而且该器皿中存在的气体或空气也穿过所述填充物移位。
[0022]培养介质（例如细胞培养介质，特别是该介质的组分）可适于所获得的产量。在特定实施例中，该介质富含例如用于短暂或组成型表达的孢子元素或另外的碳源。在其它特定实施例中，例如为了标记实验（例如NMR标记)而使用了基本培养基。
[0023]根据第一方面的器皿可以是用于细胞培养的生物反应器的一部分。该器皿能够以可旋转方式安装在生物反应器中，由此，该器皿绕一个轴线旋转，该轴线基本平行于所述器皿的纵向方向，即外管状壁的纵向方向。封盖在外管状壁的两个外端处封闭其环状体积。这防止了该体积中存在的介质在这些封盖的高度处沿横向方向从该环状体积泄漏。
[0024]在任何实施例中，该填充物都可以是适合黏附细胞生长的填充物。该填充物可以是适合悬浮培养的填充物。该填充物可选自由机织或无纺微纤维、多孔碳和壳聚糖基质组成的组。可选地，该微纤维可由PET或任何其它聚合物或生物聚合物制成。可将聚合物处理成适合细胞培养，如果这种处理是必要的话。
[0025]适合的填充物或“载体材料”是适合细胞生长的诸如硅酸盐的矿物载体、磷酸钙、诸如多孔碳的有机化合物、诸如壳聚糖的自然产物、聚合物或生物聚合物。该填充物可采用具有规则或不规则结构的珠子的形式，或者可包括适合细胞生长的聚合物或任何其它材料的机织或无纺微纤维。也可将该填充物设置为具有多个孔和/或通道的单个件。该器皿中的填充物可具有各种形式和尺寸。在一些实施例中，该填充物是固体或多孔球、薄片、多边形的颗粒材料。通常，使用足量的填充物来避免该填充物颗粒在使用时在器皿内移动，因为这可能损伤细胞且可影响气体和/或介质的循环。替代地，该填充物由配合到内部器皿或配合到器皿的隔间内的元件构成，并具有适当的孔隙率和表面。根据特定实施例，该填充物的孔隙率的范围为60%至99%，更特别地，为80%至90%。为了黏附细胞生长，该填充物的细胞可达表面约在150至lOOOcmVcm3之间。其一个实例是Cinvent1n公司(德国)制造的碳基质(Carboscale)。
[0026]可为该器皿的外管状壁、内伸长元件、封盖和可选的其它元件提供适合该器皿进行细胞培养的材料，例如不锈钢、聚苯乙稀、玻璃、聚乙稀、甲基丙烯酸甲酯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯、聚乙烯对苯乙二醇、全氟烷氧基树脂、聚碳酸酯、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、超高分子量聚乙烯、尼龙、特氟纶、晶体聚苯乙烯、茂金属聚丙烯或间同聚苯乙烯。在一个实施例中，其中，细胞悬浮生长，根据需要用防止细胞黏附的化合物处理该器皿的元件。在另一实施例中，其中，细胞作为黏附细胞生长，根据需要用诸如多熔素的化合物处理该器皿的元件，以获得期望的黏附。
[0027]该器皿还可包括至少第一和第二流体可渗透分隔件，该第一和第二流体可渗透分隔件将所述内部空间分为至少两个隔间，其中:
[0028]-该流体可渗透分隔件在与管状轴线的方向平行的纵向方向上从内伸长壁延伸至外管状壁并从第一封盖延伸至第二封盖，并且
[0029]-所述第一隔间和第二隔间中的一个不包含填充物。
[0030]该器皿还可包括至少N个流体可渗透分隔件，它们将所述内部空间分为至少N个隔间，N是等于或大于2的整数。这些流体可渗透分隔件可在与管状轴线的方向平行的纵向方向上从内伸长壁延伸至外管状壁并从第一封盖延伸至第二封盖。可选地，最多N-1个隔间设有所述填充物。可选地，N为偶数，并且N/2个隔间设有所述填充物。在N等于或大于2的情况下，包括所述填充物的每个隔间都可与无填充物的两个隔间毗邻。
[0031]在外管状壁是圆柱形壁的情况下，所述内部空间被分为在与外管状壁的纵向方向的方向平行的方向上延伸的多个隔间。
[0032]无填充物的隔间的体积可在所述内部空间的环状体积的25%至90%之间。
[0033]该流体可渗透分隔件是可透液体和气体的，并且可适合保持所述填充物。
[0034]该分隔件可由多孔材料制成，其多个孔体具有适合使分隔件对液体和气体可渗透的尺寸，并且这些孔体足够小，以便该分隔件能够固定所述填充物。
[0035]作为替代，该分隔件对于所使用的液体和气体来说也可以是不可透的。这样，敞开空间可被分为多个子单元，其中每个子单元都可设有适当的填充物。
[0036]第一封盖和第二封盖中的至少一个可设有至少一个连接器，用于向内部空间提供介质和/或气体和/或从内部空间抽取介质和/或气体。
[0037]该连接器可包括卡扣接头或紧密配合接头，或者可以是任何其它适当的连接器。该连接器或多个连接器可连接至柔性导管或管或管段，该柔性导管或管或管段将介质引导至内部空间或者从内部空间中引出。在特定实施例中，紧密配合接头被连接至柔性管道。
[0038]介质的组分取决于所考虑的细胞的类型。这些介质是本领域技术人员所周知的，并且可在市场上向各个制造商购得。考虑到采用本发明的实施例的器皿获得的高细胞密度，在特定实施例中，该介质富含碳源、孢子元素、维生素、氨基酸等。在特定实施例中，还向该介质供应表面活性剂，以适应该介质的流变学性质。所述气体通常是空气，用于细菌和酵母的生长，而哺乳动物细胞通常在95%的空气和5% 0)2的混合物中生长。在本发明的特定方法实施例中，监控该器皿中的气体的氧气和/或CO2损耗，并且更换或补充氧气或C02。
[0039]第一封盖和第二封盖中的至少一个可设有至少一个连接器，以向内部空间提供介质和/或气体和/或从内部空间中抽取介质和/或气体。该至少一个封盖可包括该至少一个连接器，其被定位成使得该至少一个连接器适合向其中不存在填充物的隔间内提供介质和/或气体和/或从该隔间中抽取介质和/或气体。第一封盖和第二封盖中的至少一个可包括不止一个连接器，以向内部空间中提供介质和/或气体和/或从内部空间中抽取介质和/或气体。
[0040]在包括该至少一个连接器的第一封盖和第二封盖中的至少一个和外管状壁可分离的情况下，该至少一个连接器适合被定位成使得该至少一个连接器用于向其中不存在填充物的隔间内提供介质和/或气体和/或从该隔间中抽取介质和/或气体。
[0041]该至少一个连接器可包括用于连接柔性导管的紧密配合接头。
[0042]该至少一个连接器可靠近外管状壁位于所述封盖中。
[0043]所述开口可设置成接触外管状壁。
[0044]所述内伸长元件可位于外管状壁的中心。
[0045]所述外管状壁可由圆柱形管状元件提供。
[0046]所述内伸长壁可由圆柱形元件构成。
[0047]内伸长元件可被同轴地设置在外管状壁内。
[0048]所述内伸长元件可具有基于与其纵向方向垂直的平面的径向截面。该径向截面可具有从以下组中选择的形状:圆形、卵圆形、椭圆形、正方形、矩形和圆弓形。
[0049]该径向截面可具有圆弓形形状，该圆弓形具有大于180°的中心角。该实施例具有下列优点，即:当该器皿绕轴线旋转时(该轴线可选地是外管状元件和内伸长元件两者的轴线)，可获得产生气体腔室的旋转位置。当该器皿旋转至其中上述弦基本水平且所述圆弓形位于该弦上方的位置时，可获得该气体腔室。当该器皿被填充使得介质的液面低于该弦时，介质液面和该弦之间的空间可用作气体腔室。自由介质表面适合在该器皿(可选地是生物反应器的一部分)与该器皿的外部(可选地为生物反应器的外部)之间交换气体。可使用该腔室使其进入或流出该器皿的气体将不与介质直接接触。
[0050]所述内伸长壁可以是管状壁。
[0051 ] 所述内伸长壁可联接在相对于外管状壁而言的固定位置。
[0052]所述内伸长元件可由内伸长元件提供，所述外管状元件由外管状元件提供，该内伸长元件和外管状元件被一体地成型。
[0053]所述内伸长元件和外管状元件可相对于彼此旋转。
[0054]所述外管状壁可以是圆柱形管状壁，它具有基于与其纵向方向垂直的平面的径向截面，该径向截面具有从以下组中选择的形状:圆形、卵圆形、椭圆形、正方形或矩形。
[0055]所述外管状壁和