一种动物细胞融合基础培养基的使用方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种动物细胞融合基础培养基的使用方法。

背景技术：

细胞培养技术始于20世纪初，是指从体内组织取出细胞，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。经过几十年的发展，细胞培养技术现广泛应用于生物、医疗技术、药品等领域，形成了庞大的产业。同时，为了满足市场的不同需求，通过细胞培养技术获得的产品种类也更加多元化。

细胞融合是细胞培养技术的一种应用，其在自发或人工诱导下，将两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。目前，细胞融合技术多用于获取杂交瘤，并用于单克隆抗体的科研和生产。

培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，分为天然培养基和合成培养基。其中，合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法合成的。目前，关于细胞融合培养基进行了很多改造和研究，但通常都忽略了细胞培养基组分的改造所带来的影响，使得细胞融合效率通常偏低。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种动物细胞融合基础培养基的使用方法，以解决现有技术中细胞融合培养基的细胞融合效率低的问题，从而通过提高细胞融合效率，达到高效获取杂交瘤的目的，使得获取单克隆抗体的机率显著增加。

本发明通过下述技术方案实现：

一种动物细胞融合基础培养基的使用方法，包括以下步骤：

(a)准备小鼠骨髓瘤细胞、免疫小白鼠脾细胞、基础培养基、灭菌后4℃保存的聚乙二醇4000、饲养细胞四板，每个板上有96个孔，每孔的体积为100μl；

(b)用基础培养基吹洗小鼠骨髓瘤细胞后，将小鼠骨髓瘤细胞加入至50ml离心管中，并同时加入复苏的免疫小白鼠脾细胞，混匀后离心；

(c)离心完成后除去离心管中的上清液，将细胞沉淀轻轻混匀后，沿着管壁在60秒内加入缓慢加入800μl的peg4000，加完后静置90秒；

(d)加入50ml培养基后离心；

(e)离心完成后除去上清液，加入基础培养基混匀后，用加样枪将其转入板中；

(f)放入5％co2的孵箱培养七天后，全换液；上述步骤中，基础培养基的组分包括：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸二钠、缬氨酸、氯化钙、硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、生物素、氯化胆碱、肌醇、尼克酰胺、d-泛酸、吡哆醛、硫胺素、核黄素、抗坏血酸、维生素b-12、对氨基苯甲酸、叶酸、d-葡萄糖、酚红、丙酮酸钠、胸苷、还原型谷胱甘肽、碳酸氢钠、氢氧化钠、氯化钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸。现有技术中，如hyclone1640培养基，忽略了细胞培养基组分的改造所带来的影响，导致其细胞融合效率较低，为了解决上述问题，本发明通过系统组织工程技术(ztso)进行实验设计和分析，从系统的角度而非理化层面去分析各组分和细胞生长之间的协同性，相较于传统的doe设计和分析，仅通过少量的实验即可确定和细胞培养相关的所有配方组成，并能准确确定每个组分准确的量。经过ztso实验设计和分析，开发出了上述用于动物细胞融合的基础培养基。

为了对比本发明所提供的培养基与现有的hyclone1640培养基的融合效果，进行免疫小白鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合实验。在实验的不同阶段，即融合前、进样补充、融合中使用本发明的培养基和hyclone1640培养基，通过最后孔板上每12个孔中细胞融合的孔的个数，判断细胞融合。实验发现，相比于hyclone1640培养基，本发明提供的培养基能够大幅提升细胞融合效率，若在实验的三个阶段全部采用本发明提供的培养基，细胞融合效率的提升最高，获得阳性杂交瘤的可能性大大增加，具有广泛的应用价值。

进一步地，所述各组分的含量为：丙氨酸10-50mg/l，精氨酸100-300mg/l，天冬氨酸10-50mg/l，天冬酰氨10-50mg/l，胱氨酸10-50mg/l，谷氨酰胺100-500mg/l，谷氨酸10-50mg/l，甘氨酸10-50mg/l，组氨酸10-50mg/l，羟脯氨酸10-50mg/l，异亮氨酸10-50mg/l，亮氨酸10-50mg/l，赖氨酸10-50mg/l，蛋氨酸10-50mg/l，苯丙氨酸10-50mg/l，脯氨酸10-50mg/l，丝氨酸10-50mg/l，苏氨酸10-50mg/l，色氨酸1-10mg/l，酪氨酸二钠10-50mg/l，缬氨酸10-50mg/l，氯化钙10-50mg/l，硫酸镁10-50mg/l，氯化钾200-400mg/l，磷酸二氢钾10-50mg/l，磷酸氢二钠500-1000mg/l，生物素0.1-5mg/l，氯化胆碱0.1-5mg/l，肌醇10-50mg/l，尼克酰胺0.1-5mg/l，d-泛酸0.1-5mg/l，吡哆醛0.1-5mg/l，硫胺素0.1-5mg/l，核黄素0.1-5mg/l，抗坏血酸10-50mg/l，维生素b120.001-0.01mg/l，对氨基苯甲酸0.1-5mg/l，叶酸0.1-5mg/l，d-葡萄糖1000-3000mg/l，酚红1-5mg/l，丙酮酸钠10-50mg/l，胸苷10-50mg/l，还原型谷胱甘肽0.1-5mg/l，碳酸氢钠0.1-3g/l，氢氧化钠0.1-3g/l，氯化钠5-8g/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。

进一步地，所述步骤(a)中的饲养细胞来自于无菌收集的bablc小鼠腹腔，与基础培养基混合后，均匀加入板的孔中，每孔100μl。

进一步地，小鼠骨髓瘤细胞与免疫小白鼠脾细胞数量比为1：20。

进一步地，所述步骤(b)中的离心时间为4～10分钟。

进一步地，所述碳酸氢钠0.8-3g/l，氢氧化钠1.2-3g/l，氯化钠6.5-8g/l，氯化钙30-50mg/l，硫酸镁30-50mg/l，氯化钾300-400mg/l，d-泛酸3-5mg/l，吡哆醛2.5-5mg/l，硫胺素1.8-5mg/l。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明能够大幅提升细胞融合效率，若在细胞融合的各个阶段均采用本发明提供的培养基，细胞融合效率的提升最高，获得阳性杂交瘤的可能性大大增加；

2、本发明组分搭配良好，相比于市面上销售的培养基，成本更低、融合效率更高。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为细胞融合全过程采用不同本发明培养基和hyclonerpmi1640培养基进行细胞融合获得阳性杂交瘤检测孔。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

配制的基础培养基的各组分含量为：丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬酰氨50mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸40mg/l，甘氨酸50mg/l，组氨酸50mg/l，羟脯氨酸10mg/l，异亮氨酸10mg/l，亮氨酸50mg/l，赖氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸50mg/l，脯氨酸50mg/l，丝氨酸50mg/l，苏氨酸50mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二钠10mg/l，缬氨酸10-50mg/l，氯化钙30mg/l，硫酸镁30mg/l，氯化钾300mg/l，磷酸二氢钾10mg/l，磷酸氢二钠1000mg/l，生物素0.1mg/l，氯化胆碱0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.5mg/l，d-泛酸3mg/l，吡哆醛2.5mg/l，硫胺素1.8mg/l，核黄素0.1mg/l，抗坏血酸25mg/l，维生素b120.01mg/l，对氨基苯甲酸0.1mg/l，叶酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚红5mg/l，丙酮酸钠10mg/l，胸苷50mg/l，还原型谷胱甘肽5mg/l，碳酸氢钠0.8g/l，氢氧化钠1.2g/l，氯化钠6.5g/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸3-8g/l。

免疫小白鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合实验：

(a)准备小鼠骨髓瘤细胞、免疫小白鼠脾细胞、基础培养基、灭菌后4℃保存的聚乙二醇4000、饲养细胞四板，每个板上有96个孔，每孔的体积为100μl；

(b)用基础培养基吹洗小鼠骨髓瘤细胞后，将小鼠骨髓瘤细胞加入至50ml离心管中，并同时加入复苏的免疫小白鼠脾细胞，混匀后离心；

(c)离心完成后除去离心管中的上清液，将细胞沉淀轻轻混匀后，沿着管壁在60秒内加入缓慢加入800μl的peg4000，加完后静置90秒；

(d)加入50ml培养基后离心；

(e)离心完成后除去上清液，加入基础培养基混匀后，用加样枪将其转入板中；

(f)放入5％co2的孵箱培养七天后，全换液。

通过在不同阶段添加按上述配方制成的基础培养基，得到的细胞融合率如表1所示：

表1

如表1所示，在各个阶段添加本发明的基础培养基均能提高细胞融合率，其中，在三个阶段均使用本发明的基础培养基能达到83.3％的融合率。相比于现有技术，大幅地提高了细胞融合效率，达到高效获取杂交瘤的目的，使得获取单克隆抗体的机率显著增加，具有广泛地应用价值。

如图1所示，图中第一、二行为hyclonerpmi1640获得的杂交瘤检测孔；第三、四行为本发明的基础培养基获得的杂交瘤检测孔情况。由于无法提供彩色图片，仅能从颜色黑白作出判断，图1中黑色的孔为阳性杂交瘤检测孔，因此，可以看出，采用本发明基础培养基所获得的细胞融合率较现有的hyclonerpmi1640培养基大幅提高。

实施例2

实施例2的操作步骤与实施例1相同，其不同点在于，所使用的基础培养基的各组分含量为：丙氨酸50mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸50mg/l，天冬酰氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺500mg/l，谷氨酸10mg/l，甘氨酸50mg/l，组氨酸10mg/l，羟脯氨酸50mg/l，异亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，赖氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，丝氨酸10mg/l，苏氨酸10mg/l，色氨酸10mg/l，酪氨酸二钠50mg/l，缬氨酸50mg/l，氯化钙10mg/l，硫酸镁10mg/l，氯化钾400mg/l，磷酸二氢钾50mg/l，磷酸氢二钠500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化胆碱0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黄素0.1mg/l，抗坏血酸10mg/l，维生素b120.01mg/l，对氨基苯甲酸0.1mg/l，叶酸0.1mg/l，d-葡萄糖3000mg/l，酚红5mg/l，丙酮酸钠10mg/l，胸苷10mg/l，还原型谷胱甘肽5mg/l，碳酸氢钠3g/l，氢氧化钠3g/l，氯化钠5g/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸3g/l。

实施例3

实施例3的操作步骤与实施例1相同，其不同点在于，所使用的基础培养基的各组分含量为：丙氨酸10mg/l，精氨酸100mg/l，天冬氨酸10mg/l，天冬酰氨10mg/l，胱氨酸10mg/l，谷氨酰胺100mg/l，谷氨酸10mg/l，甘氨酸10mg/l，组氨酸10mg/l，羟脯氨酸10mg/l，异亮氨酸10mg/l，亮氨酸10mg/l，赖氨酸10mg/l，蛋氨酸10mg/l，苯丙氨酸10mg/l，脯氨酸10mg/l，丝氨酸10mg/l，苏氨酸10mg/l，色氨酸1mg/l，酪氨酸二钠10mg/l，缬氨酸10mg/l，氯化钙10mg/l，硫酸镁10mg/l，氯化钾200mg/l，磷酸二氢钾10mg/l，磷酸氢二钠500mg/l，生物素0.1mg/l，氯化胆碱0.1mg/l，肌醇10mg/l，尼克酰胺0.1mg/l，d-泛酸0.1mg/l，吡哆醛0.1mg/l，硫胺素0.1mg/l，核黄素0.1mg/l，抗坏血酸10mg/l，维生素b120.001mg/l，对氨基苯甲酸0.1mg/l，叶酸0.1mg/l，d-葡萄糖1000mg/l，酚红1mg/l，丙酮酸钠10mg/l，胸苷10mg/l，还原型谷胱甘肽0.1mg/l，碳酸氢钠0.1g/l，氢氧化钠0.1g/l，氯化钠5g/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸3g/l。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。