一种南极冰藻6‑4光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用的制作方法

本发明属于生物学
技术领域：
，具体涉及一种南极冰藻6-4光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用。
背景技术：
：人类活动对大气中臭氧层的破坏，尤其是南北两极臭氧空洞的出现、扩大，使得辐射到地球表面的太阳光中紫外线增强，导致生物圈受紫外线伤害日益严重。加之随着生活水平的日益提高，越来越多的人们热衷户外活动，接触紫外线的时间在增多。由于皮肤暴露于外表，皮肤中许多分子吸收uv辐射，并产生各种dna损伤。而dna分子是生命体的遗传物质基础，其完整性是维持生命的根本。若受损的dna得不到及时和有效的修复，细胞将走向凋亡或发生变异并导致细胞癌变。紫外辐射引起dna损伤的根本原因在于其能诱发dna同条链内相邻的嘧啶碱基产生嘧啶二聚体，使dna空间结构发生变化，从而阻碍了dna复制、转录进而影响蛋白质的生物功能。紫外线辐射对生物体dna的主要损害是在dna中形成嘧啶二聚体（cpds）和（6-4）光产物（6-4）pps。这两种光产物阻碍了在dna复制或转录时聚合酶的进程，从而导致生物体dna的紫外辐射损伤，对生物体具有致突变、致癌变和致死等效应。平流层的臭氧减少10%，全球白内障的发病率将增加6～8%，恶性皮肤瘤的发病率将增加26%；人类存在于皮肤中的免疫功能也会因紫外线的强烈辐射而受损伤，抵抗疾病的能力大大降低。光修复作用一种重要的dna修复方法，dna光修复酶承担了修复dna损伤并保持生物遗传稳定性的重要功能。dna光修复酶分为cpd光修复酶和（6-4）光修复酶两种途径，这两种酶均有各自的修复途径，它们的一种酶只能修复一种损伤而不能修复另外一种。利用cpd光修复酶和（6-4）光修复酶分别来修复cpds和（6-4）pps；即光修复酶可以解开嘧啶二聚体和（6-4）光产物，使损伤的dna恢复正常状态。在细菌、昆虫、高等植物、脊椎动物和某些低等哺乳动物体内发现了光修复酶及其基因，但在高等哺乳动物包括人体内尚未发现dna光修复酶的存在。而在高等哺乳动物细胞中，核酸外切修复（ner）是修复dna损伤的最主要途径。哺乳动物（包括人）都缺少光修复系统，而低等生物的光修复酶对人体的dna修复同样有效。人体试验证明光修复酶蛋白可以被人体吸收并发挥功效，为光修复酶用于人类紫外线损伤及其相关疾病防护和治疗产品开发提供可靠科学依据。有部分群体存在ner修复系统缺乏或不完整，表现出各种疾病，最常见的是着色性干皮病(xp)患者，除此之外cockayne综合症和光敏型的毛发硫营养障碍症也存在ner修复系统缺乏。因此，光修复酶也可以应用到以上疾病的治疗。尽管生活在南极强紫外辐射的环境中，南极冰藻仍旺盛生长繁殖，这预示着南极冰藻遗传学上对dna紫线损伤的高效自我修复能力应是其适应这种恶劣环境的关键机制。与其它地区生物相比，南极冰藻中用于修复紫外线损伤dna的光修复酶结构与功能应该有其特异性，才能适应南极这种极为恶劣的强紫外线辐射环境。光修复酶在生物体内的含量极少，每个细胞约有10～20个光修复酶分子，这使得直接从生物体中分离纯化光修复酶并进行其结构、功能活性和作用机制研究极为困难，但随着基因克隆技术的发展，可以利用基因工程手段克隆南极冰藻光修复酶基因，并将其转化到目的宿主中，完成光修复酶的过量表达和纯化，并对其进行详细的研究。dna光修复酶分为cpd光修复酶和（6-4）光修复酶两种，这两种酶的一种酶只能修复一种损伤而不能修复另外一种。本发明人在国内外首次开展了南极冰藻cpd光修复酶及其作用机制的研究工作，发明（cn103160488b）提供了一种南极冰藻cpd光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用。但是较之cpd光修复酶，对（6-4）光修复酶及修复机理方面的认识要少得多，尤其是关于强紫外线辐射生境中南极生物（6-4）光修复酶尚未见研究。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供了一种南极冰藻6-4光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用，本发明是将6-4光修复酶的编码基因克隆到表达载体中，得到6-4光修复酶，并将6-4光修复酶合理应用到化妆品、生物医药等相关领域，解决了
背景技术：
中存在的技术问题。本发明对于生物（包括人类）紫外线辐射损伤修复及其相关疾病防治具有重要理论和实际意义。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种南极冰藻6-4光修复酶，其氨基酸序列如seqidno:2所示。进一步的：所述南极冰藻6-4光修复酶的等电点为8.86，相对分子质量为63.1kda。本发明还提供了所述的南极冰藻6-4光修复酶的编码基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。进一步的：克隆所述编码基因的引物为：f：atggcttctgtgaccggcaa；r：tcactctgtctccttcttgctt。本发明还提供了含有所述的南极冰藻6-4光修复酶编码基因的表达载体。所述表达载体为bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr。进一步的：所述表达载体还包括选择性标记基因，包括但不限于：在表达菌株中产生颜色变化的酶的基因、或发光化合物的基因、或具有抗生素标记物的基因。本发明还提供了所述的南极冰藻6-4光修复酶在用于制备修复紫外损伤的制剂中的应用。本发明还提供了所述的南极冰藻6-4光修复酶在用于制备化妆品中的应用。由于采用了上述技术方案，本发明的优点和有益技术效果是：本发明通过race得到南极冰藻（6-4）光修复酶的基因cdna全长，同时，根据该基因片段序列设计引物，进行pcr扩增获得全长（6-4）光修复酶基因。同时，通过荧光定量pcr检测该基因在紫外胁迫和强光照射条件下的表达模式。将该基因克隆到原核克隆载体pmd18-t，进行测序验证。将构建好的重组载体经酶切后连接原核表达载体pet-28a(+)，在大肠杆菌bl21中表达。最终经过亲和层析得到纯化蛋白。为了方便过量表达菌株的鉴定和筛选，可对表达载体进行加工，如加入可产生颜色变化的酶或发光化合物基因(如gfp基因、荧光素酶基因等)，或具有抗性的抗生素标记物。本发明将获得的所述南极冰藻（6-4）光修复酶应用于保健品、化妆品、生物医药等相关领域以主动修复由紫外线引起病症。例如，防晒霜可以将皮肤与紫外线隔离开来，通过对光的反射和吸收两种机制起作用，以减少紫外线对皮肤的损伤，但无法对损伤的皮肤进行修复。本发明的重组蛋白dna光修复酶可以作为高级护肤品的功能成分，主动修复由紫外线引起的红斑、皮肤炎症以及基因损伤，延缓衰老，彻底突破了当前“防”紫外线的概念。本发明首次克隆了南极冰藻（6-4）光修复酶基因，并成功将其克隆到表达载体中，获得大量（6-4）光修复酶，并将（6-4）光修复酶应用到保健品、化妆品、生物医药等相关领域，能够主动修复由紫外线引起病症，带来巨大的社会效益，意义重大。附图说明图1是sds-page电泳图。图2是（6-4）光修复酶与dna的结合实验结果。图3是对照组小鼠皮肤（左）及组织切片（右）图，标尺示100μm。图4是紫外照射组小鼠皮肤（左）及组织切片（右）图，标尺示100μm。图5是治疗组小鼠皮肤（左）及组织切片（右）图，标尺示100μm。具体实施方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南》。实施例1：南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶cdna序列的获得1、南极冰藻的培养、总rna的分离将南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（从2001年11月中国第十八次南极科学考察期间在中山站（69°s,77°e）附近采集的海水和海冰样品中分离纯化得到，保存在国家海洋局海洋生物活性物质重点实验室南极冰藻藻种库中）采用f/2培养基，培养温度为0～6℃，培养光强为1300～1900lux,光照周期12:12。不充气，每日摇动3次。接种量为20％。培养基成分（mg/l）：过滤陈海水，kh2po415，nano315，fec6h5o70.4，脲20。4℃培养至对数期，用invitrogen公司的trizol进行rna的提取。试验按照trizol试剂的提取流程说明进行操作，在整个过程中保证无rnase污染，将提取的rna分装成小份，冻存于-80℃冰箱备用。2、（6-4）光修复酶基因cdna序列的获得根据获得的南极冰藻转录组序列，筛选出（6-4）光修复酶基因片段，发现该基因5’完整，因此，根据片段序列设计引物进行3’-race：3’-race引物：gsp1：5’-gtggggttggattcatcacttggctcgt-3’（seqidno:3）；gsp2：5’-ggattcatcacttggctcgtcactcggt-3’（seqidno:4）；3’-race反转录体系如下：模板rna，0.5μg1.0μl；3’-cds引物a1.0μl；rnasefreeh2o4.75μl；样品混匀后，70°c3min，,42°c2min，14,000g离心10s；5×first-strandbuffer2.0μl；dtt，20mm1.0μl；dntp，10mm1.0μl；rnaseinhibitor，40u/μl0.25μl；smartscribereversetranscriptase，100u/μl1.0μl。轻微振荡后离心数秒钟；于42℃90min，70℃10min，冰上急冷2min以上；用tricine-edtabuffer稀释，保存于-20℃，待用。3、将获得的高质量rna进行反转录，合成cdna，进行pcr反应，pcr反应体系如下：pcr-grade-water34.5μl；10×advantage2pcrbuffer5.0μl；dntpmix，10mm1.0μl；50×advantage2polymerasemix1.0μl；5’/3’-racereadycdna2.5μl；upm，10×5.0μl；gsp1/21.0μl。pcr反应条件为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，27个循环。4、pcr结束后用1.0％的琼脂糖进行回收，连接到pmd18-t，转化e.colidh5α，进行测序验证；利用ncbi在线工具，即http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi，将所得序列应用blast程序进行序列同源性比对和相似性分析；用dnastar软件进行序列拼接，并在ncbi中比对，以确认获得目的基因为6-4光修复酶基因的完整编码区序列（核苷酸序列如seqidno:1所示）。实施例2、南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶表达载体构建1、根据测序得到的光修复酶基因完整序列设计引物：（6-4）f：5’-atggcttctgtgaccggcaa-3’（seqidno:5）；（6-4）r：5’-tcactctgtctccttcttgctt-3’（seqidno:6）；pcr反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，55℃退火1min，72℃延伸2min反应进行30个循环。2、将光修复酶基因的pcr扩增产物和原核表达载体pet-28a(+)，分别用ecorⅰ和xhoⅰ于37℃酶切2h，用1.0%的琼脂糖分别进行回收，将纯化好的目的片段及载体用t4dna连接酶于16℃下连接16h，得到重组质粒。连接体系如下。反应体系体积6-4phr3.5μl；pet-28a(+)4.5μl；连接酶1μl；连接缓冲液1μl；反应总体系10μl。3、将连接好的重组质粒转化大肠杆菌dh5α，步骤如下：(1)取感受态细胞300μl于1.5ml离心管中，冰浴5min。(2)于每管中加入5μl连接过的质粒，轻轻旋转以混合内容物，冰浴30min。(3)42℃热休克90s，不要摇动试管。(4)取10ml无菌试管，每管加入800μllb液体培养基，冰浴。(5)取转化后的细胞200μl加入800μllb液体培养基中，37℃150rpm振荡培养45min。(6)将100μl转化的菌液涂布于平板表面，37℃培养培养12～16h。4、挑取白色的菌落分别置于5ml含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养8～12h，碱裂解法提取质粒以进行酶切鉴定。鉴定正确的质粒以相同方法转化大肠杆菌bl21(de3)，测序鉴定得到重组菌株bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr。实施例3、极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶的纯化及蛋白检测1、将重组菌株bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr接种于5ml含卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃振荡过夜培养。次日取5ml菌液接入500ml相同的培养基继续培养2～3h（od600约0.6）后，加入终浓度为1mm的iptg，于10℃振荡培养24h，8000g离心10min，收集菌体。2、ni琼脂糖亲和柱亲和层析：将金属螯合剂ni琼脂糖装入层析柱，用1×ni柱结合缓冲液平衡。将上清液上柱。一般用50mm咪唑洗脱，得到目的蛋白即所述南极冰藻（6-4）光修复酶，其氨基酸序列如seqidno:2所示。3、取上述诱导表达的bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr菌体和纯化的6-4phr基因表达的蛋白质，分别与等体积的2×上样缓冲液混合，100℃水浴3～5min。配制12%的sds-page分离胶和5%的浓缩胶，取20μl加样于凝胶，在浓缩胶中100v，分离胶中120v，进行sds-page电泳，电泳结束进行考马斯亮蓝染色。结果如图1所示，其中m表示标准分子量，1和2为bl21(de3)/pet-28a(+)/6-4phr菌体蛋白，而3，4，5和6表示不同分离阶段制备的南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶。图1说明，利用上述方法能够得到南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶。实施例4、南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶蛋白序列分析获得的的南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶基因的开放阅读框（orf）长度为1680bp，编码559个氨基酸残基。（6-4）光修复酶等电点为8.86，测定的相对分子质量为63.1kda。将南极衣藻chlamydomonassp.ice-l的（6-4）光修复酶的氨基酸序列在ncbi上进行同源性比对，在核酸数据库中没有明显的序列同源性。发现南极衣藻（6-4）光修复酶的氨基酸序列与盐生杜氏藻（6-4）光修复酶的亲缘关系最近。实施例5、南极冰藻chlamydomonassp.ice-l（6-4）光修复酶修复紫外损伤的作用检测1、南极冰藻（6-4）光修复酶基因重组菌株接种于三角烧瓶中，在摇床中进行培养。6000r•min-1离心收获菌体。超声破碎菌体，10000r•min-1离心去除菌体碎片，上清液先用超滤仪收集50000-100000da组分进行初步分离，经过镍亲合柱层析分离，再经sepharosefastflow进一步纯化，得到南极冰藻（6-4）光修复酶基因表达产物。2、向人工合成的d(pt)16中加双蒸水溶解，使d(pt)16浓度为10μmol。将d(pt)16加至石英比色皿中，100μw/cm2uvb照射，每10min测定一次引物od325值，至od325值恒定。先按照下面体系中对照组的体系配制溶液。实验组：对照组：0.01mol/ldtt50μl0.01mol/ldtt50μl酶50μl酶50μl10μmold(pt)1650μl供试buffer900μl供试buffer850μltotalvolume1000μltotalvolume1000μl将实验组和对照组置于相同光照条件下（蓝光）修复。使用emsa凝胶阻滞迁移电泳检测的方法进行酶活测定，检测其体外修复活性和了解其修复过程。通过检测（6-4）光修复酶与dna的结合程度，计算其对6-4光产物的修复率。实验结果如图2所示。实施例6、所述（6-4）光修复酶在化妆品领域中的应用在紫外线损害下，人体肌肤加速衰老。dna光修复酶可以保护皮肤免受紫外线的损伤，改善皮肤的健康状况，长期使用可以减少皮肤病和皱纹。本实施例中，采用卵磷脂及胆固醇包埋实施例3纯化后的南极冰藻（6-4）光修复酶，后添加至化妆品中。选择6周左右的小鼠，阳性对照涂抹光修复酶，对其背部皮肤进行紫外照射实验，每只小鼠经过3天重复处理，制作皮肤切片，进行苏木素-伊红染色。实验结果如图3-5所示，紫外辐射损伤小鼠表皮会明显增厚，而涂抹南极冰藻（6-4）光修复酶的小鼠表皮具有明显修复功能。因此，可以将南极冰藻光修复酶添加到化妆品中。实施例7、所述（6-4）光修复酶在生物医药领域中的应用红斑反应是以一定剂量的紫外线照射皮肤后，经过一段时间，照射皮肤呈现边界清楚、均匀充血的反应。用254nm波长紫外线照射小鼠背部皮肤30min，12h产生红斑，随机选取小鼠在红斑附近皮肤进行皮下注射，每天注射0.1mg南极冰藻（6-4）光修复酶，连续3天，实验结果表明1周后治疗组红肿皮肤有明显改善。南极冰藻光修复酶可以应用于医药领域。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。sequencelisting<110>国家海洋局第一海洋研究所<120>一种南极冰藻6-4光修复酶、其编码基因和表达载体以及该酶的应用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>1680<212>dna<213>南极冰藻<400>1atggcttctgtgaccggcaaagccaaaatcgtgtggttcagaaagggtttacgactgcat60gacaacccagccctcattgaggcctgtcgtggagctgcccatgtgtaccccatcttcatc120ctagatccccacttccgtagtgctggttacaaggttggagtgaaccgttttaaattcctc180atgcaatctctgacagatctaaatgacagctttgaggcaaggggatcccgcttgttggtt240ctgagagggaaaccagaggatgtgcttccacaagtgttcaaggactggcaggtagatgag300ctttgctatgaggtggataccgagccctacgctgttttgagggatgcacatgtgagcagc360cttgctaaagcagccaacgttgaagtgaagtcgtttgtcagtcacacactatacgatact420gccgacattgttgagaggaacgggggaaagccaccactcacctaccagtccttcattaag480ctggttgacaagatgggagaccctacagcacctgcacctgatcccccagagaagatgccc540ccgcccagggatgatcttccgggtgcagccccccaggagacatcggtcccaactttgaag600gagataggctatgaccaagagcccactgcgcccttcaagggaggagagagagaagcactg660gctcgcatggatacctacctttcggacaagctgtgggtggcaaactttgagaagcctcag720acagacccaagcgcctttgaaaagcctgcgaccaccactctgtcaccgtacctaaagttt780ggatgcctctctccccggctcttccacactagactgctacagatatacaaggagcagaag840aagcactcagagcccccggtgtccttaaggggccaactgctgtggagagagttcttctac900acggtgggtgcccacactcccaacttcagccacatggtaggcaacaccgtgtgccgccaa960atagactggagacaccaggacgcggcaacagctgattctgaggcggagcagcatcttgcg1020gcatggaaggctggccgcactggcttcccctggattgatgccatcatgacacagctgcat1080gagtggggttggattcatcacttggctcgtcactcggtggcatgcttcctcacaagaggg1140gacttgtacatctcatgggagcgaggccaggaggtgtttgaggagctgttgctggaccag1200gaccacttcatcaatgctgggaactggatgtggctctccgcatctgctttcttctcgcag1260tacttcagggtgtacagcccagttgtttttgggaagaagtacgaccctgagggaaagtac1320attcgcaagttcttgcctgtgctcaaggacatgccagccaagtacatctacgagccatgg1380ctcgccccgactgaggtccagaagaaagccaagtgcatcatcggggtggactacccgcgt1440cccatagtcgatcacagcattgccagcaagcagaacattgggcgcatggctgcagcttac1500aaggcgaacaagggggaaggagaaggggaggccgctgatactcctaagaaggccgccaaa1560cccaggaaagctgccgcacccaaagctgcaaagaaggaggcgacagatgttgtttctggg1620aagggggcgaagcggcagcggacgatgaaagagtttgcaagcaagaaggagacagagtga1680<210>2<211>559<212>prt<213>南极冰藻<400>2metalaservalthrglylysalalysilevaltrpphearglysgly151015leuargleuhisaspasnproalaleuileglualacysargglyala202530alahisvaltyrproilepheileleuaspprohispheargserala354045glytyrlysvalglyvalasnargphelyspheleumetglnserleu505560thraspleuasnaspserpheglualaargglyserargleuleuval65707580leuargglylysprogluaspvalleuproglnvalphelysasptrp859095glnvalaspgluleucystyrgluvalaspthrgluprotyralaval100105110leuargaspalahisvalserserleualalysalaalaasnvalglu115120125vallysserphevalserhisthrleutyraspthralaaspileval130135140gluargasnglyglylysproproleuthrtyrglnserpheilelys145150155160leuvalasplysmetglyaspprothralaproalaproasppropro165170175glulysmetproproproargaspaspleuproglyalaalaprogln180185190gluthrservalprothrleulysgluileglytyraspglnglupro195200205thralaprophelysglyglygluargglualaleualaargmetasp210215220thrtyrleuserasplysleutrpvalalaasnpheglulysprogln225230235240thraspproseralapheglulysproalathrthrthrleuserpro245250255tyrleulyspheglycysleuserproargleuphehisthrargleu260265270leuglniletyrlysgluglnlyslyshissergluproprovalser275280285leuargglyglnleuleutrparggluphephetyrthrvalglyala290295300histhrproasnpheserhismetvalglyasnthrvalcysarggln305310315320ileasptrparghisglnaspalaalathralaaspserglualaglu325330335glnhisleualaalatrplysalaglyargthrglypheprotrpile340345350aspalailemetthrglnleuhisglutrpglytrpilehishisleu355360365alaarghisservalalacyspheleuthrargglyaspleutyrile370375380sertrpgluargglyglngluvalpheglugluleuleuleuaspgln385390395400asphispheileasnalaglyasntrpmettrpleuseralaserala405410415phepheserglntyrpheargvaltyrserprovalvalpheglylys420425430lystyraspprogluglylystyrilearglyspheleuprovalleu435440445lysaspmetproalalystyriletyrgluprotrpleualaprothr450455460gluvalglnlyslysalalyscysileileglyvalasptyrproarg465470475480proilevalasphisserilealaserlysglnasnileglyargmet485490495alaalaalatyrlysalaasnlysglygluglygluglyglualaala500505510aspthrprolyslysalaalalysproarglysalaalaalaprolys515520525alaalalyslysglualathraspvalvalserglylysglyalalys530535540argglnargthrmetlysgluphealaserlyslysgluthrglu545550555<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列<400>3gtggggttggattcatcacttggctcgt28<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列<400>4ggattcatcacttggctcgtcactcggt28<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5atggcttctgtgaccggcaa20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6tcactctgtctccttcttgctt22当前第1页12