专利名称：一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及假丝酵母尿酸氧化酶基因的克隆、基因工程表达和含有假丝酵母尿酸氧化酶的制剂作为人类痛风及血液系统肿瘤化疗所引起的高尿酸血症的治疗药物。
假丝酵母尿酸氧化酶全长303个氨基酸，分子量为34.19kDa，等电点为8.4。尿酸氧化酶(UOX)是嘌呤代谢途径上的关键酶之一。不同种类的生物分解嘌呤碱的能力不一样，因而代谢产物亦各不相同。人和猿类及一些排尿酸的动物以尿酸作为嘌呤碱代谢的终产物。假丝酵母和大鼠等多种生物则能产生尿酸氧化酶，该酶进一步分解尿酸，形成尿囊素。后者在水中的溶解度远大于尿酸，从而有利于大鼠等哺乳动物清除体内尿酸。在长期的进化过程中，人类的尿酸氧化酶基因发生突变，不能正常编码尿酸氧化酶，因此当体内尿酸水平增加时容易引起以血液尿酸水平增高为特征的痛风或者尿酸性肾病。在临床上，由于UOX能够分解尿酸，可有效地分解尿酸，降低血液尿酸浓度，因此可以用来治疗高尿酸血症。
多年来，国外一直使用从黄曲霉菌中提取的尿酸氧化酶，国内也有进口。2002年FDA批准了法国Sanofi公司研制的重组黄曲霉菌尿酸氧化霉，用于青少年及儿童白血病、淋巴瘤化疗后高尿酸血症的预防和治疗。我们通过PCR的方法，从假丝酵母基因祖DNA中扩增出UOX基因，经过对SD序列等原核表达元件的优选，构建了高效原核表达质粒，转化原核细胞获得了高水平外源基因表达，表达产物经离子交换等手段得到了纯化。
本发明采用下述技术方案(1)本发明首先设计合成了人用于扩增假丝酵母UOX基因的特异性引物。为了保证扩增的专一性，该两条引物理论退火温度旁设为72℃。上游引物长16-46bp，下游引物长16-45bp。根据原核表达原理，考虑到SD序列等因素在不同类型质粒中对表达效率的影响，在上游引物5’端添加EcoRI或者其它酶切位点，优选EcoRI以适应最佳表达元件搭配要求，提高目的基因在宿主菌中的表达水平。以假丝酵母AS2.1495基因组DNA为模板，以两步法扩增目的基因，得到了专一的目的基因产物。得到的PCR产物与pUC19连接，测序正确后将PCR扩增产物插入国内外已广泛采用的高效表达载体pBV220或者其它原核表达载体中，优选pBV220质粒构建成假丝酵母尿酸氧化酶表达质粒pUOX。它能在大肠杆菌JM109和DH5α中高表达，使尿酸氧化酶占菌体总蛋白的50-60％左右，表达率经100次以上传代不降低。
(2)通过发酵工程菌，用2YT作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物OD600值可达25左右，生物量为每升培养物30-35g，产物表达率在50-60％之间。产物表达量可达每升培养物400mg以上，真正实现了高水平表达。
(3)在发酵基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、酸处理去除杂蛋白、阳阴离子交换层析和凝胶排阻层析精制等。
所建立的工艺稳定、回收率高、活性好。本工艺具有以下特点①通过酸处理去除了30％以上的可溶性蛋白，而目标蛋白尿酸氧化酶无损失；②阳、阴离子交换层析可去除几乎所有的剩余杂蛋白；③最后一步凝胶排阻层析可以去除大小分子量的酸性杂质。本工艺对三批各22.5L发酵产物纯化后每批可得纯品5-8g。
(4)纯品加入药用甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于高尿酸血症的治疗。
本品在体外能明显降低血清中的尿酸浓度，据此可以测定重组假丝酵母尿酸氧化酶的生物活性。
本发明运用重组DNA技术，采用PCR扩增的方法克隆了尿酸氧化酶基因，运用合理的表达元件组合提高了产物的表达，且产物主要以可溶性形式存在于大肠杆菌胞浆内，产物活性高。下游纯化方式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。本产品用于人类痛风及血液系统肿瘤化疗所引起的高尿酸血症的治疗，能得到显著的疗效。
本发明用下述实施例进行说明实施例1、特异性引物序列设计根据引物设计原则，预定退火温度为72摄氏度，并在上、下游引物5′端分别加入优选后的EcoRI酶切位点和BamHI酶切位点，序列如下上游引物5′CggAATTCATg TCA ACA ACg CTC TCA TCA TCC ACCTAC ggC AA3′下游引物5′CgggATCCTTA CAA CTT ggT CTT CTC C3′实施例2、全长片段的克隆、测序鉴定1)PCR扩增以假丝酵母基因组DNA为模板，加入上述引物、Taq酶等组分建立反应体系，94℃预变性3min后，按照94℃30s-72℃60s的顺序进行38个循环，最后在72℃下反应7min，4℃保存。
2)回收PCR产物，双酶切(EcoRI、BamHI)后与同样酶切的质粒pUC19连接，转化到JM109或DH5α受体菌，蓝白斑筛选获得阳性转化子，挑选20个转化子测序。
3)测序结果表明，上述20个转化子克隆只有一个序列与预期结果完全一致(测得的核苷酸序列见表1)。
实施例3、表达载体的构建从pUC19/UOX酶切获得目的基因片段，回收后连接已双酶切的pBV220表达载体成为原核表达质粒pUOX，转化优选的DH5α大肠杆菌后用PCR方法筛选阳性克隆，且酶切正确。含有以上表达质粒的DH5α工程菌经扩增培养、42℃诱导，在34kd左右多出一条蛋白条带。
实施例4、重组假丝酵母尿酸氧化酶的发酵生产工程菌30℃过夜培养后，按5％比例接种于2YT培养基中，30℃培养到OD600为4.0时，升高温度至42℃，4h后收集菌体。在表达的不同时机加氮源、碳源等营养素。最终发酵产物密度可达OD600为25，生物量为每升培养物30-35g。电泳鉴定尿酸氧化酶表达水平，薄层扫描显示尿酸氧化酶占菌体总蛋白的50-60％之间。
实施例5、工程菌的保存及稳定性工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌种可用琼脂LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行酶切鉴定，结果三者相同。同时三个菌扩增培养物的产物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例6、重组尿酸氧化酶的分离纯化重组尿酸氧化酶在菌体内主要以可溶性形式存在于菌体胞浆内，菌体破碎后离心回收上清，上清用稀盐酸调pH2.0离心收集上清，产物得到初步纯化。上清再经CM-Sepharose柱层析可以得到电泳纯的重组尿酸氧化酶。最后用Sephacryl S-100精制得到34kd的重组尿酸氧化酶。
实施例7、重组尿酸氧化酶产物的鉴定SDS-PAGE和HPLC检定重组假丝酵母尿酸氧化酶纯度均在98％以上，体外尿酸氧化实验表明其具有明显的生物活性。N末瑞蛋白质序列分析表明，重组假丝酵母尿酸氧化酶与天然蛋白序列相同，顺序是Met-Ser-Thr-Thr-Leu-Ser-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Lys-Asp-Asn-Val--。
实施例8、无菌过滤、分装、冻干根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂重组假丝酵母尿酸氧化酶每支含1.2mg，缓冲体系为10mMPB，pH6.8，5％甘露醇，以上辅料必须符合注射用药的要求。
无菌过滤在环境洁净度达到100级的条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤，分装、冻干、封口、贴签、装箱。保存于2～8℃的冷藏环境中。
实施例9、活性测定根据Legoux R.等提供的方法[文献J.Biol.Chem.1992，267(12)8565-8570]，测定含有尿酸氧化酶的尿酸溶液在292nm紫外吸收值变化，可以观察到重组尿酸氧化酶的活性。
附表1.假丝酵母尿酸氧化酶基因序列atgtcaacaacgctctcatcatccacctacggcaaggacaacgtcaagttcctcaaggtcaagaaggacccgcaaaacccaaagaagcaggaggttatggaggccaccgtcacgtgtctgcttgaaggtgggttcgacacctcgtacacggaggctgacaactcgtccatcgtgccaacagacaccgtgaagaacaccattctcgtgttggcaaagaccacggagatttggccaattgagagatttgcagccaagctggccacgcactttgttgagaagtactcgcacgtctctggcgtctccgtcaagattgtccaggacagatgggtcaagtacgccgttgatggcaagccacacgaccactcttttatccacgaaggtggtgagaagagaatcactgacctgtactacaagagatccggtgattacaagctgtcgtctgccatcaaggacttgacggtgctgaagtccaccggctcgatgttctacggctacaacaagtgtgacttcaccaccttgcaaccaacaactgacagaatcttgtccaccgacgtcgatgccacctgggtttgggataacaagaagattggctctgtctacgacatcgccaaggctgcagacaagggaatctttgacaacgtttacaaccaggctagagagatcaccttgaccacctttgctctcgagaactctccatctgtgcaggccacgatgttcaacatggctactcagatcttggaaaaggcatgctctgtctactcggtttcatacgccttgccaaacaagcactacttcctcattgacttgaaatggaaaggtttggagaacgacaacgagttgttctacccatctccacatccaaatgggttgatcaagtgtactgttgtccgtaaggagaagaccaagttgtaa
权利要求
1.一种制备假丝酵母尿酸氧化酶的方法。
2.权利要求1的方法需合成上游和下游两条特异性引物。
3.权利要求2的上游引物是如下序列-5′YYXXXXXXATgTCA ACA ACg CTC TCA TCA TCC ACC TAC ggC AAg gA 3′-上从5′端开始的16-46个碱基，其中Y是A、T、C、g中的任意一种，XXXXXX是gAATTC、ggATCC、CATATg、ATgCAT中的任意一种；权力要求2的下游引物是如下序列-5′YYMMMMMMTTA CAA CTT ggT CTT CTC CCT TAC ggA CAACAg TAC A 3′-上从5′端开始的16-45个碱基，其中Y是A、T、C、g中的任意一种，MMMMMM是gAATTC、ggATCC、CATATg、ATgCAT、AAgCTT、gTCgAC中的任意一种。
4.权利要求3的引物用于扩增假丝酵母AS2.1495基因组DNA上的尿酸氧化酶基因。
5.权利要求4的扩增方法为两步法。
6.权力要求5得到的产物用相应的核酸内切酶消化后插入到pBV220载体构建高效表达质粒pUθX，不仅限于pBV220载体。
7.权利要求6的原核表达质粒pUOX转化DH5α大肠杆菌(不仅限于DH5α菌)，发酵后得到高水平表达的重组假丝酵母尿酸氧化酶。
8.权力要求7得到的尿酸氧化酶通过离子交换、凝胶过滤等纯化过程得到纯度98％以上的假丝酵母尿酸氧化酶。
9.权力要求8所得物质中加入保护剂等辅料后冻干成为冻干制剂。
10.权利要求9的假丝酵母尿酸氧化酶制剂应用于人类痛风及血液系统肿瘤化疗所引起的高尿酸血症的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种假丝酵母尿酸氧化酶(Urateoxidase，简称UOX)的制备方法。本发明利用原核表达原理与技术，优选了SD序列等相关表达元件，通过PCR方法克隆了假丝酵母(AS2.1495)UOX基因并选用pBV220载体构建了重组质粒，转化大肠杆菌工程菌DH5α或者JM109并经42摄氏度诱导表达，表达量达到菌体总蛋白的50－60％。工程菌经过发酵、破菌后保留上清。上清经过酸沉淀、阳离子交换、阴离子交换方法纯化产品。纯品加入保护剂后制成药用冻干制剂。该制剂用于高尿酸血症的治疗。
文档编号C12N15/70GK1536078SQ03109150
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月7日 优先权日2003年4月7日
发明者吴彦卓, 徐明波, 陈遥, 王勇波, 卢安京, 王俊玲, 张蕊, 陈起迅, 李亚军, 崔铁民 申请人:北京双鹭药业股份有限公司