专利名称：一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法。
背景技术：
白介素(interleukin)，白细胞介素的简称，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白介素一2即白细胞介素一2(interleukin-2，IL_2)，是白介素家族中的一员，又名T细胞生长因子，主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生，其具有广泛生物活性，可以作用于所有T细胞亚群。重组人白介素一 2(rhIL-2)，通常由原核表达载体表达，与白介素IL-2相比，重组人白介素_2在N末端多一个甲硫氨酸Met，其具有人白介素_2的主要功能，可促进T淋巴细胞增殖，激活淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)，促进β —干扰素的产生，对免疫应答 的产生和调节有重要作用，是目前调控免疫应答的重要因子，临床上已显示出具有较好的抗肿瘤活性。在用作外源蛋白质药物时，由于其具有不同于人白介素_2的结构，属于天然抗原，具有较强的免疫原性，反复注射会引发受试者的免疫反应，使得患者依从性较差。此外还会受到各种蛋白酶的攻击而容易失去生物活性，且生物半衰期短，无法充分发挥其生物活性，且为了维持其在体内有效的血药浓度，需要多次给药，导致患者依从性差，严重影响了其药理作用的发挥，限制了其临床应用。针对上述问题，研究人员采用了各种药物传递技术来提高其疗效，诸如采用不同的给药途径、不同的药物缓释控释技术、不同高分子材料的修饰等。而目前研究最为广泛和成熟的是聚乙二醇[Polyethylene glycol),PEG]修饰技术。PEG具有良好的生物相容性，高度的亲水性，在水溶液中具有较大的水动力学体积，且无免疫原性。PEG修饰技术主要是通过PEG的端基活化后与蛋白药物或多肽上的残基基团进行反应形成PEG-蛋白偶联物。实验证明，PEG偶联的蛋白质药物或多肽可以延长蛋白质药物在体内的半衰期，降低其免疫原性和抗原性；另外还可以减弱蛋白酶的水解作用，增加蛋白分子的可溶性等。目前关于PEG修饰白介素-2的研究报道中，PEG的分子量大都采用5kDa IOkDa,所得到的偶联物是多修饰产物，均一性比较差，且活性损失较大，不易控制质量和放大生产。一般来说，分子量越小，在相同反应条件下的修饰率越高，对产物活性的影响也就越大。而采用分子量较大的PEG修饰时，由于会受到空间位阻作用，所得到的偶联产物将较为均一，且产物的活性损失也比较小。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，旨在解决PEG修饰重组人白介素2时出现的偶联产物均一性比较差，且活性损失较大的问题。本发明实施例是这样实现的，一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，包括以下步骤:用活化剂将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)活化，得到单甲氧基聚乙二醇活化分子；将该单甲氧基聚乙二醇活化分子与重组人白介素2在pH为7.5^9.0的缓冲液中反应，然后加入甘氨酸溶液终止该反应，将反应产物分离纯化，其中该活化剂选自:琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N，N’-羰基二咪唑、N，N’ - 二琥珀酰亚胺基·碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯。本发明实施例还提供一种由本发明的方法制备的聚乙二醇修饰的重组人白介素2。本发明的制备方法采用大分子量的mPEG来修饰重组白介素_2上的氨基残基，该方法步骤简单，易于操作，合成效率高，易于控制质量和放大生产。通过本发明的制备方法制得的聚乙二醇修饰的重组人白介素2能够保留较高的抗病毒活性，同时与未修饰的rhIL-2相比，其免疫原性较低，体内半衰期延长，血清清除率低，无需多次给药，而且本发明制备的mPEG-rhIL-2，其分子量均一性较好。
具体实施例方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，包括以下步骤:SOl用活化剂将mPEG活化，得mPEG活化分子；S02将该mPEG活化分子与重组人白介素2在pH为7.5^9.0的缓冲液中反应，然后加入甘氨酸溶液终止该反应，将反应产物分离纯化。具体地，在步骤SOl中使用的单甲氧基聚乙二醇(MethoxyPolyethyleneGlycol),简称mPEG,是聚乙二醇的一种,具有良好的水溶性、润湿性、润滑性、生理惰性、对人体无刺激、性质温和。在优选实施例中，步骤SOI中使用的mPEG的分子量在IOkDa IOOkDa之间，进一步优选为IOkDa 50kDa之间，更优选为IOkDa 30kDa。该步骤SOl中，该活化剂选自琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N, N’ -羰基二咪唑、N, N’ - 二琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯。 在优选实施例中，活化剂可选用琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺混合物，此种情况下，还采用了吡啶作为催化剂。该优选实施例能显著提高步骤SOl中的活化反应速率。上述步骤SOl中的活化反应过程中，以摩尔量计，活化剂加入量略多于mPEG的加入量即可，或者采用更多量的活化剂。在优选实施例中，单甲氧基聚乙二醇活化分子与所述活化剂的摩尔比为1:2-1:20o通过上述步骤SOl中的活化剂活化后，可获得mPEG琥珀酰亚胺碳酸酯、mPEG-对甲苯磺酰氯、mPEG羰酰咪唑、mPEG琥拍酰亚胺琥拍酸酯、mPEG对硝基苯碳酸酯、mPEG苯并三唑碳酸酯、mPEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、mPEG-琥珀酰酯乙酸酯等mPEG活化分子，这些mPEG活化分子分别与上述活化剂对应。这些mPEG活化分子与上述步骤S02中的重组人白介素2作用后使mPEG与重组人白介素2偶联,得到mPEG修饰的重组人白介素2,而上述活化剂游离出来，不与重组人白介素2结合。具体地，在上述步骤S02中，重组人白介素rhIL-2可从市场购得，也可利用大肠杆菌等原核表达载体重组表达获得，采用后一种方式获得时，其制备方法为本领域技术人员熟知。在优选实施例中，在上述步骤S02中，mPEG活化分子与重组人白介素2的反应在0-25°C反应，反应时间为2 24h。在优选实施例中，该步骤S02中mPEG活化分子与重组人白介素2的摩尔比为2:1飞0:1，在mPEG活化分子过量 的情况下便于使重组人白介素2分子充分偶联。在优选实施例中，在步骤S02中，上述该mPEG活化分子与重组人白介素2反应在磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液PH为7.5-9.0,使用此种反应缓冲液便于后续的分离纯化操作，且分离纯化操作中使用的缓冲液与步骤S02偶联反应对应，即步骤S02中偶联反应与分离纯化均使用磷酸盐缓冲液或均使用硼酸盐缓冲液。在优选实施例中，在步骤S02中，所述甘氨酸溶液的浓度为0.5-0.6M，优选浓度为0.5M。经上述反应，mPEG与重组人白介素2偶联，可得到多种不同分子量的偶联产物，因此需要对粗产物进行分离和纯化。在优选实施例中，对粗产物进行分离和纯化处理是使用离子交换色谱进行分离，该分离过程中使用PH为5.(Γ8.0磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，且该磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液中含有0-0.2M的梯度NaCl ;在该分离之后进行纯化操作，该纯化操作优选通过凝胶渗透色谱进行，该纯化过程中使用PH为6.5^7.5的磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液中含有0.15M的NaCl。本发明的制备方法采用大分子量的mPEG来修饰重组白介素_2上的氨基残基，该方法步骤简单，易于操作，合成效率高，易于控制质量和放大生产。本发明实施例还提供由上述制备方法获得的mPEG修饰的rhIL_2，即聚乙二醇修饰的重组人白介素2，其中mPEG对rhIL-2的赖氨酸的ε -氨基和N末端的α -氨基进行修饰，且该mPEG-rhIL-2可用如下通式表示:CH3O-(CH2CH2O)n-(CH2) pC0-NH-rhIL-2 ；其中η的取值与mPEG的分子量直接相关，η为200到2000之间的整数，对应的mPEG分子量为IOkDa IOOkDa之间，优选η为200到1000之间的整数，对应的mPEG分子量为101^& 501^)&之间，更优选η为200到500之间的整数，其对应的mPEG分子量为10kDa 30kDa ；其中P值也可调节，P为O到5的整数。本发明实施例制备的mPEG-rhIL-2，其分子量均一性较好，且分离纯化方法较为方便，易于控制质量和放大生产。本发明实施例制备的mPEG-rhIL-2能够保留较高的抗病毒活性，同时与未修饰的rhIL-2相比，其免疫原性较低，体内半衰期延长，血清清除率低，无需多次给药。以下通过具体实施例对本发明进行进一步描述。实施例1本实施例中使用的mPEG分子量为IOkDa,活化剂为琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺。具体操作步骤如下:1.mPEG 活化将mPEG溶于二氧六环中，加入适量琥珀酸酐，使得琥珀酸酐摩尔量略多于mPEG摩尔量，以吡啶为催化剂，在100°C下回流4h。反应液冷却后在剧烈搅拌下加无水乙醚至沉淀不再出现，之后再冰浴中搅拌30min。过滤，所得沉淀物溶于二氯甲烷，再次过滤除去不溶物，向滤液中加无水乙醚至沉淀不再产生，之后冰浴搅拌15min。再次过滤得沉淀，真空干燥。该干燥产物与N-羟基琥珀酰亚胺按1:3的摩尔比溶于二甲基甲酰胺(DMF)，将二环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液加入其中，搅拌过夜，过滤去除沉淀，滤液处理同上，即向滤液中加无水乙醚至沉淀不再产生后，冰浴中搅拌15min ;再次过滤得沉淀，真空干燥，所得沉淀即为mPEG活化物，即mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯，简称为mPEG_SS。2.修饰反应将mPEG-SS与rhIL-2按2:l的摩尔比加入到IOOmM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中，4°C下反应4h，加0.5M甘氨酸终止反应，过滤得反应液，反应液中含有mPEG-rhIL-2。
3.分离纯化取CM-S印harose离子交换柱，以10倍柱体积的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)平衡该离子柱，然后取稀释后的步骤2的反应液上柱，用含0-0.2M NaCl的pH8.0，20mM磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集含mPEG-rhIL-2组分的洗脱液。取该洗脱液加至已平衡好的S印hadexGlOO层析柱上，以IOOmM磷酸盐缓冲液(pH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脱，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得白色粉末状mPEG-rhIL-2偶联物。实施例2本实施例中使用的mPEG分子量20kDa，活化剂为琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺。具体操作步骤如下:1.mPEG 活化将mPEG溶于二氧六环中，加入适量琥珀酸酐，使其摩尔量多于mPEG摩尔量，以吡啶为催化剂，在0°c下回流24h。反应液冷却后在剧烈搅拌下加无水乙醚至沉淀不再出现，之后再冰浴中搅拌30min。过滤，所得沉淀物溶于二氯甲烷，再次过滤除去不溶物，向滤液中加无水乙醚至沉淀不再产生，之后冰浴搅拌15min。再次过滤得沉淀，真空干燥。该干燥产物与N-羟基琥珀酰亚胺混合溶于二甲基甲酰胺(DMF)，将二环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液加入其中，搅拌过夜，过滤去除沉淀，其余处理步骤同实施例1步骤I，所得沉淀即为mPEG活化物，即mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯，简称为mPEG-SS。2.修饰反应将mPEG-SS与rhIL_2按20:1的摩尔比加入到IOmM磷酸盐缓冲液(pH9.0)中，25°C下反应24h，加0.6M甘氨酸终止反应，过滤得反应液，反应液中含有mPEG-rhIL-2。。
3.分离纯化取CM-S印harose离子交换柱，以10倍柱体积的20mM磷酸盐缓冲液(pH5.0)平衡该离子柱，然后取稀释后的步骤2的反应液上柱，用含0-0.2M梯度NaCl的pH为5.0，20mM磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集含mPEG-rhIL-2组分的洗脱液。取该洗脱液加至已平衡好的Sephadex GlOO层析柱上，以IOmM磷酸盐缓冲液(ρΗ6.5，含有0.15Μ的NaCl)洗脱，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得白色粉末状mPEG-rhIL-2偶联物。实施例3本实施例中使用的mPEG分子量为50kDa，活化剂为琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺，具体操作步骤如下:1.mPEG 活化具体操作步骤同实施例1步骤1，所得产物为mPEG-SS。2.修饰反应将mPEG-SS与rhIL-2按50:1的摩尔比加入到IOOmM硼酸盐缓冲液(pH8.5)中，4°C下反应4h，加0.5M甘氨酸终止反应，过滤得反应液，反应液中含有mPEG-rhIL-2。3.分离纯化取CM-S印harose离子交换柱，以10倍柱体积的20mM硼酸盐缓冲液(pH8.0)平衡该离子柱，然后取稀释后的步骤2的反应液上柱，用含0-0.2M的梯度NaCl的pH8.0，20mM硼酸盐缓冲液洗脱，收集含mPEG-rhIL-2组分的洗脱液。取该洗脱液加至已平衡好的Sephadex GlOO层析柱上，以IOOmM硼酸盐缓冲液(ρΗ6.5，含有(λ 15Μ的NaCl)洗脱，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得白色粉末状mPEG-rhIL-2偶联物。实施例4本实施例使用的mPEG分子量为IOOkDa,活化剂为琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺。具体操作步骤如下:1.mPEG 活化将mPEG溶于二氧六环中，加入适量琥珀酸酐，以吡啶为催化剂，在100°C下回流12h。反应液冷却后在剧烈搅拌下加无水乙醚至沉淀不再出现，之后再冰浴中搅拌30min。过滤，所得沉淀物溶于二氯甲烷，再次过滤除去不溶物，向滤液中加无水乙醚至沉淀不再产生，之后冰浴搅拌15min。再次过滤得沉淀，真空干燥。该干燥产物与N-羟基琥珀酰亚胺混合溶于二甲基甲酰胺(DMF)，将二环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液加入其中，搅拌过夜，过滤去除沉淀，其余处理步骤同实施例1步骤1，所得沉淀即为mPEG活化物，即mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯，简称为mPEG-SS。2.修饰反应操作步骤同实施例1步骤2。3.分离纯化操作步骤同实施例1步骤3。实施例5本实施例使用的是mPEG，其分子量为IOkDa,活化剂为对甲苯磺酸氯。具体操作步骤如下:LmPEG 活化
将2g mPEG溶于5ml 二氯甲烷中，于0°C加入吡啶64yL，以及对甲苯磺酸氯
0.04g，所得混合物于25°C下搅拌，反应6h。于(TC下向上述反应混合物逐滴加入甲醇，弃去上清液，所得沉淀过滤，以乙醚多次洗涤沉淀，最后于真空下干燥。所得活化衍生物简称为Tosyl-mPEG。2.修饰反应将步骤I获得的Tosyl-mPEG与rhIL_2按2:1的摩尔比加到IOOmM磷酸盐缓冲液(pH8.5)中，4°C下反应4h，加0.5M甘氨酸终止反应，反应液过滤。3.分离纯化取CM-Sepharose离子柱，以10倍柱体积的pH7.5, 50mM磷酸盐缓冲液平衡柱子，后取稀释后的反应液上柱，用含0.2M NaCl的pH8.0, 20mM磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集含mPEG-rhIL-2组分的洗脱液。取洗脱液上已平衡好的S印hadex GlOO层析柱，以IOOmM磷酸盐缓冲液(PH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脱，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得白色粉末状mPEG-rhIL-2 偶联物。实施例6本实施例使用的是mPEG，其分子量为20kDa，活化剂为对甲苯磺酸氯。具体操作步骤如下:1.mPEG 活化将2g mPEG溶于5ml 二氯甲烷中，于0°C加入三乙基胺64yL，以及对甲苯磺酸氯
0.04g，所得混合物于25°C下搅拌，反应IOh。于0°C下向上述反应混合物逐滴加入甲醇，混合，弃去上清液，所得沉淀过滤，以乙醚多次洗涤沉淀，最后于真空下干燥。所得活化衍生物简称为 Tosyl-mPEG。2.修饰反应将步骤I获得的Tosyl-mPEG与rhIL_2按5:1的摩尔比加到50mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)中，4°C下反应6h，加0.5M甘氨酸终止反应，反应液过滤。3.分离纯化取CM-Sepharose离子柱，以10倍柱体积的ρΗ6.5, 20mM磷酸盐缓冲液平衡柱子，后取稀释后的反应液上柱，用含0.2M NaCl的pH6.5，20mM磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集含mPEG-rhIL-2组分的洗脱液。取洗脱液上已平衡好的S印hadex G100层析柱，以IOOmM磷酸盐缓冲液(PH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脱，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得白色粉末状mPEG-rhIL-2 偶联物。实施例7本实施例使用的mPEG分子量10kDa，活化剂为N，N’-羰基二咪唑(⑶I)。具体操作步骤如下:l.m PEG 活化按摩尔比为1:10分别称取mPEG和⑶I置于锥形瓶中，加入3ml的N, N’-二甲基甲酰胺，在无氧和避光条件下将锥形瓶置于37°C的水浴摇床中进行合成反应，5h后取出。将所得反应液用G4漏斗过滤，保留抽滤瓶中的滤液。向抽滤瓶中的滤液中加入搅拌子。在层析冷柜中于0°C滴加预冷乙醚，得到白色沉淀，用氯仿 溶解，上述步骤重复4次，得到白色粉末状成品，称mPEG-咪唑。所得产品在真空干燥箱中干燥。后将产品密封，保存在低温4°C、避光、干燥的环境中，备用。2.修饰反应将mPEG-CDI与rhIL_2按2:1的摩尔比加入到IOOmM磷酸盐缓冲液(pH8.5)中，4°C下反应4h,加0.5M甘氨酸终止反应,所得反应液过滤。3.分离纯化取CM-Sepharose离子柱，以10倍柱体积的pH8.0, 20mM磷酸盐缓冲液平衡柱子，将步骤2的反应液稀释，上柱，用含0.2M NaCl的pH8.0，20mM磷酸盐缓冲液洗脱，收集含mPEG-rhIL-2组分的洗脱液。将该洗脱液用已平衡好的S印hadex GlOO层析柱再次洗脱，使用IOOmM磷酸盐缓冲液(pH6.5，含有0.15M的NaCl)洗脱，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得白色粉末状mPEG-rhIL-2偶联物。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任 何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，包括以下步骤: 用活化剂将单甲氧基聚乙二醇活化，得到单甲氧基聚乙二醇活化分子，其中，所述活化剂选自:琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N，N’-羰基二咪唑、N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯； 将所述单甲氧基聚乙二醇活化分子与重组人白介素2在pH为7.5^9.0的缓冲液中反应，然后加入甘氨酸溶液终止所述反应，将反应产物分离纯化。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，其特征在于，所述将单甲氧基聚乙二醇活化分子与重组人白介素2反应的步骤中，所述单甲氧基聚乙二醇活化分子与所述重组人白介素的摩尔比为2:1 50:1。
3.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，其特征在于，所述活化反应的步骤中，所述活化剂为琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺，并使用吡啶作为催化剂。
4.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，其特征在于，所述单甲氧基聚乙二醇的分子量为10kDa-100kDa。
5.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，其特征在于，所述单甲氧基聚乙二醇活化分子与重组人白介素2的反应在磷酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液中进行。
6.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，其特征在于，所述甘氨酸溶液浓度为0.5-0.6M。
7.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，其特征在于，所述分离纯化步骤包括离子交 换色谱处理步骤。
8.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，其特征在于，所述分离纯化步骤包括凝胶渗透色谱处理步骤。
9.一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的重组人白介素2由权利要求1-8中任一项所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法获得。
10.如权利要求9所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素2，其特征在于，所述聚乙二醇对重组人白介素2的赖氨酸的ε-氨基和N末端的α-氨基进行修饰。
全文摘要
本发明适用于生物医药领域，提供一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，该方法包括以下步骤用活化剂将mPEG活化，得mPEG活化分子；将该mPEG活化分子与重组人白介素2反应，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将产物分离纯化，其中该活化剂选自琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N,N'-羰基二咪唑、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯。本发明的制备方法操作简便，易于控制质量和放大生产。
文档编号C07K14/55GK103193879SQ20131004928
公开日2013年7月10日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者徐东, 叶垚平 申请人:深圳市亚太兴实业有限公司