专利名称：聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法
技术领域：
本发明一般的涉及聚乙二醇修饰蛋白质的结构分析方法，特别的涉及聚乙二醇修饰蛋白质的聚乙二醇修饰位点分析方法，更加特别的涉及聚乙二醇修饰蛋白质中占优势的聚乙二醇修饰位点的分析方法。
背景技术：
蛋白质是维持生命结构与功能的重要生物活性分子，更是一种重要的药理活性分子，可用于人类各种疾病的治疗。尽管蛋白质类药物与传统化学药物相比有许多特点与优点，但其半衰期短、稳定性差、免疫原性强等一系列缺点也限制了其在临床实践中的进一步推广应用。针对这些缺点，产生与发展了蛋白质的化学修饰技术，其中最成功的是蛋白质的聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)修饰技术，并已开发出了一系列的已上市药物与待上市药物，代表性的如瑞士罗氏(Roche)公司的商品名为“Pegasys”的聚乙二醇修饰干扰素ah产品，美国先灵葆雅(ScheringPlough)公司(现已被默沙东公司并购)的商品名为“Peghtron”的聚乙二醇修饰干扰素a 2b产品，美国安进(Amgen)公司的商品名为 "Pegfilgrastim"的聚乙二醇修饰G-CSF产品等。尽管聚乙二醇修饰的蛋白质药物产品较对应未修饰的蛋白质药物产品在临床上取得了更好的疗效，在商业上取得了更大的成功，有逐渐在临床实践中取代未修饰蛋白质药物产品的趋势，但聚乙二醇在修饰蛋白质过程中普遍存在的多位点性和位点异构性，会造成修饰产物组成的不均一性，而不同修饰程度与修饰位点的修饰产物又具有不同的理化性质、药理活性与安全性特征，因此会影响到该类药物的质量控制与安全有效性。为了保证聚乙二醇修饰蛋白质药物的安全有效与质量可控性，更在可能的情况下为进一步研究聚乙二醇修饰蛋白质药物的构效关系，从而为从聚乙二醇修饰产物混合物中分离出结构单一、药理活性最高、毒性最低的修饰产物异构体作为临床使用的进一步技术更新的药物做准备，有必要对聚乙二醇修饰蛋白质的结构进行分析与确证，尤其是要对聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分布与各修饰位点所占比例进行分析与控制。现有技术对聚乙二醇修饰蛋白质修饰位点进行分析的方法主要是酶解质谱法和酶解液质联用法，具体原理如下。酶解质谱法的原理是选择一种蛋白质组学常用的工具酶或几种工具酶的组合，如胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、Glu_C、Asp-N等，在各自适宜的酶解条件下对蛋白质先后或同时进行酶解，以使可能的不同修饰位点氨基酸残基分布于不同的理论酶解片段(如一般的氨基聚乙二醇修饰剂可能的修饰位点是蛋白质中所有的赖氨酸残基； N端氨基聚乙二醇修饰剂理论上只修饰蛋白质N端的氨基酸残基，但由于特异性不高，也有可能修饰蛋白质非N端的赖氨酸残基；巯基聚乙二醇修饰剂可能的修饰位点是蛋白质中所有的半胱氨酸残基)。在终止酶解反应并进行适宜质谱仪检测的适当处理后加酶解样到质谱仪，如Q-TOF质谱仪或MALDI-T0F质谱仪进行酶解片段的质谱分子量检测。将检测结果与对应的未修饰蛋白质药物的理论酶解片段序列及其分子量分布结果对比(利用各种蛋白质组学分析软件，或者上蛋白质组学分析网站，如WWW, expasy. org均可分析获得理论酶解片段序列及其分子量分布结果)，查找检测结果中缺失的片段，此缺失片段序列中具有的可能的修饰位点氨基酸残基就是聚乙二醇实际修饰蛋白质药物的修饰位点。此方法的缺点是对质谱检测的精度要求高，如果质谱检测结果中有漏检酶解片段或酶解片段检测分子量不准确，均会严重影响结果的判定或使结果无法判定；另外由于连接聚乙二醇部分的酶解片段在质谱检测结果中缺失，所以此法也无法确定不同修饰位点产物在全部修饰位点产物中所占的比例。酶解液质联用法的原理也是先用一种或多种适宜的蛋白质组学工具酶，选择各自适宜的酶解条件先后或同时对蛋白质进行酶解。在终止酶解反应并进行适宜液质联用检测的适当处理后加酶解样到液质联用仪，在选择适宜的液相色谱分离条件使各酶解片段彼此分离后用与液相色谱相连接的质谱检测器检测各酶解片段的分子量。由于连接聚乙二醇部分的酶解片段分子量超出质谱检测器的检测范围检测不到，所以同样可以将检测结果与对应的未修饰蛋白质的理论酶解片段序列及其分子量分布结果对比，查找未检测到对应分子量的缺失片段，从而确定实际存在的修饰位点。然后对照液相色谱峰面积检测结果，对所有代表只含同一个实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段的色谱峰进行峰面积归一化法处理，以确定各同一个实际修饰位点的修饰产物在全部修饰产物中所占的比例，也即确定各修饰位点的比例。此方法虽然客服了上述酶解质谱法只能定性不能定量的缺点，但依然存在质谱检测器漏检酶解片段或酶解片段检测分子量不准确影响定性结果分析的缺点，还存在高效液相色谱分离较难能使各含同一个实际修饰位点且连接聚乙二醇部分的酶解片段完全分离的缺点。基于对上述方法的改进，中国专利CN200380103341. 1公开了一种聚乙二醇修饰干扰素ah(氨基聚乙二醇修饰剂修饰产物)异构体的分离方法，也即聚乙二醇修饰干扰素ah修饰位点的分析方法。该方法首先在弱阳离子交换的制备型液相色谱上初步分离聚乙二醇修饰干扰素ah位置异构体(即修饰位点异构体)，然后在强阳离子交换的制备型高效液相色谱上进一步分离位置异构体。对分离开的各异构体分别用只在赖氨酸C端特异性酶解，而不在精氨酸C端酶解的Trypsin进行酶解，酶解产物进行MALDI-T0F质谱检测。由于连接聚乙二醇部分的赖氨酸残基位点在酶解过程中不能被酶解，所以造成包括该赖氨酸残基位点在内的理论酶解片段与氨基酸序列上与此理论酶解片段紧连的理论酶解片段，连同聚乙二醇部分连接在一起不能被酶解开形成一个大的实际酶解片段，从而造成整个大的实际酶解片段分子量过大超出MALDI-T0F质谱检测限而检测不到。这样，只要与理论酶解片段序列及分子量分布对比，在MALDI-T0F检测结果中查找蛋白质一级序列上连接在一起的两个缺失的理论酶解片段，便可确定其中一个片段C端的赖氨酸，也即另一个片段N端氨基酸前的一个赖氨酸便是实际修饰位点。在确定每一个高效液相色谱上分离的异构体峰的修饰位点后，便可根据高效液相色谱的峰面积检测结果，利用峰面积归一化法确定各修饰位点在全部修饰产物中所占的比例。这一方法虽然对前述方法作出了较大改进，得到的结果更可靠，但操作较为繁琐(如果有多种高效液相色谱分离异构体，则每一种异构体都需进行酶解质谱分析，工作量较大)，成本较高(赖氨酸C端特异性酶解Trypsin 价格贵，且由于步骤多，分析对聚乙二醇修饰的干扰素a 2a需要量也大)，依旧对高效液相色谱分离与质谱检测有较高要求，且只能解决氨基修饰蛋白质的修饰位点分析问题，并不能解决巯基修饰蛋白质的修饰位点分析问题，因此实际应用具有很大的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法，以克服现有采用质谱或液质联用检测的技术中存在的因质谱理论酶解片段检测不全、高效液相色谱分离酶解片段不完全而影响结果判定，以及在大多数情况下不能对各修饰位点产物在全部修饰产物中所占比例进行定量的缺点，同时尽可能克服检测过程步骤多、时间长、成本高的缺
点ο为克服这些缺点，本发明提供至少包括如下步骤的技术方案1)酶解至少一次酶解，以在完全酶解与不存在非特异性酶解的条件下使各可能的修饰位点分布于不同的理论酶解片段中；2)高效液相色谱分离在每次酶解后至少一次高效液相色谱分离，以最终使实际连接聚乙二醇部分的酶解片段比较实际未连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中，且最终至少使序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段(以下简称A片段)比较各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段(以下简称B片段)，分布于不同的色谱峰中；3)确定修饰位点比例对A片段与B片段在幻的色谱分离中最终对应的色谱分离峰进行峰面积加和处理，不同次色谱分离得到的色谱峰的峰面积需按同一次色谱分离的峰面积进行折算后再加和，并确定其中峰面积最大的色谱分离峰占峰面积加和的比例，以确定占优势的实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；4)确定修饰位点位置收取A片段所最终对应的色谱分离峰的样品进行N端序列测定，与理论酶解序列进行比对确定占优势的修饰位点在蛋白质序列中的位置。在上述技术方案的酶解中，优选通过一次酶解使可能的修饰位点分布于不同的理论酶解片段中。酶解过程可选择的蛋白质组学工具酶不限于但优选Trypsin、 Chymotrypsin、Glu-C、Asp-N中的一种或几种的组合。但由于Chymotrypsin酶解位点过多， 酶解过程容易不完全和非特异，Asp-N的价格高，所以更优选的工具酶是Trypsin、Glu-C 中的一种或两种的组合。又由于Glu-C的酶解受缓冲液种类、pH与时间的影响较大，所以最优选的工具酶是Trypsin。在酶解过程中优选用变性剂尿素对蛋白质进行处理，更加优选在酶解前用变性剂对蛋白质进行处理，以使酶解过程更加完全。酶解的缓冲液、PH、温度、时间、酶与底物的比例可以参考工具酶制造商的产品使用说明，但对于Trypsin优选 2-20mmol/L的碳酸氢铵酶解缓冲液(pH8. 0)，37°C的酶解温度，18-24小时的酶解时间，质量比1 10-1 40的酶与底物的比例。在上述技术方案的高效液相色谱分离中，至少要求通过一步或多步高效液相色谱分离最终使A片段与各B片段之间彼此分离，但不同实际修饰位点的B片段之间分离与否没有关系。高效液相色谱优选反相高效液相色谱与分子排阻高效液相色谱，在A片段与各B片段分子量差异较大的情况下更加优选分子排阻色谱，因为分子排阻高效液相色谱分离的影响因素较少，分离条件的研究获得更容易，色谱图更加直观，便于结果的分析判断。但由于酶解混合物中的含聚乙二醇部分的酶解片段分子量较大，所以应选择大孔径的高效液相色谱填料进行分离，其中分子排阻高效液相色谱可以选择的填料包括但不限于 TSK-GEL· G2000SW, TSK-GEL G2000SffXL, TSK-GEL Super G2000、TSK-GEL G3000SW, TSK-GELG3000SWxl, TSK-GEL Super G3000、 Protein-Pak 125、 Protein-Pak 200SW, Protein-Pak 300SW。在上述技术方案的高效液相色谱分离获得的图谱中，实际连接聚乙二醇部分的各酶解片段的出峰位置的判断，可以采用如下三种方法之一1)保留时间比对法在每次分子排阻高效液相色谱分离后，在同样的色谱分离系统与色谱分离条件下分别在高效液相色谱柱上上未修饰的蛋白质纯品与分子量均一的聚乙二醇修饰蛋白质纯品，确定两者的保留时间，则该聚乙二醇修饰蛋白质酶解后连接聚乙二醇部分的酶解片段在同样的色谱分离系统与色谱分离条件下的保留时间应该在此两者之间。2)电泳染色法无论是在每次分子排阻高效液相色谱分离后，还是在每次反相高效液相色谱分离后，还是在每次其他类型的高效液相色谱分离后，对收集的各色谱峰分别进行SDS-PAGE电泳检测，电泳后先后进行考马斯亮蓝R250染色与碘染色。其中考马斯亮蓝R250对蛋白质或多肽进行染色的方法是本领域技术人员公知的方法，而碘染色的方法也可以参考相关文献的报道，或采用如下的方法将电泳后的凝胶取下，浸入电泳脱色液中浸泡30分钟，然后取出放入5% (w/v)氯化钡溶液中浸泡约10分钟，再放入碘染色液中(固体碘与30%酒精水溶液配制成的饱和溶液)染色3-5分钟。最后需将染色后的凝胶放入脱色液中再浸泡1-2分钟漂洗去凝胶上的浮色后才能进行照相与扫描分析。同一条带只有在两种染色时均能显色的才代表连接聚乙二醇部分的酶解片段，否则若只在考马斯亮蓝R250染色时显色而不在碘染色时显色的代表不连接聚乙二醇部分的酶解片段。若某一泳道有在两种染色时均显色的条带，则此泳道所代表的色谱峰中含有连接聚乙二醇部分的酶解片段。3)质谱法无论是在每次分子排阻高效液相色谱分离后，还是在每次反相高效液相色谱分离后，还是在每次其他类型的高效液相色谱分离后，对收集的各色谱峰分别脱盐脱有机溶剂后进行质谱分子量检测，测得分子量大于聚乙二醇修饰剂分子量的峰为连接聚乙二醇部分的酶解片段峰。在上述技术方案的峰面积加和处理中，如果A片段与B片段间在一次色谱分离中得到完全分离，则只要将只分别含有它们的色谱峰的峰面积简单加和便可以。但若不能完全分离，则需对经过多次酶解与色谱分离后才得到的只含有A片段或B片段(不同实际修饰位点的B片段间分离与否没有关系)的色谱峰的峰面积进行折算处理，所有的加和峰面积应折算为同一次色谱分离中的峰面积。下面对折算处理方法举例进行说明，本领域技术人员在理解如下例子后无需创造性劳动便可对其他相似或更复杂的情况进行折算处理。应当指出的是，不含实际修饰位点的酶解片段的峰面积在折算时不用考虑。例1 1)酶解高效液相色谱分离情况
各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况如下表1所示，表中代号表示的含义为Xl 第几次酶解及其后对应的高效液相色谱分离；x2 本次酶解高效液相色谱分离的第a次酶解高效液相色谱分离所得的色谱峰b， 表不为a, b ；yl 该峰含有的酶解片段中含有的实际修饰位点；y2 该峰含有的酶解片段中含有的可能但非实际修饰位点；zl 该峰对应的各酶解片段是否各连接有一个聚乙二醇分子(一个酶解片段不可能连接有两个以上聚乙二醇分子；各酶解片段要么都连接有一个聚乙二醇分子，要么都不连接聚乙二醇分子)；z2 该峰中是否只含有一个酶解片段。表1各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况
xlx2峰1峰2峰3峰4yiy2zlz2yiy2zlz2yiy2zlz2yiy2zlz2
1-a无是是b无是是abC否否无无否否2)修饰位点比例计算结果按第一次酶解色谱分离所得的色谱峰的峰面积进行折算a修饰位点所占的比例为A11/(A11+A12)b修饰位点所占的比例为A12/(A11+A12)其中Aab表示第a次酶解色谱分离后所得的峰b的峰面积。例2 1)酶解高效液相色谱分离情况各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况如下表2所示，表中代号含义如例1。表2各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况
xlx2峰1峰2峰3峰4yiΥ2zlζ2yiΥ2zlz2yiY2zlz2yiy2zlz21-a无是是bed是是无ef否否abc无否否21,2b无是是C无是是bd否否C无否否2)修饰位点比例计算结果按第一次酶解色谱分离所得的色谱峰的峰面积进行折算a修饰位点所占的比例为A11/(A11+A12)b 修饰位点所占的比例为A12XA21/(A21+A22)/(A11+A12)c 修饰位点所占的比例为A12XA22/(A21+A22)/(A11+A12)
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其中Aab表示第a次酶解色谱分离后所得的峰b的峰面积。当Α11ΛΑ11+Α12) > 0. 5时，可以直接确定a为占绝对优势的实际修饰位点，并可以不考虑其他实际修饰位点的比例而确定占绝对优势的实际修饰位点a在全部实际修饰位点中所占的比例为Α11ΛΑ11+Α12)。例 3 1)酶解高效液相色谱分离情况各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况如下表3所示，表中代号含义如例1。表3各次酶解高效液相色谱分离后所得的色谱峰的情况
权利要求
1.聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法，至少包括如下步骤1)酶解至少一次酶解，以在完全酶解与不存在非特异性酶解的条件下使各可能的修饰位点分布于不同的理论酶解片段中；2)高效液相色谱分离在每次酶解后至少一次高效液相色谱分离，以最终使实际连接聚乙二醇部分的酶解片段比较实际未连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中，且最终至少使序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段比较各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段， 分布于不同的色谱峰中；3)确定修饰位点比例对序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段与各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段在2、的色谱分离中最终对应的色谱分离峰进行峰面积加和处理，不同次色谱分离得到的色谱峰的峰面积需按同一次色谱分离的峰面积进行折算后再加和，并确定其中峰面积最大的色谱分离峰占峰面积加和的比例，以确定占优势的实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；4)确定修饰位点位置收取序列上只包括含量上占优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所最终对应的色谱分离峰的样品进行N端序列测定，与理论酶解序列进行比对确定占优势的实际修饰位点在蛋白质序列中的位置。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征是酶解步骤中各次酶解选择的酶是Trypsin、 Chymotrypsin、Glu_C、Asp-N中的一种或几种的组合。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征是每次高效液相色谱分离选择反相高效液相色谱柱或分子排阻高效液相色谱柱中的一种。
4.如权利要求3所述的分析方法，其特征是所述的反相高效液相色谱柱选择Waters Symmetry 300(18色谱柱。
5.如权利要求3所述的分析方法，其特征是所述的分子排阻高效液相色谱柱选择 TSK-GEL G3000SWXL 色谱柱。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征是所述的蛋白质为复合干扰素86位点半胱氨酸突变体，其具有SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的分析方法，其特征是包括如下步骤DTrypsin 一次酶解；2)一次酶解产物的高效液相色谱分离，以使各实际连接聚乙二醇部分的酶解片段比较各实际未连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中，且各在同一位点实际连接聚乙二醇部分的酶解片段也分布于不同的色谱峰中，收集各在同一位点实际连接聚乙二醇部分的酶解片段对应的色谱峰中峰面积占绝对优势的峰的样品，并通过计算该峰的峰面积占全部各在同一位点实际连接聚乙二醇部分的酶解片段对应的色谱峰峰面积的加和的比例，从而确定占绝对优势的实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；3)对2、中收集的峰样品进行Chymotrypsin二次酶解；4)二次酶解产物的高效液相色谱分离，并收集连接聚乙二醇部分的酶解片段峰；5)对两次高效液相色谱分离收集的酶解片段峰进行N末端序列测定，通过与理论酶解序列对比确定占绝对优势的实际修饰位点在复合干扰素86位点半胱氨酸突变体序列中的位置。
8.如权利要求7所述的方法，其特征是步骤幻和/或步骤4)中所述的高效液相色谱分离采用Waters Symmetry 300C18反相高效液相色谱柱。
9.如权利要求7所述的方法，其特征是步骤幻和/或步骤4)中所述的高效液相色谱分离采用TSK-GEL G3000SWa分子排阻高效液相色谱柱。
10.如权利要求1-6之一所述的分析方法，对如下步骤进一步要求1)高效液相色谱分离在每次酶解后至少一次高效液相色谱分离，以最终使各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色谱峰中；2)确定修饰位点比例对各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱峰的峰面积进行加和处理，计算各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱峰的峰面积占全部各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱峰的峰面积加和的比例，以确定各实际修饰位点在全部修饰位点中所占比例；3)确定修饰位点位置收取各序列上只包括同一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色谱分离峰的样品进行N端序列测定，与理论酶解序列进行比对确定各实际修饰位点在蛋白质序列中的位置。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及聚乙二醇修饰蛋白质修饰位点的分析方法，至少包括蛋白质组学工具酶酶解、高效液相色谱分离使序列上只包括含量上占绝对优势的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段与各序列上只包括一个含量上次要的实际修饰位点残基且不包括可能但非实际修饰位点残基且连接聚乙二醇部分的酶解片段彼此分离、峰面积归一法确定占绝对优势修饰位点比例、N端序列测定确定占绝对优势修饰位点位置等步骤。采用这一分析方法，可更加方便、快捷、准确、低成本的确定聚乙二醇修饰蛋白质中占修饰位点的分布与比例。
文档编号G01N30/88GK102507824SQ201110339619
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者刘金毅, 周敏毅, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司