专利名称：Sr蛋白质的磷酸化控制方法以及以sr蛋白质活性控制剂为有效成分的抗病毒剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以上列举的任意化合物，但这些列举的化合物中，优选列举上述列举的化合物编号为340、341、342、343、344、345、346、347、348、608、613、615、616、618、619、620、621、622、623、624、625、626的化合物，更优选列举340、341、342、343、345、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626的化合物，进一步优选上述列举的化合物编号为340、348、613、616、618、622、624的化合物、更优选列举化合物编号为340、348、613、618、624的化合物。
本发明涉及以上列举的任意化合物。特别是，本发明涉及选自列举的化合物编号为341、342、346、347、348、349、612、613、614、616、617、618、619、620、621、622和624的新化合物。
这些化合物(苯胺衍生物)、其可药用的盐或它们的水合物作为SRPK抑制剂是有效的。
另外，这些化合物(苯胺衍生物)、其可药用的盐或它们的水合物作为抗病毒剂是有效的。
本发明的上式(I)表示的化合物代表性的制备方法如下以下，R1、R2、R3、R4、R5、R6、Q和W定义同上。室温是指20～30℃左右的温度。
制备方法A 步骤1是化合物1a和化合物2a反应生成化合物3a的步骤。原料硝基苯衍生物1a可购买市售品或导入适当官能团得到。Ha1为作为离去基团的卤原子。化合物2a为含有引入的NR5R6的试剂，X为氢原子等。化合物2a优选使用1-2当量。反应可在碱存在下在溶剂中进行。
作为碱，可使用三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶等。优选使用1～5当量碱。另外，可使用过量的(1～5当量)X-NR5R6作为碱。
作为溶剂，可列举例如二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二烷、四氢呋喃、甲苯等。
反应可在反应温度为0℃～150℃下进行，可优选在室温下进行。
步骤2是将化合物3a的硝基还原为氨基，得到化合物4a的步骤。
作为还原方法，可以在溶剂中，在氯化锡等存在下，与浓盐酸等接触进行。另外，也可以利用接触氢化等一般的还原反应。
作为反应溶剂，可以用甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、1，4-二烷、水或者它们的混合溶剂。
优选使用以质量比计为1～20当量的量的还原剂氯化锡。反应温度可在0℃～100℃进行。
如果可以得到化合物3a和4a的市售品，使用市售品也可。特别是通式(I)的W为氢或者卤原子时，基本上都可以得到市售品。例如，本说明书的化合物编号为608、612、623～626等就属于此。
步骤3a是化合物4a和化合物5a反应得到化和物6a的步骤。L为卤原子等。
反应可在溶剂中，在碱存在下，根据需要添加催化剂进行。此时，优选使用1～3当量的化合物5a。
反应溶剂可以使用二氯甲烷、氯坊、1，4-二烷、四氢呋喃、甲苯、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。
作为碱，可以使用三乙基胺、二异丙基乙胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶等。
另外，可以利用L为羟基时的使用缩合剂的一般的叠氮键形成反应等；也可以利用L为琥珀酰亚胺基或咪唑基等离去基团时的一般的叠氮键形成反应。
作为催化剂可列举4-(二甲氨基)吡啶等。
反应可在反应温度为0℃～100℃进行。
步骤3b是化合物4a和化合物5b反应得到化和物6b的步骤。
反应可在溶剂中，在碱存在下使酰基异硫氰酸盐作用而进行。酰基异硫氰酸盐可以使用市售品或者直接使用将合适的酰卤和硫氰酸盐在反应溶液中制备得到的物质。优选使用1～5当量酰基异硫氰酸盐。作为硫氰酸盐，可以使用硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸铵等，优选使用1～5当量。
作为溶剂，可列举例如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1，4-二烷等。
作为碱，可以使用例如三乙基胺、二异丙基胺、吡啶、4-(二甲氨基)吡啶等。优选使用1～5当量碱。
反应可在反应温度为0℃～150℃进行。
工程4a是将化合物6a的叠氮基部分烷基化(R2)得到化合物7a的步骤。
反应可在溶剂中、在碱存在下使用烷基化试剂(R2-X)进行。X为作为离去基团的卤原子或者磺酸酯。烷基化试剂(R2-X)优选使用1～5当量。
作为溶剂，可列举例如N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1，4-二烷、乙腈、醚等。
作为碱，可使用氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、丁基锂、甲基锂、苯基锂、二异丙基氨基锂等。碱优选使用1～5当量。
反应可在反应温度为0℃～150℃下进行。
工程4b是将化合物6a的酰胺键的羰基变成硫羰基得到化合物7b的步骤。
反应在溶剂中使用硫羰化试剂进行。
作为硫羰化试剂，可以使用例如Lawesson’s试剂(2，4-双(4-甲氧基苯基)-1，3，2，4-二硫杂二磷杂环丁烷(diphosphetane)2，4-二硫化物)、五硫化二磷(十硫化四磷、P4S10)等。优选使用1～5当量硫羰化试剂。
溶剂可列举例如甲苯、苯、氯苯、二甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙二醇二甲醚、1，4-二烷、四氢呋喃等。
反应可在反应温度为0℃～200℃下进行。
以上为本发明的化合物(I)的制备方法的代表例，本发明化合物的制备中的原料化合物、各种试剂也可以形成盐、水合物或溶剂和物，均因起始原料、使用的溶剂等而不同，只要不妨碍反应，没有特别限制。所使用的溶剂也因起始原料、试剂等而不同，而且只要不妨碍反应，某种程度溶解起始物质则没有特别限制。本发明的化合物(I)作为游离体得到时，可按照常法转变为上述的化合物(I)可以形成的盐、或者它们的水合物的状态。
本发明的化合物(I)作为化合物(I)的盐或者化合物(I)的水合物得到时，可按照常法转变为上述化合物(I)的游离体。
另外，对于得到的本发明化合物(I)的各种异构体(例如几何异构体、以手性碳为基础的光学异构体、旋转异构体、立体异构体、互变异构体等)可通过通常的分离方法，例如重结晶、成非对映异构体盐法、酶分离法、各种色谱法(例如薄层色谱、柱色谱、气相色谱等)进行纯化、分离。
在本发明中，SRPIN-1类似物可用于抑制SRPK的活性。即，通过施用本说明书所述的SRPIN-1类似物，可抑制SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性。本发明涉及SRPIN-1类似物在SRPK活性抑制中的用途。另外，本发明涉及含有SRPIN-1类似物的SRPK抑制剂。另外，本发明涉及SRPIN-1类似物在SRPK抑制剂制备中的用途。另外，本发明涉及包括使SRPIN-1类似物与SRPK接触步骤的抑制SRPK活性的方法。在此，与SRPK接触可以是在体内或体外向表达SRPK的细胞、组织和/或个体施用SRPIN-1类似物。
另外，在本发明中，SRPIN-1类似物可用于抑制病毒的增殖。即，通过施用本说明书所述的SRPIN-1类似物，抑制SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性，从而抑制病毒增殖。本发明涉及SRPIN-1类似物在病毒增殖抑制中的用途。另外，本发明涉及含有SRPIN-1类似物的抗病毒剂。另外，本发明涉及SRPIN-1类似物在制备抗病毒剂中的用途。进一步本发明涉及包括使SRPIN-1类似物与SRPK接触的步骤的抑制病毒增殖的方法。在此，与SRPK接触可以是在体内或体外向表达SRPK的细胞、组织和/或个体施用SRPIN-1类似物。
另外，本发明提供一种药盒(package)，其是含有上述SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的药盒，该化合物具有SRPK抑制活性和/或抗病毒作用记载在该药盒或该药盒的内容物中。在此，药盒是指含有该SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的包装物，可以含有用于装入该SRPIN-1类似物、其可药用盐、或者它们的水合物的容器，还可以包括收容该容器的袋子或外箱等。
另外，本发明提供一种药盒，其是含有使SR蛋白质活性或表达量降低的化合物的药盒，该化合物具有抗病毒作用记载在该药盒或该药盒的内容物中。特别是本发明提供一种药盒，该化合物为具有抑制SRPK表达和/或活性的活性的化合物。
本发明的化合物可与可药用的载体一起制成组合物。例如，可采用公知的制剂技术，做成医药组合物。将本发明的医药组合物用作SRPK抑制剂、或抗病毒剂(即病毒疾病的预防剂或治疗剂)或其他医药时，其给药形态可以列举通过例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、锭剂或糖浆剂等经口给药；或通过注射剂、气雾剂、栓剂、贴剂、糊剂、溶液剂、擦剂、软膏剂或滴眼剂等非经口给药。这些制剂可用赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、矫味矫臭剂、稀释剂等添加剂通过公知的方法制备。
作为赋形剂，可列举例如淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉等淀粉、乳糖、结晶纤维素、磷酸氢钙等。
作为包衣剂，可列举例如乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、虫胶、滑石、巴西棕榈蜡、石蜡等。
作为粘合剂，可列举例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和与上述赋形剂相同的化合物。
作为崩解剂，可列举例如与上述赋形剂相同的化合物和交联羧甲基纤维素钠(Croscarmellose Sodium)、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等经化学修饰的淀粉·纤维素类。
作为稳定剂，可列举例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇、苄基醇、苯乙醇等醇类；苯扎氯铵、苯酚、甲酚等酚类；硫柳汞、脱氢乙酸；以及山梨酸等作为矫味矫臭剂，可列举例如通常使用的甜味剂、酸味剂、芳香剂等。
另外，作为制备液体制剂的溶剂，可列举乙醇、苯酚、氯甲酚、纯化水、蒸馏水等。
作为表面活性剂或乳化剂，可列举例如聚山梨酯80、硬脂酸聚烃氧酯40、聚月桂乙二醇等。
本发明的医药组合物用作SRPK抑制剂或抗病毒剂时，本发明的化合物或其可药用盐的用量因症状、年龄、给药方法等而有所不同。例如，口服时，优选根据症状对患者(恒温动物、特别是人)每天一次或者分数次给药，下限为(0.01)mg(优选为(0.1)mg)，上限为(2000)mg(优选为(500)mg，更优选为(100)mg)。静脉给药时，成人每天一次或者分数次，下限为(0.001)mg(优选为(0.01)mg)，上限为(500)mg(优选为(50)mg)。
实施例以下，根据实施例更详细地说明本发明，他们仅作为示例，本发明并不限于这些实施例。要说明的是，本说明书中引用的文献均作为本说明书的一部分。
以下，柱色谱使用硅胶(MERCK 9385-5B，70-230目)进行。薄层色谱(TLC)使用预先涂布了硅胶的玻璃板(MERCK5715，silical gel60F2s4)进行。熔点使用Yanaco公司生产的微熔点测定装置YANACOMP-500D测定。1H-NMR谱用日本电子(JEOL)公司生产的JNMAL-400核磁共振装置测定。NMR谱测定用溶剂使用CDCl3或CD3OD(ISOTEC公司产)。化学位移以四甲基硅烷((CH3)4Si)为内标(0ppm)的相对值表示，偶合常数(J)以Hz表示。符号s、d、t、m以及br分别表示单峰、双峰、三重峰、四重峰、多重峰以及宽峰。
SRPIN-1的合成SRPIN-1(编号GIF-0340)的代表的合成方法如下。
[参考例1-1A]在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(427mg，2.04mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中依次添加哌啶(piperidine)(220μL，2.22mnol)和N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)(220μL，2.40mmol)。将混合物搅拌1小时。向其中添加水，用乙醚(×3)萃取混合物。用盐水洗涤萃取得到的有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，在减压下浓缩。
残渣用硅胶柱色谱(40g，己烷/乙酸乙酯-10/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(561mg，2.04mmol，quant.)的橙色固体.
TLC和1H NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下TLC Rf0.47(己烷/丙酮＝16/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.61-1.68(m，2H，CH2)，1.72(tt，4H，J＝5.3，5.3Hz，2CH2)，3.13(t，4H，J＝5.3Hz，2CH2)，7.13(d，1H，J＝8.8Hz，芳香性)7.61(dd，1H，J＝2.0，8.8Hz，芳香性)，8.03(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性). 在0℃下向参考例1-1A得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(559mg，2.03mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(2.00mL，24.0mmol)和无水二氯化锡(2.50g，13.1mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17.5小时。向其中添加碳酸氢钠的饱和水溶液。用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用盐水洗涤得到的有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝14/1)纯化，得到2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(448mg，1.83mmol，90.4％)的淡黄色固体。
TLC和1H NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下TLC Rf0.30(己烷/丙酮＝18/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.59-1.60(m，2H，CH2)，1.71(tt，4H，J＝5.4，5.4Hz，2CH2)，2.85(brs，4H，2CH2)，4.09(brs，2H，NH2)，6.92(d，1H，J＝1.9Hz，芳香性)，6.97(dd，1H，J＝1.9，8.4Hz，芳香性)，7.01(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性). 在0℃下向参考例1-2A得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(173mg，0.708mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(151mg，0.850mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(450μL，3.23mmol)和催化量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine)。将混合物恢复至室温，搅拌19.5小时。向其中添加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用碳酸氢钠饱和水溶液洗涤得到的有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，然后减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(10g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)和重结晶(己烷)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，编号GIF-0340)(83.3mg，0.240mmol，33.9％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点96-98℃；TLC Rf0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.67-1.68(m，2H，CH2)，1.78(tt，4H，J＝5.5，5.5Hz，2CH2)，2.88(t，4H，J＝5.5Hz，2CH2)，7.29(d，1H，J＝8.2Hz，芳香性)，7.40(dd，1H，J＝1.8，8.2Hz，芳香性)，7.76(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，8.86(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，8.87(d，1H，J＝1.8Hz，芳香性)，9.53(s，1H，NH). 在0℃下向1-氯-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-chloro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(5.00g，22.4mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(7mL)溶液中添加哌啶(piperidine)(5.50mL，55.5mmol，商品名)，将混合物搅拌40分钟。向其中添加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩。残渣用硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝8/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(6.13g，quant.)的橙色固体。
在0℃下向参考例1-1B得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]哌啶(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)piperidine(6.13g，22.4mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(12.2mL，146mmol)和无水二氯化锡(12.7g，67.2mmol)，将混合物搅拌7小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(4.55g，83.0％)的淡黄色固体。
在0℃下向参考例1-2B得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(4.45g，18.2mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(6.48g，36.4mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(5.57mL，54.6mol)。将混合物搅拌0.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)和重结晶(己烷)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，编号GIF-0340)(5.49g，86.3％)的无色固体。
编号GIF-0613的合成 [参考例2-1]在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(211mg，1.00mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中依次添加(S)-2-甲基哌啶((S)-2-methylpiperidine)(270μL，2.24mmol，商品名)，将混合物搅拌2小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到(S)-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-2-甲基哌啶((S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)-2-methylpiperidine(286mg，99.2％)的橙色油状物质。
TLC Rf0.44(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。
在0℃下向[参考例2-1]得到的(S)-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-2-甲基哌啶((S)-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)-2-methylpiperidine(275mg，0.953mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL，12.0mmol)和无水二氯化锡(903mg，4.76mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到(S)-2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(S)-(2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(233mg，94.6％)的无色油状物质。
TLC Rf0.38(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。
在0℃下向[参考例2-2]得到的(S)-2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺((S)-(2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(233mg，0.863mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(466mg，2.61mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(600μL，4.30mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌19.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)纯化，得到(S)-N-[2-(2-甲基-1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺((S)-N-[2-(2-methyl-1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(编号GIF-0613)(293mg，93.4％)的无色油状物质。
TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
TLC Rf0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.84(d，3H，J＝6.4Hz，CH3)，1.39-1.69(m，3H，CH2，CH)，1.82-1.86(m，1H，CH)，1.92-1.95(m，2H，CH2)，2.65-2.72(m，1H，CH)，2.89-2.92(m，1H，CH)，2.98-3.02(m，1H，CH)，7.35(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性)，7.40(dd，1H，J＝2.2，8.4Hz，芳香性)，7.75(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.86(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.93(d，1H，J＝1.8Hz，芳香性)，10.1(s，1H，NH)。
编号GIF-0617的合成。
[参考例3-1]在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(1.02g，4.89mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(4mL)溶液中添加吡咯烷(pyrrolidine)(983μL，12.0mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌4.5小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)pyrrolidine(1.26g，99.3％)的橙色固体。
TLC Rf0.45(己烷/乙酸乙酯＝5/1)。
在0℃下向参考例3-1得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)pyrrolidine(606mg，2.33mmol)的甲醇(4mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.36mL，16.3mmol)和无水二氯化锡(1.55g，8.16mmol)，将混合物搅拌4小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine)(550mg，quant.)的橙红色油状物质。
TLC Rf0.63(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。
在0℃下向参考例3-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吡咯烷(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine)(516mg，2.24mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(705mg，3.96mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(823μL，5.94mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝1/2)纯化，得到N-[2-(1-吡咯烷基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-pyrrolidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-06l7)(734mg，97.8％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点134-135℃；TLC Rf0.29(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.01(tt，4H，J＝3.2Hz，6.4Hz，2CH2)，3.15(t，4H，J＝6.4Hz，2CH2)，7.19(d，1H，J＝8.5Hz，芳香性)，7.38(dd，1H，J＝2.2，8.5Hz，芳香性)，7.71(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，8.53(d，1H，J＝2.2，Hz，芳香性)，8.79(s，1H，NH)，8.83(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)。
编号GIF-0618的合成 [参考例4-1]在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(506mg，2.42mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次添加六氢-1H-氮杂(hexahydro-1H-azepine)(682μL，6.05mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌1小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝7/1)纯化，得到六氢-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]-1H-氮杂(hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine)(680mg，97.5％)的橙色固体.
TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
TLC Rf0.49(己烷/乙酸乙酯＝5/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.57-1.63(m，4H，2CH2)，1.79-1.83(m，4H，2CH2)，3.31(t，4H，J＝5.5Hz，2CH2)，7.11(d，1H，J＝9.1Hz，芳香性)7.53(dd，1H，J＝2.0，9.1Hz，芳香性)，7.99(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)。
在0℃下向参考例4-1得到的六氢-1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基1H-氮杂(hexahydro-1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1H-azepine)(675mg，2.34mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.27mL，15.2mmol)和无水二氯化锡(1.43g，7.54mmol，将混合物搅拌2小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-六氢-1H-氮杂(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine(522mg，86.3％)的无色固体。
TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
TLC Rf0.81(己烷/乙酸乙酯＝3/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.70-1.84(m，8H，4CH2)，3.04(t，4H，J＝5.4，Hz，2CH2)，4.10(brs，2H，NH2)，6.92(d，1H，J＝1.2Hz，芳香性)，6.94(dd，1H，J＝1.2，7.9Hz，芳香性)，7.05(d，1H，J＝7.9Hz，芳香性)。
在0℃下向参考例4-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-六氢-1H-氮杂(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-hexahydro-1H-azepine(512mg，1.98mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(6mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(704mg，3.95mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(823μL，5.94mol)，将混合物搅拌1.5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到 N-[2-(1-六氢-1H-氮杂基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-hexahydro-1H-azepinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0618)(697mg，97.0％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点138-139℃；TLC Rf0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.79(br，8H，4CH2)，3.06-3.10(m，4H，2CH2)，7.31(d，1H，J＝8.2Hz，芳香性)，7.37(dd，1H，J＝1.6，8.2Hz，芳香性)，7.76(dd，2H，J＝2.0，6.0Hz，芳香性)，8.85(m，3H，芳香性)，9.66(s，1H，NH)。
编号GIF-0346的合成 [参考例5-1]在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(209mg，1.00mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中依次添加吗啉(morpholine)(190μL，2.17mmol，商品名)，将混合物搅拌3小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝3/1)纯化，得到4-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine)(270mg，97.7％)的橙色油状物质。
TLC Rf0.27(己烷/乙酸乙酯＝3/1)。
在0℃下向参考例5-1得到的4-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine)(263mg，0.952mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL，12.0mmol)和无水二氯化锡(905mg，4.77mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌20小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到4-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine(214mg，91.2％)的无色固体。
TLC Rf0.31(己烷/乙酸乙酯＝3/1)。
在0℃下向参考例5-2得到的4-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]吗啉(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine(196mg，0.796mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(320mg，1.80mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(480μL，3.44mol)。将混合物恢复至室温，搅拌60小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到N-[2-(4-吗啉基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(4-morpholinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0346)(65.1mg，23.2％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点172-173℃；TLC Rf0.23(己烷/乙酸乙酯＝1/3)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ2.96(t，4H，J＝4.4Hz，2CH2)，3.92(t，4H，J＝4.4Hz，2CH2)，7.34(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性)，7.44(dd，1H，J＝1.6，8.4Hz，芳香性)，7.75(dd，1H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，8.87-8.88(m，3H，芳香性)9.48(s，1H，NH)。
编号GIF-0347的合成 [参考例6-1]在室温下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(211mg，1.01mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中添加二乙胺(diethylamine)(230μL，2.22mmol，商品名)，将混合物搅拌3小时。向其中加水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝8/1)纯化，得到1-二乙基氨基-2-硝基-4-(三氟甲基)苯基(1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(258mg，98.3％)的橙色油状物质。
TLC Rf0.37(己烷/乙酸乙酯/乙醚＝16/1/1)。
在0℃下向参考例6-1得到的1-二乙基氨基-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(251mg，0.957mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.00mL，12.0mmol)和无水二氯化锡(908mg，4.78mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌22小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝20/1～10/1)纯化，得到2-氨基-1-二乙氨基-4-(三氟甲基)苯(2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene)(144mg，64.7％)的无色油状物质。
TLC Rf0.22(己烷/乙酸乙酯＝30/1)。
在0℃下向参考例6-2得到的2-氨基-1-二乙氨基-4-(三氟甲基)苯(2-amino-1-diethylamino-4-(trifluoromethyl)benzene)(103mg，0.443mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(3mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(88.2mg，0.495mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(140μL，1.00mol)。将混合物恢复至室温，搅拌1.5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到N-[2-二乙基氨基-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-diethylamino-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0347)(51.0mg，34.1％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点78-80℃；TLC Rf0.31(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.01(t，6H，J＝7.1Hz，2CH3)，3.04(q，4H，J＝7.1Hz，2CH2)，7.33(d，1H，J＝8.2Hz，芳香性)，7.41(dd，1H，J＝1.8，8.2Hz，芳香性)，7.73(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.60(d，1H，J＝2.6Hz，芳香性)，8.85(dd，2H，J＝1.8，4.4Hz，芳香性)，8.91(d，1H，J＝1.8Hz，芳香性)9.90(s，1H，NH)。
编号GIF-0343的合成
在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(152mg，0.662mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoylchloride hydrochloride)(122mg，0.685mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(250μL，1.79mol)。将混合物恢复至室温，搅拌16.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(15g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0343)(98.4mg，45.3％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点145-146℃；TLC Rf0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.62-1.69(m，2H，CH2)，1.79(tt，4H，J＝5.8，5.8Hz，2CH2)，2.88(t，4H，J＝5.8Hz，2CH2)，7.29(d，1H，J＝8.4Hz，芳香性)，7.39(dd，1H，J＝2.0，8.4Hz，芳香性)，7.51(dd，1H，J＝4.8，8.0Hz，芳香性)，8.30(ddd，1H，J＝1.6，2.4，8.0Hz，芳香性)，8.82(dd，1H，J＝1.6，4.8Hz，芳香性)，8.87(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)，9.16(d，1H，J＝2.4Hz，芳香性)，9.53(s，1H，NH)。
编号GIF-0344的合成 在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(102mg，0.417mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(3mL)溶液中依次添加苯甲酰氯(benzoylchloride)(50.0μL，0.430mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(170μL，1.21mol)。将混合物恢复至室温，搅拌18小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]benzamide)(GIF-0344)(126mg，86.7％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点128-129℃、TLC Rf0.46(己烷/乙酸乙酯＝4/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.62-1.70(m，2H，CH2)，1.78(tt，4H，J＝5.2，5.2Hz，2CH2)，2.88(t，4H，J＝5.2Hz，2CH2)，7.26(d，1H，J＝8.6Hz，芳香性)，7.35(d，1H，J＝0.8，8.6Hz，芳香性)，7.52-7.61(m，1H，芳香性)，8.10(m，2H，芳香性)，7.94(m，2H，芳香性)，8.91(d，1H，J＝0.8Hz，芳香性)，9.44(s，1H，NH)。
编号GIF-0345 在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(51.2mg，0.209mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(2mL)溶液中依次添加4-硝基苯甲酰氯(4-nitrobenzoyl chloride)(64.2mg，0.345mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(120μL，0.859mol)。将混合物恢复至室温，搅拌60小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝8/1～6/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-4-硝基苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-nitrobenzamide)(GIF-0345)(46.3mg，56.3％)的黄色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点125-136℃；TLC Rf0.33(己烷/乙酸乙酯＝4/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.62-1.70(m，2H，CH)，1.77(tt，4H，J＝5.0，5.0Hz，2CH)，2.88(t，4H，J＝5.0Hz，2CH2)，7.30(d，1H，J＝8.0Hz，芳香性)，7.40(dd，1H，J＝1.6，8.2Hz，芳香性)，8.10(dd，2H，J＝1.8，6.8Hz，芳香性)，8.41(d，2H，J＝1.8，6.8Hz，芳香性)，8.86(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)，9.54(s，1H，NH)。
编号GIF-0615的合成 在0℃下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(147mg，0.602mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(4mL)溶液中依次添加4-甲氧基苯甲酰氯(4-methoxybenzoyl chloride)(250mg，1.47mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(254μL，1.83mol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-4-甲氧基苯甲酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-4-methoxybenzamide)(GIF-0615)(240mg，quant.)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点111-114℃；TLC Rf0.33(己烷/乙酸乙酯＝4/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.64-1.68(m，2H，CH)，1.78(tt，4H，J＝5.4，5.4Hz，2CH)，1.60-1.70(m，2H，CH2)，2.39-2.41(m，2H，CH2)，2.87(t，4H，J＝5.4Hz，2CH2)，3.89(s，3H，CH3)，7.03(dd，2H，J＝2.0，7.0Hz，芳香性)，7.23(d，1H，J＝8.0Hz，芳香性)，7.32(dd，1H，J＝1.6，8.0Hz，芳香性)，7.91(dd，2H，J＝2.0，7.0Hz，芳香性)，8.88(d，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，9.34(s，1H，NH)。
编号GIF-0622的合成 在室温下向参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(149mg，0.610mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加对甲苯磺酰氯(p-toluenesulfonyl chloride)(233g，1.22mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(254μL，1.83mol)，将混合物搅拌60小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]-对甲苯磺酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-p-toluenesulfonamide)(GIF-0622)(243mg，quant)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点117-134℃；TLC Rf0.49(己烷/乙酸乙酯＝5/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.55-1.60(m，2H，CH2)，1.66(tt，4H，J＝5.2，5.2Hz，2CH2)，2.36(s，3H，CH3)，2.51(t，4H，J＝5.2Hz，2CH2)，7.11(d，1H，J＝8.0Hz，芳香性)，7.22-7.28(m，3H，芳香性)，7.71(dd，2H，J＝1.8，8.6Hz，芳香性)，7.85(d，1H，J＝2.0Hz，芳香性)，7.94(s，1H，NH)。
编号GIF-0624的合成 在70℃下将硫氰化钾(potassium thiocyanate，商品名)(119mg，1.22mmol)和烟酰氯盐酸盐(nicotinoyl chloride hydrochloride)(352mg，1.97mmol)的乙腈(15mL)溶液搅拌40分钟。恢复至室温后，向其中依次添加参考例1-2得到的2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯胺(2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline(244mg，1.00mmol)的乙腈(5mL)溶液和三乙基胺(triethylamine)(278μL，2.00mmol)，将混合物在50℃搅拌1小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝4/1～1/1)纯化，得到1-烟酰基-3-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]磺脲(1-nicotinoy1-3-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]thiourea)(GIF-0624)(383mg，93.7％)的淡黄色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点142-144℃；TLC Rf0.26(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.58-1.67(m，2H，CH2)，1.75-1.85(m，4H，2CH2)，2.89-2.95(m，4H，2CH2)，7.33-7.40(m，1H，芳香性)，7.44-7.48(m，1H，芳香性)，7.60-7.65(m，1H，芳香性)，8.76-8.78(m，1H，芳香性)，9.05(s，0.6H，芳香性)，9.09-9.14(m，1H，芳香性)，8.37-8.39(m，1H，芳香性)，8.49(s，0.4H，芳香性)。
编号GIF-0614的合成
在0℃下向参考例1-3得到的N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，GIF-0340)(121mg，0.496mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中添加氢氧化钠(60％w/w油混合物)(200mg，0.500mmol)，将混合物搅拌1、时。在0℃下向其中添加碘代甲烷的N，N-二甲基甲酰胺溶液(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.8M，0.62mL，0.496mmol)，再将混合物搅拌3小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(12g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-甲基-N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-methyl-N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0614)(65.9mg，51.5％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点119-121℃；TLC Rf0.36(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.50-1.60(m，2H，CH)，1.60-1.70(m，2H，CH)，1.60-1.70(m，2H，CH)，2.39-2.41(m，2H，CH)，2.80-2.82(m，2H，CH)，3.20(s，3H，CH3)，6.86(d，1H，J＝8.3Hz，芳香性)，7.15(d，2H，J＝4.4Hz，芳香性)，7.41(d，2H，J＝8.3Hz，芳香性)，7.48(s，1H，芳香性)，8.44(d，2H，J＝4.4Hz，芳香性)。
编号GIF-0616的合成
向参考例1-3得到的N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(SRPIN-1，GIF-0340)(528mg，1.51mmol)的甲苯(2.5mL)溶液中添加Lawesson’s试剂(328mg，0.811mmol，商品名)，将混合物在100℃下回流搅拌12小时。恢复至室温后，向其中加入2M的氢氧化钠水溶液，使成碱性，再用12M的氢氧化钠水溶液(×3)逆萃取混合物。向得到的水层中加入2M盐酸使溶液成酸性，然后用乙醚(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)-5-(三氟甲基)苯基]硫代异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinthioamide)(GIF-0616)(186mg，33.7％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点108-109℃；TLC Rf0.27(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.61-1.62(m，2H，CH)，1.68(tt，4H，J＝5.0，5.0Hz，2CH)，2.87(t，4H，J＝5.0Hz，2CH)，7.32(d，1H，J＝7.8Hz，芳香性)，7.51(dd，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，7.71(dd，2H，J＝1.6，6.4Hz，芳香性)，8.76(dd，2H，J＝1.6，6.4Hz，芳香性)，9.58(d，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，10.5(s，1H，NH)。
编号GIF-0341的合成
[参考例15-1]在室温下向1，4-二氯-2-硝基苯(1，4-dichloro-2-nitrobenzene)(390mg，2.03mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(600μL，6.66mmol，商品名)，将混合物搅拌18.5小时。向其中加入水后，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到1-(4-氯-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine)(471mg，96.4％)的橙色油状物质。
TLC Rf0.18(己烷)。
在0℃下向参考例15-1得到的1-(4-氯-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine(471mg，1.95mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(2.00mL，24.0mmol)和无水二氯化锡(1.84g，9.70mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌16小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝9/1)纯化，得到5-氯-2-(1-哌啶基)苯胺(5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline)(388mg，94.3％)的无色油状物质。
TLC Rf0.26(己烷/乙酸乙酯＝18/1)。
在室温下向参考例15-2得到的5-氯-2-(1-哌啶基)苯胺(5-chloro-2-(1-piperidinyl)aniline)(378mg，1.79mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(350mg，1.96mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(740μL，5.30mmol)和催化剂量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine)，搅拌19小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(200g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[5-氯-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-chloro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0341)(180mg，31.8％)的无色固体。
TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点141-143℃；TLC Rf0.32(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.61-1.62(m，2H，CH2)，1.76(tt，4H，J＝5.0，5.0Hz，2CH2)，2.82(t，4H，J＝5.0Hz，2CH2)，7.09(dd，1H，J＝2.6，8.8Hz，芳香性)，7.14(d，1H，J＝8.8Hz，芳香性)，7.75(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，8.60(d，1H，J＝2.6Hz，芳香性)，8.85(dd，2H，J＝1.6，4.4Hz，芳香性)，9.66(s，1H，NH)。
编号GIF-0342的合成 [参考例16-1]在室温下向4-氯-3-硝基甲苯(4-chloro-3-nitrotoluene)(358mg，2.08mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(1mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(660μL，6.66mmol，商品名)，将混合物在100℃下搅拌17小时。恢复至室温后，向其中加入水，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝50/1)纯化，得到1-(4-甲基-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine(212mg，46.2％)的无色油状物质。
TLC Rf0.54(己烷/乙酸乙酯-10/1)。
在0℃下向参考例16-1得到的1-(4-甲基-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine)(212mg，0.880mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(0.70mL，8.4mmol)和无水二氯化锡(834mg，4.39mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌16小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到5-甲基-2-(1-哌啶基)苯胺(5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline)(164mg，95.0％)的淡黄色油状物质。
TLC Rf0.36(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。
在室温下向参考例16-2得到的5-甲基-2-(1-哌啶基)苯胺(5-methyl-2-(1-piperidinyl)aniline)(155mg，0.815mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoylchloride hydrochloride)(172mg，0.966mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(340μL，2.44mmol)和催化剂量的4-(二甲基氨基)吡啶(4-(dimethylamino)pyridine)，将混合物搅拌19小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(10g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[5-甲基-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-methyl-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0342)(69.5mg，28.8％)的无色固体。
TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点142-144℃；TLC Rf0.35(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.62-1.70(m，2H，CH2)，1.75(tt，4H，J＝4.9，4.9Hz，2CH2)，2.37(s，3H，CH3)，2.82(t，4H，J＝4.9Hz，2CH2)，6.94(dd，1H，J＝1.6，8.1Hz，芳香性)，7.12(d，1H，J＝8.1Hz，芳香性)，7.76(dd，2H，J＝1.3，4.5Hz，芳香性)，8.38(d，1H，J＝1.6Hz，芳香性)，8.84(dd，2H，J＝1.3，4.5Hz，芳香性)，9.75(s，1H，NH)。
编号GIF-0348的合成 [参考例17-1]在室温下向1，4-二氟-2-硝基苯(1，4-difluoro-2-nitrobenzene)(225mg，1.41mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(320μL，3.23mmol，商品名)，将混合物搅拌2小时。向其中加入水，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到1-(4-氟-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine)(298mg，94.2％)的橙色油状物质。
TLC Rf0.46(己烷/乙酸乙酯＝12/1)。
在0℃下向参考例17-1得到的1-(4-氟-2-硝基苯基)哌啶(1-(4-fluoro＝2-nitrophenyl)piperidine)(289mg，1.28mmol)的甲醇(5mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.20mL，14.4mmol)和无水二氯化锡(1.22g，6.43mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌21小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(25g，己烷/乙酸乙酯＝12/1)纯化，得到5-氟-2-(1-哌啶基)苯胺(5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline)(250mg，quant.)的无色油状物质。
TLC Rf0.34(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。
在0℃下向参考例17-2得到的5-氟-2-(1-哌啶基)苯胺(5-fluoro-2-(1-piperidinyl)aniline)(248mg，1.27mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(10mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(454mg，2.55mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(385μL，3.83mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(15g，己烷/乙酸乙酯＝1.5/1)纯化，得到N-[5-氟-2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[5-fluoro-2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0348)(257mg，67.6％)的无色固体。
TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点115-116℃；TLC Rf0.40(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.62-1.69(m，2H，CH2)，1.76(bs，4H，2CH2)，2.82(bs，4H，2CH2)，6.81(ddd，1H，J＝2.8，8.8，10.8Hz，芳香性)，7.18(dd，1H，J＝5.6，8.8Hz，芳香性)，7.75(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，8.34(dd，1H，J＝2.8，10.8Hz，芳香性)，9.16(dd，2H，J＝2.0，4.4Hz，芳香性)，9.83(s，1H，NH)。
编号GIF-0349的合成 在室温下向2-氟-1-硝基苯(2-fluoro-1-nitrobenzene)(219mg，1.55mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(0.5mL)溶液中加入哌啶(piperidine)(338μL，3.41mmol，商品名)，将混合物搅拌2小时。向其中加入水，用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到1-(2-硝基苯基)哌啶(1-(2-nitrophenyl)piperidine)(315mg，98.8％)的无色油状物质。
TLC Rf0.53(己烷/乙酸乙酯＝16/1)。
在0℃下向参考例18-1得到的1-(2-硝基苯基)哌啶(1-(2-nitrophenyl)piperidine)(315mg，1.52mmol)的甲醇(10mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.50mL，18.0mmol)和无水二氯化锡(1.45g，7.64mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌17小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-(1-哌啶基)苯胺(2-(1-piperidinyl)aniline)(238mg，88.8％)的淡黄色油状物质。
TLC Rf0.19(己烷/乙酸乙酯＝18/1)。
在0℃下向参考例18-2得到的2-(1-哌啶基)苯胺(2-(1-piperidinyl)aniline)(203mg，1.15mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(616mg，3.46mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(800μL，5.73mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌2小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[2-(1-哌啶基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0349)(259mg，80.0％)的无色固体。
熔点、TLC和1H-NMR(CDCl3，400MHz)的结果如下。
熔点111-113℃；TLC Rf0.35(己烷/乙酸乙酯＝1/1)；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.62-1.67(m，2H，CH2)，1.76(tt，4H，J＝4.8，4.8Hz，2CH2)，2.85(t，4H，J＝4.8Hz，2CH2)，7.13(td，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，7.21(td，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，7.24(dd，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，7.77(dd，2H，J＝1.9，4.4Hz，芳香性)，8.53(dd，1H，J＝1.6，7.8Hz，芳香性)，8.84(dd，2H，J＝1.9，4.4Hz，芳香性)，9.71(s，1H，NH)。
编号GIF-0619的合成 [参考例19-1]在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(498mg，2.38mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次加入二氢吲哚(indoline)(402μL，3.59mmol，商品名)和N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)(619μL，3.59mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌1小时，然后加热至70℃，搅拌5.5小时。将混合物恢复至室温，向其中加入水，然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline(730mg，99.4％)的深红色油状物质。
TLC Rf0.48(己烷/乙酸乙酯＝6/1)。
在0℃下向参考例19-1得到的1-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(730mg，2.37mmol)的甲醇(7mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.28mL，15.4mmol)和无水二氯化锡(1.57g，8.30mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌8小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(619mg，93.9％)的橙红色油状物质。
TLC Rf0.27(己烷/乙酸乙酯＝6/1)。
在0℃下向参考例19-2得到的1-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢吲哚(1-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline)(518mg，1.86mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(669mg，3.76mmol，商品名)、三乙基胺(triethylamine)(773μL，5.58mmol)。将混合物恢复至室温，搅拌2.5小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(50g，己烷/乙酸乙酯＝111)纯化，得到N-[2-(1-二氢吲哚基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1-indolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0619)(643mg，90.1％)的无色固体。
TLC Rf0.32(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。
编号GIF-0620的合成 在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(508mg，2.43mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(2mL)溶液中依次加入二氢异吲哚(isoindoline)(679μL，5.98mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌2小时。向其中加入水，然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline(749mg，quant.)的黄色固体。
TLC Rf0.42(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。
在0℃下向参考例20-1得到的2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(641mg，2.08mmol)的甲醇(7mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.13mL，13.5mmol)和无水二氯化锡(1.38g，7.28mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌8.5小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝15/1)纯化，得到2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(225mg，38.9％)的橙红色油状物质。
TLC Rf0.38(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。
在0℃下向参考例20-2得到的2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]二氢异吲哚(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline)(193mg，0.694mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(6mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(250mg，1.40mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(287μL，2.07mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌3小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(5g，己烷/乙酸乙酯＝1/1)纯化，得到N-[2-(2-二氢异吲哚基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(2-isoindolinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0620)(266mg，quant.)的无色固体。
TLC Rf0.31(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。
编号GIF-0621的合成 [参考例2l-1]在0℃下向1-氟-2-硝基-4-(三氟甲基)苯(1-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene)(506g，2.42mmol，商品名)的N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide(DMF))(4mL)溶液中依次加入1，2，3，4-四氢异喹啉(1，2，3，4-tetrahydroisoquinoline)(909μL，7.26mmol，商品名)。将混合物恢复至室温，搅拌3.5小时。向其中加入水，然后用乙酸乙酯萃取混合物(×3)。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到1，2，3，4-四氢-2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]异喹啉(1，2，3，4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline(779mg，99.9％)的橙色固体。
TLC Rf0.54(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。
在0℃下向参考例21-1得到的1，2，3，4-四氢-2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯基]异喹啉(1，2，3，4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoquinoline(658mg，2.04mmol)的甲醇(8mL)溶液中依次添加浓盐酸(1.11mL，13.3mmol)和无水二氯化锡(1.35g，7.12mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌18小时。向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣用硅胶柱色谱(30g，己烷/乙酸乙酯＝20/1)纯化，得到2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-1，2，3，4-四氢异喹啉(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1，2，3，4-tetrahydroisoquinoline)(426mg，71.4％)的橙红色油状物质。
TLC Rf0.36(己烷/乙酸乙酯＝10/1)。
在0℃下向参考例21-2得到的2-[2-氨基-4-(三氟甲基)苯基]-1，2，3，4-四氢异喹啉(2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]-1，2，3，4-tetrahydroisoquinoline)(315mg，1.08mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloridehydrochloride)(390mg，2.19mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(449μL，3.24mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌0.5小时。向其中加水，用二氯甲烷(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过硅胶柱色谱(20g，己烷/乙酸乙酯＝2/1)纯化，得到N-[2-(1，2，3，4-四氢异喹啉-2-基)-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-(1，2，3，4-tetrahydroisoquinolin-2-yl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0621)(418mg，97.6％)的无色固体。
TLC Rf0.52(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。
编号GIF-0608的合成 在0℃下向3-(三氟甲基)苯胺(3-(trifluoromethyl)aniline，商品名)(208mg，1.29mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoyl chloride hydrochloride)(670mg，3.76mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(864μL，6.20mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌23小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过重结晶纯化，得到N-[2-(3-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0608)(166mg，48.3％)的无色固体。
TLC Rf0.26(己烷/乙酸乙酯＝1/2)。
编号GIF-0612的合成 在0℃下向2-溴-5-(三氟甲基)苯胺(2-bromo-5-trifluoromethyl)aniline，商品名)(480mg，2.00mmol)的二氯甲烷(dichloromethane)(5mL)溶液中依次添加异烟酰氯盐酸盐(isonicotinoylchloride hydrochloride)(427mg，2.39mmol，商品名)和三乙基胺(triethylamine)(410μL，2.94mmol)。恢复至室温，将混合物搅拌24小时。向其中加水，用乙酸乙酯(×3)萃取混合物。用饱和食盐水溶液洗涤得到的有机层，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。残渣通过重结晶纯化，得到N-[2-(2-溴-5-(三氟甲基)苯基]异烟酰胺(N-[2-bromo-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide)(GIF-0612)(308mg，44.8％)的无色固体。
TLC Rf0.46(己烷/乙酸乙酯＝1/1)。
SRPIN-1的毒性试验用哺乳动物进行SRPIN-1的染色体变异筛选试验。用中国仓鼠CHL细胞(大日本制药株式会社)，以染色体变异诱发性为指标检索SRPIN-1的变异原性。试验研究了利用短时间处理(处理时间6小时，恢复时间18小时)的代谢活性法时(+S9mix)和不存在代谢活性化系统时的连续处理法(24小时处理)。将CHL细胞在添加了10％的10％胎牛血清(ICN Flow)的MEM Earle的液体培养基(GIBCO BRL)中，在5％CO2、37℃的条件下培养。给Sprague-Dawley(雄，日本Charles RiverLaboratories，7周龄)以每天一次的比例连续4天腹腔内投与苯巴比妥(第1次30mg/kg，第2-4次60mg/kg)，再于投与第3天腹腔内施用5，6-苯并黄酮80mg/kg，将从这样的肝脏制备的S9 fraction(Oriental酵母工业；A.T.Natarajan等人，Mutation Res.，37，pp 83-90(1976))用于利用代谢活性法的分析。分析所用的S9mix的组成为1mL中有4μmolHEPES缓冲液(pH7.4)、5μmol MgCl2、33μmol KCl、5μmol G6P、4μmol NADP和0.3mL S9 fraction。
在短时间处理法中，将CHL细胞(约4×103cells/mL)在5mL的培养液中在60mm的玻璃器皿中培养3天后，从玻璃器皿中取出1.33mL培养液，加入0.83mL S9mix，立即加入各用量的被检液0.5mL(终浓度5、1.58、0.5mg/mL；溶解于0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液中)。培养6小时后，用PBS洗涤，更换新的培养液5mL，再培养18小时。另外用0.5％CMC-Na水溶液(0.5mL)作为阴性对照，用二甲基亚硝胺(DMN；终浓度500μg/mL)作为阳性对照，进行同样的操作。在连续处理法中，将含CHL细胞(约4×103cells/mL)的5mL培养液在60mm的玻璃器皿中培养3天后，从玻璃器皿中取出0.5mL培养液，加入各用量的被检液0.5mL(终浓度5、1.58、0.5mg/mL)；培养24小时(约1.5细胞周期)。另外用0.5％CMC-Na水溶液(0.5mL)作为阴性对照，用丝裂霉素C(MMC；终浓度0.05μg/mL)作为阳性对照，进行同样的操作。
培养结束2小时前加入10μg/mL的秋水仙酰胺0.1mL，用0.25％胰蛋白酶处理并回收细胞，用0.075M的氯化钾溶液进行低张处理后，用甲醇∶乙酸(3∶1)混合液固定，干燥后，进行吉姆萨染色。每个用量观察50个扩散良好的分裂中期图像，计算染色体结构变异和个数变异的种类和出现的数量。将结构变异分为染色分体切断(ctb)、染色分体交换(cte)、染色体切断(csb)、染色体交换(cse)、其他(5个以上的变异、断片、细粉化等)，按照变异种类记录出现数量。将即使具有1个这些异常的细胞也作为变异细胞。变异细胞出现率小于5％为阴性，大于等于5％、且小于10％为疑阳性、10％或以上为阳性。当被检物质处理组的染色体变异细胞出现率为10％或以上时，判定被检物质为诱发染色体变异的物质。对于阳性对照组的染色体结构变异细胞的出现率，DMN 500μg/Ml处理组为26个(52.0％)，MMC 0.05μg/Ml处理组为24个(48.0％)，阴性对照未见变异，因此判断本试验实施适当。
试验结果如下SRPIN-1的处理组的染色体结构变异细胞在短时间处理法、连续处理法中，在任何一种处理条件下染色体结构异常和数量异常细胞的增加都为阴性。以上结果说明该化合物对哺乳类培养细胞没有染色体变异诱发性。
SRPIN-1的体内给药进行了大鼠的SRPIN-1单次经口给药毒性试验。对饲养期间体重增加顺利的一般状态下未见异常的SlcSD大鼠(5周龄、日本SLC)经口施用125、250、500、1000、2000mg/kg的SRPIN-1，每组雌雄各2只(给药量10mL/kg)。从给药前一天的傍晚到给药后约4小时使动物绝食。给药后2天观察的结果为，雌雄均未见死亡，在一般状态也未见变化。接着将SRPIN-12000mg/kg与上述同样经口施用SlcSD大鼠(5周龄)雌雄各5只，给药后观察14天，记录肉眼观察到的毒性症状的种类、程度、发现时间、恢复时间和死亡时间。结果，雌雄均未见死亡，一般状态也未见异常。
HIV感染细胞的SR蛋白质的磷酸化用9微升基因导入试剂Genejuice(70967-4；从Novagen购入)将3微克HIVpNL4-3基因组(Adachi，A.等人，1986，J.Virol.59284-289)导入来源于人胎儿肾脏的Flp-In-293细胞(R750-07从Invitrogen购入)。4天后，向细胞中加入1μLSDS-PAGE上样缓冲液，使其溶解，在95℃下热变性3分钟后，迅速置于冰上，将其作为蛋白质样品。
将该蛋白质用于蛋白印迹分析。将样品通过4-20％的梯度凝胶在40mA、45分钟的条件下通过用Laemini缓冲液的SDS-PAGE分离。用Broad Range Pre-stained Marker参照物(02525-35；Nacalai)作为参照物检测分子量。接着对PROTRAN硝基纤维素薄膜(BA85；由Schleicher & Schuell BioScience购入)用TransBlot SD细胞(170-3940；由Bio-rad购入)在160mA，60min的条件下进行半干印迹。印迹结束后将膜用TBS振荡洗涤5分钟，接着用BlockingOne(03953-95；由Nacalai购入)封闭1小时，在室温下进行。再将膜用TBS洗涤，与用TBS稀释的识别磷酸化SR蛋白质的小鼠单克隆抗体104抗体(Mab104；由ATCC购入杂交瘤)、小鼠抗SC35抗体(S4045；由BDTransduction购入)、小鼠单克隆抗SF2抗体(AK103Dr.AdrianKrainer提供；Hanamura，A.et al.，1998，RNA 4430-444；Kojima，T.等人，2001，J.Biol.Chem.27632247-56)在4℃下培养过夜。
将膜在室温下用TBS振荡洗涤10分钟，进行3次。然后，将第二抗体的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(NA9310；由Amersham购入)用TBS稀释，与膜在室温下培养1小时。将膜在室温下用TBS振荡洗涤10分钟，进行3次。然后，通过利用ECL Detection Reagents(RPN2105；由Amersham购入)的化学发光法用LAS1000CCD相机(LAS1000；富士flim)拍摄。结果如
图1A所示。
结果发现，伴随着HIVpNL4-3的感染，未见Mab104抗体、SC35抗体、SF2抗体的蛋白印迹分析的信号，不仅SR蛋白质脱磷酸化，SC35、SF2这些内在性SR蛋白质也分解了。
SR蛋白质的分解用Genejuice将1微克融合了HA标记的SRp75、SRp55、SRp40基因的质粒(HA-SRp75、HA-SRp55、HA-SRp40；由Dr.Woan-YuhTARN提供)导入来源于人胎儿肾脏的Flp-In-293细胞，36小时后，加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132(474790；由CALBIOCHEM购入)至终浓度(10μM)。10小时后，进一步用SDS-PAGE上样缓冲液将细胞溶解，进行热变性，作为蛋白质样品。将其同样地进行SDS-PAGE，用羊抗HA抗体(H1803；由Santa Cruz购入)作为第一抗体，驴抗兔IgG抗体(NA 9340；由Amersham购入)作为第二抗体进行蛋白印记分析。结果如图1B所示。
结果，添加了MG132的细胞与对照相比得到更强的信号，因此可知通过MG132抑制了SRp75、SRp55、SRp40的蛋白质分解。另外，对于其他蛋白质也可得到同样的结果(数据未列)，可知通过MG132，SR蛋白质由泛素蛋白酶体进行分解。
SRPK2稳定表达细胞中的SR蛋白质的磷酸化用Flp-In-293细胞建立多株在Flp-In部位导入1个拷贝小鼠SRPK2基因的SRPK2稳定表达细胞。分析中以亲株Flp-In293作为mock，将所建立的多株的SRPK2稳定表达细胞中的SRPK2-2用于实验。将pNL4-3导入这2种细胞，4天后通过蛋白印记分析研究HIV感染的内在性SR蛋白质的动态。
与图1A同样，进行蛋白印记分析时，将HIVpNL4-3基因组导入SRPK2-2细胞时，用Mab104抗体在SRp35、SRp40、SRp55、SRp75的位置观察到信号，由此可知Mab104识别的SR结构域处于磷酸化状态。
进一步，根据使用SC35抗体、SF2抗体的蛋白印记分析，确认导入HIVpNL4-3基因的SRPK2-2细胞见到SC35、SF2的信号。示于图2A。
由这些结果可知，通常伴随着HIV感染，SR蛋白质会分解，但在SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质维持了磷酸化状态，结果稳定了SR蛋白质。由此可知，SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质处于磷酸化状态，不会通过泛素蛋白酶体分解。
SRPK2稳定表达细胞中SR蛋白质的存在向在Flp-In部位导入1个拷贝SRPK 2基因、稳定表达SRPK2基因的Flp-1n-293细胞(SRPK2-2细胞)和亲株Flp-In-293(mock)中，用Genejuice导入1μg HIVpNL4-3基因组和1μg融合了HA标记的SRp75、SRp55和SRp40基因的质粒(HA-SRp75、HA-SRp55、HA-SRp40；由Dr.Woah-Yuh TARN提供)，36小时后回收样品，进行蛋白印记分析。结果如图2B所示。结果，随着HIV的感染，在Flp-In-293细胞中，不仅SC35、SF2，SRp75、SRp55、SRp40的抗HA抗体信号也消失或减弱。另外在SRPK2-2细胞中，同样地信号与对照相比减弱了，但与SC35、SF2同样，观察到SRp75、SRp55、SRp40的信号。
这些结果表明，随着HIV的感染，促进了SR蛋白质的分解，但在SRPK2-2细胞中，由于SR蛋白质被磷酸化，SR蛋白质稳定。
测定HIV的产生量在实施例2A(图2A)的实验时，回收培养上清测定HIV的产生量。回收导入基因后的培养上清，用lumipulse ELISA系统(Fujirebio)测定培养上清所含的HIV外膜蛋白质p24的量。结果如图2C所示。
结果，与mock的培养上清相比，在SRPK2-2细胞中产生了2.3倍量的HIV。
由上可知，相应于HIV感染，SR蛋白质脱磷酸化，使SR蛋白质恒定地处于磷酸化状态时，应急于感染的SR蛋白质的控制机构不发挥作用，结果HIV产生亢进。
这说明相应于HIV感染的SR蛋白质脱磷酸化发挥着宿主防御机构的功能。
参与体内HIV产生的SR蛋白质的研究HIV在其基因表达过程中用宿主的因子进行转录、加工、翻译。特别是，HIV的Tat、Rev具有断裂的外显子，推测对于其基因表达mRNA的剪接是必须的。
如实施例1-2(图1-2)所示，伴随着HIV感染，宿主的防御机构作用，SR蛋白质分解，但对体内参与HIV剪接反应、或参与此的蛋白质还不了解。实际上在细胞内存在多种SR蛋白质，将表达这些SR蛋白质的质粒(0.5μg)与HIVpNL4-3基因组一起导入，研究了其效果。结果如图3A所示。
将表达Mock、SC35、SF2、SRp40、SRp55、SRp75的质粒分别导入Flp-In293细胞内，36小时后回收培养上清，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。
结果，与Mock相比，SRp40、SRp75中HIVp24的量增加，确认了SRp40、SRp75中HIV产生亢进的效果。
用hnRNPA1研究对体内HIV产生的效果如图3B所示，与HIVpNL4-3基因组(0.5μg)和一定量(500ng)的SRp40、SRp75表达质粒，阶段性地增加hnRNPA1表达质粒的量，向Flp-In293细胞进行基因导入。36小时后回收培养上清，用lumipulseELISA系统测定HIVp24的量。
得到的结果是用lumipulse ELISA系统测定的HIVp24量依赖于hnRNPA1的量减少。即，hnRNPA1相对于SRp40和SRp75竞争性地发挥作用，抑制HIV的产生。
这表明在细胞内HIV的基因表达通过剪接反应控制表达。实际上，由于SRp40、SRp75、hnRNPA1共存于细胞内，伴随HIV感染的SR蛋白质的分解优先于细胞内的hnRNPA1，由此抑制HIV基因表达作为防御机构。
用于抑制细胞内SR蛋白质磷酸化的SRPK的抑制剂的探索以磷酸化酶共同具有的ATP结合部位为目标，探索了竞争性结合的抑制剂。筛选结果，选中的化合物为分子量为349.35的Maybridge公司已经在销售的化合物之一(CAS Registry No.218156-96-8)。但是，关于磷酸化酶的抑制至今没有任何报道。我们将其命名为SRPIN-1(SRPK抑制剂-1)。
使用SRPIN-1的SRPK1的磷酸化活性抑制的研究合成相当于SF2的RS结构域的RS肽(NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH)(序列号5)。将其用10mM Tris-HCl(pH7.5)溶解，使成为1mg/ml。用1μg在大肠菌中表达纯化的重组SRPK1蛋白质，在反应缓冲液(250μM MgCl2、0.25mMATP、1mCi[γ-32P]ATP、SRPIN-1终浓度0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μM)中在30℃的水浴中培养10分钟。该磷酸化酶活性测定的SRPK1和RS肽的量和反应时间的条件是预先研究反应的直线性，选择了直线性成立的条件。
SRPK1和RS肽的反应进行10分钟后，将反应液滴至P81磷酸纤维素薄膜(P81；Whatman)，用5％磷酸溶液洗涤。洗涤后，通过液体闪烁计数器测定P81薄膜的32P的放射活性。结果如图4B所示。
结果，SRPIN-1相对于SRPK1的IC50为约400nM。另外通过同样的方法研究了CLK1、CLK2、CLK3、CLK4、SRPK2、PRP4、PKA、PKC，由于即使终浓度为10μM也未见抑制效果，因此可以说SRPIN-1是SRPK1的特异性酶抑制剂。
对使用SRPIN-1的体内SR蛋白质磷酸化的抑制、以及伴随其的SR蛋白质分解诱导的研究向Flp-In293细胞中导入HA-SRp75质粒(1.0μg)，36小时后分别添加MG132(终浓度10μM)、SRPIN-1(10、20、50μM)培养15小时。然后，用SDS-PAGE上样缓冲液溶解细胞，作为蛋白质样品。将该样品进行SDS-PAGE，用抗HA抗体进行蛋白印迹分析。作为蛋白质量的对照，使用抗β-肌动蛋白抗体进行蛋白印迹分析。结果示于图4C。
结果，HA抗体信号SRPIN-1浓度依赖性地减弱。这表明内源性的SRPK1活性SRPIN-1依赖性地被抑制，结果分解了SRp75蛋白质。
这说明SRPIN-1对SRPK1的抑制可在体内抑制SR蛋白质的磷酸化，结果使SR蛋白质不稳定，促进了蛋白质分解。
SRPIN-1的添加对HIV感染的抑制的研究向MT-4细胞中添加用293T细胞制备的HIV病毒颗粒，进行感染实验。首先，在向MT-4细胞添加病毒制备液的同时，添加SRPIN-1(终浓度0.5、10、20μM)。在2小时、37℃、5％CO2的培养条件下培养后，离心细胞，更换新的培养液。然后，48小时后回收培养上清，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。结果示于图4D。
结果，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量依赖于SRPIN-1的浓度而减少。这说明SRPIN-1可浓度依赖性地抑制HIV的产生。
使用SRPIN-1类似物的SRPK1/2的磷酸化活性的抑制与实施例4B一样，确认使用SRPIN-1类似物的SRPK1和SRPK2的磷酸化活性的抑制活性。用1μg在大肠菌中表达纯化的重组SRPK1蛋白质和SRPK2蛋白质，在反应缓冲液(400μM HEPE(pH7.5)100μM MgCl2、200μM ATP、1mCi[γ-32P]ATP、RS肽(序列号5)1mg/ml、SRPIN-1类似物各10μM(DMSO中)在30℃的水浴中培养20分钟。
SRPK1或SRPK2和RS肽的反应进行20分钟后，将反应液滴至P81磷酸纤维素薄膜(P81；Whatman)，用5％磷酸溶液洗涤(10分钟，3次)。洗涤后，通过液体闪烁计数器测定P81薄膜32P的放射活性。结果如图5A所示，各SRPIN-1类似物显示了对SRPK1和/或SRPK2的磷酸化活性抑制效果。特别是化合物编号340(SRPIN-1)～348、612、613、615、618、619、621、624、625对SRPK1或SRPK2具有强的抑制效果。
接着，确认了各SRPIN-1类似物对HIV复制的抑制效果。向MT-4细胞(JCRB No.JCRB0135)中添加用293T细胞制备的HIV病毒颗粒，进行感染实验。首先，在向MT-4细胞添加病毒制备液的同时，添加SRPIN-1类似物(终浓度5、10、20μM)。在2小时、37℃、5％CO2的培养条件下培养后，离心细胞，更换新的培养液。然后，48小时后回收培养上清，用lumipulse ELISA系统测定HIVp24的量。结果图5B所示各SRPIN-1类似物具有抑制HIV复制的活性。特别是化合物编号340、341、342、343、345、347、348、608、613、615、616、618、619、620、622、623、624、625、626对HIV增殖具有强的抑制效果。另外，如图5C所示，在使用其他细胞(Jurkat)的实验中同样也确认了抑制HIV增殖的效果。
对辛德比斯病毒的增殖抑制效果向Vero细胞(JCRB0111)中加入5μL辛德比斯病毒(4.7×107PFU/ml)，将培养24小时的培养上清制备为病毒储液。将其添加至BHK21Cl3细胞(JCRB9020)中，稀释为102～107PFU，同时添加SRPIN-1(终浓度5、10、20或40μM)。在室温下感染1小时后，加入含有1％甲基纤维素(SIGMA M0512-100G)的培养基，在48小时、37℃、5％CO2的培养条件下静静地培养，在位相差显微镜下观察细胞形态，同时数出因感染辛德比斯病毒而导致细胞死亡的空斑数(空斑试验)，计算PFU/ml。
图6A示出了病毒感染20小时后的细胞位相差显微图像。在未施用SRPIN-1的细胞(图中的“+SIN、对照”)明显看到因辛德比斯病毒增殖而导致的细胞损伤，但是通过施用SRPIN-1(40μM)抑制了细胞损伤(图中的“+SIN、40μM(#340)”)。空斑试验的结果也表明5μM以上的SRPIN-1显著且浓度依赖性地抑制辛德比斯病毒的增殖(图6B)。
对巨细胞病毒的增殖抑制效果向HFL1细胞(IFO50074)添加巨细胞病毒(1×104PFU/ml)，同时添加SRPIN-1或其类似物(化合物编号340和349；终浓度20或40μM)。结果，感染7天后，在位相差显微镜下观察巨细胞病毒感染的HFL1细胞时发现，如图7所示，在没有添加SRPIN-1的对照组的HFL1细胞(图中的1和2)观察到巨细胞病毒感染特有的形态变化和细胞死亡，与此相对，添加了SRPIN-1(20μM)的HFL1细胞(图中的3)虽然感染了巨细胞病毒，但未见异常的形态变化或细胞死亡。在添加了高浓度(40μM)的SRPIN-1的HFL1细胞中，观察到认为是由该化合物引起的一部分细胞形态变化。另外，通过向HFL1细胞中添加SRPIN-1的类似物化合物(化合物编号349)20μM或40μM也可抑制巨细胞病毒感染引起的异常形态变化或细胞死亡(图中的5和6)。结果证明，在本试验条件下，SRPIN-1及其类似物可抑制巨细胞病毒感染引起的异常形态变化或细胞死亡。
对SARS病毒的增殖抑制效果使Vero细胞(JCRB0111)感染SARS病毒(FFM-1)(Yamamoto，N.et.al.，Biochem Biophys Res Commun.318，719-72592004))，同时添加SRPIN-1或其类似物(终浓度5、10、20、40μM)。在室温感染2小时后，加入含有1％甲基纤维素(SIGMA M0512-100G)的D-MEM，在48小时、37℃、5％CO2的培养条件下培养。数出SARS病毒而导致细胞死亡的空斑数(空斑试验)，计算PFU/ml。结果，如图8A所示，40μM的SRPIN-1及其类似物(化合物编号349)显著抑制了SARS病毒的增殖。但是，就效果而言，SRPIN-1与类似化合物(化合物编号349)相比，病毒增殖抑制效果更显著。另外，如图8B所示，SRPIN-1在1μM到40μM的浓度范围浓度依赖性地抑制SARS病毒的增殖。
产业实用性根据本发明，明确了SRPIN-1(SR蛋白质磷酸化抑制剂1，SRprotein phosphorylation inhibitor 1)及其类似物具有抑制磷酸化酶SRPK的活性。发现SR蛋白质因被SRPK磷酸化而在细胞中稳定存在，但如通过这些SRPK抑制剂抑制SRPK的酶活性，则SR蛋白质的磷酸化被抑制，并经泛素蛋白酶体途径分解。因此尝试了添加SRPK抑制剂来抑制SRPK，在HIV感染实验中发现SRPK抑制剂具有抑制病毒复制的抗病毒作用。
进一步，本发明还有以下效果，即，提供通过控制SR蛋白质的活性以同一机理对广的范围的病毒有效的抗病毒剂。
序列表<110>HAGIWARA，Masatoshi<120>SR蛋白质的磷酸化控制方法以及以SR蛋白质活性控制剂为有效成分的抗病毒剂<130>HAG-A0401P<140>
<141>
<150>JP 2003-435085<151>2003-12-26<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1965<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1965)<223>
<400>1atg gag cgg aaa gtg ctt gcg ctc cag gcc cga aag aaa agg acc aag48Met Glu Arg Lys Val Leu Ala Leu Gln Ala Arg Lys Lys Arg Thr Lys1 5 10 15gcc aag aag gac aaa gcc caa agg aaa tct gaa act cag cac cga ggc96Ala Lys Lys Asp Lys Ala Gln Arg Lys Ser Glu Thr Gln His Arg Gly20 25 30tct gct ccc cac tct gag agt gat cta cca gag cag gaa gag gag att144Ser Ala Pro His Ser Glu Ser Asp Leu Pro Glu Gln Glu Glu Glu Ile35 40 45ctg gga tct gat gat gat gag caa gaa gat cct aat gat tat tgt aaa192Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Gln Glu Asp Pro Asn Asp Tyr Cys Lys50 55 60
gga ggt tat cat ctt gtg aaa att gga gat cta ttc aat ggg aga tac240Gly Gly Tyr His Leu Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg Tyr65 70 75 80cat gtg atc cga aag tta ggc tgg gga cac ttt tca aca gta tgg tta288His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp Leu85 90 95tca tgg gat att cag ggg aag aaa ttt gtg gca atg aaa gta gtt aaa336Ser Trp Asp Ile Gln Gly Lys Lys Phe Val Ala Met Lys Val Val Lys100 105 110agt gct gaa cat tac act gaa aca gca cta gat gaa atc cgg ttg ctg384Ser Ala Glu His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Arg Leu Leu115 120 125aag tca gtt cgc aat tca gac cct aat gat cca aat aga gaa atg gtt432Lys Ser Val Arg Asn Ser Asp Pro Asn Asp Pro Asn Arg Glu Met Val130 135 140gtt caa cta cta gat gac ttt aaa ata tca gga gtt aat gga aca cat480Val Gln Leu Leu Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Val Asn Gly Thr His145 150 155 160atc tgc atg gta ttt gaa gtt ttg ggg cat cat ctg ctc aag tgg atc528Ile Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp Ile165 170 175atc aaa tcc aat tat cag ggg ctt cca ctg cct tgt gtc aaa aaa att576Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Leu Pro Cys Val Lys Lys Ile180 185 190att cag caa gtg tta cag ggt ctt gat tat tta cat acc aag tgc cgt624Ile Gln Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Thr Lys Cys Arg195 200 205atc atc cac act gac att aaa cca gag aac atc tta ttg tca gtg aat672Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Ser Val Asn210 215 220gag cag tac att cgg agg ctg gct gca gaa gca aca gaa tgg cag cga720Glu Gln Tyr Ile Arg Arg Leu Ala Ala Glu Ala Thr Glu Trp Gln Arg225 230 235 240
tct gga gct cct ccg cct tcc gga tct gca gtc agt act gct ccc cag768Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln245 250 255cct aaa cca gct gac aaa atg tca aag aat aag aag aag aaa ttg aag816Pro Lys Pro Ala Asp Lys Met Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys260 265 270aag aag cag aag cgc cag gca gaa tta cta gag aag cga atg cag gaa864Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Met Gln Glu275 280 285att gag gaa atg gag aaa gag tcg ggc cct ggg caa aaa aga cca aac912Ile Glu Glu Met Glu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Gln Lys Arg Pro Asn290 295 300aag caa gaa gaa tca gag agt cct gtt gaa aga ccc ttg aaa gag aac960Lys Gln Glu Glu Ser Glu Ser Pro Val Glu Arg Pro Leu Lys Glu Asn305 310 315 320cca cct aat aaa atg acc caa gaa aaa ctt gaa gag tca agt acc att1008Pro Pro Asn Lys Met Thr Gln Glu Lys Leu Glu Glu Ser Ser Thr Ile325 330 335ggc cag gat caa acg ctt atg gaa cgt gat aca gag ggt ggt gca gca1056Gly Gln Asp Gln Thr Leu Met Glu Arg Asp Thr Glu Gly Gly Ala Ala340 345 350gaa att aat tgc aat gga gtg att gaa gtc att aat tat act cag aac1104Glu Ile Asn Cys Asn Gly Val Ile Glu Val Ile Asn Tyr Thr Gln Asn355 360 365agt aat aat gaa aca ttg aga cat aaa gag gat cta cat aat gct aat1152Ser Asn Asn Glu Thr Leu Arg His Lys Glu Asp Leu His Asn Ala Asn370 375 380gac tgt gat gtc caa aat ttg aat cag gaa tct agt ttc cta agc tcc1200Asp Cys Asp Val Gln Asn Leu Asn Gln Glu Ser Ser Phe Leu Ser Ser385 390 395 400caa aat gga gac agc agc aca tct caa gaa aca gac tct tgt aca cct1248Gln Asn Gly Asp Ser Ser Thr Ser Gln Glu Thr Asp Ser Cys Thr Pro405 410 415
ata aca tct gag gtg tca gac acc atg gtg tgc cag tct tcc tca act1296Ile Thr Ser Glu Val Ser Asp Thr Met Val Cys Gln Ser Ser Ser Thr420 425 430gta ggt cag tca ttc agt gaa caa cac att agc caa ctt caa gaa agc1344Val Gly Gln Ser Phe Ser Glu Gln His Ile Ser Gln Leu Gln Glu Ser435 440 445att cgg gca gag ata ccc tgt gaa gat gaa caa gag caa gaa cat aac1392Ile Arg Ala Glu Ile Pro Cys Glu Asp Glu Gln Glu Gln Glu His Asn450 455 460gga cca ctg gac aac aaa gga aaa tcc acg gct gga aat ttt ctt gtt1440Gly Pro Leu Asp Asn Lys Gly Lys Ser Thr Ala Gly Asn Phe Leu Val465 470 475 480aat ccc ctt gag cca aaa aat gca gaa aag ctc aag gtg aag att gct1488Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Ala Glu Lys Leu Lys Val Lys Ile Ala485 490 495gac ctt gga aat gct tgt tgg gtg cac aaa cat ttc act gaa gat att1536Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile500 505 510caa aca agg caa tat cgt tcc ttg gaa gtt cta atc gga tct ggc tat1584Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Leu Glu Val Leu Ile Gly Ser Gly Tyr515 520 525aat acc cct gct gac att tgg agc acg gca tgc atg gcc ttt gaa ctg1632Asn Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu530 535 540gcc aca ggt gac tat ttg ttt gaa cct cat tca ggg gaa gag tac act1680Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Glu Tyr Thr545 550 555 560cga gat gaa gat cac att gca ttg atc ata gaa ctt ctg ggg aag gtg1728Arg Asp Glu Asp His Ile Ala Leu Ile Ile Glu Leu Leu Gly Lys Val565 570 575cct cgc aag ctc att gtg gca gga aaa tat tcc aag gaa ttt ttc acc1776Pro Arg Lys Leu Ile Val Ala Gly Lys Tyr Ser Lys Glu Phe Phe Thr580 585 590
aaa aaa ggt gac ctg aaa cat atc acg aag ctg aaa cct tgg ggc ctt1824Lys Lys Gly Asp Leu Lys His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Gly Leu595 600 605ttt gag gtt cta gtg gag aag tat gag tgg tcg cag gaa gag gca gct1872Phe Glu Val Leu Val Glu Lys Tyr Glu Trp Ser Gln Glu Glu Ala Ala610 615 620ggc ttc aca gat ttc tta ctg ccc atg ttg gag ctg atc cct gag aag1920Gly Phe Thr Asp Phe Leu Leu Pro Met Leu Glu Leu Ile Pro Glu Lys625 630 635 640aga gcc act gcc gcc gag tgt ctc cgg cac cct tgg ctt aac tcc1965Arg Ala Thr Ala Ala Glu Cys Leu Arg His Pro Trp Leu Asn Ser645 650 655<210>2<211>655<212>PRT<213>人<400>2Met Glu Arg Lys Val Leu Ala Leu Gln Ala Arg Lys Lys Arg Thr Lys1 5 10 15Ala Lys Lys Asp Lys Ala Gln Arg Lys Ser Glu Thr Gln His Arg Gly20 25 30Ser Ala Pro His Ser Glu Ser Asp Leu Pro Glu Gln Glu Glu Glu Ile35 40 45Leu Gly Ser Asp Asp Asp Glu Gln Glu Asp Pro Asn Asp Tyr Cys Lys50 55 60Gly Gly Tyr His Leu Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg Tyr65 70 75 80His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp Leu85 90 95Ser Trp Asp Ile Gln Gly Lys Lys Phe Val Ala Met Lys Val Val Lys100 105 110
Ser Ala Glu His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Arg Leu Leu115 120 125Lys Ser Val Arg Asn Ser Asp Pro Asn Asp Pro Asn Arg Glu Met Val130 135 140Val Gln Leu Leu Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Val Asn Gly Thr His145 150 155 160Ile Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp Ile165 170 175Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Leu Pro Cys Val Lys Lys Ile180 185 190Ile Gln Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Thr Lys Cys Arg195 200 205Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Ser Val Asn210 215 220Glu Gln Tyr Ile Arg Arg Leu Ala Ala Glu Ala Thr Glu Trp Gln Arg225 230 235 240Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln245 250 255Pro Lys Pro Ala Asp Lys Met Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys260 265 270Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Met Gln Glu275 280 285Ile Glu Glu Met Glu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Gln Lys Arg Pro Asn290 295 300Lys Gln Glu Glu Ser Glu Ser Pro Val Glu Arg Pro Leu Lys Glu Asn305 310 315 320Pro Pro Asn Lys Met Thr Gln Glu Lys Leu Glu Glu Ser Ser Thr Ile325 330 335Gly Gln Asp Gln Thr Leu Met Glu Arg Asp Thr Glu Gly Gly Ala Ala
340 345 350Glu Ile Asn Cys Asn Gly Val Ile Glu Val Ile Asn Tyr Thr Gln Asn355 360 365Ser Asn Asn Glu Thr Leu Arg His Lys Glu Asp Leu His Asn Ala Asn370 375 380Asp Cys Asp Val Gln Asn Leu Asn Gln Glu Ser Ser Phe Leu Ser Ser385 390 395 400Gln Asn Gly Asp Ser Ser Thr Ser Gln Glu Thr Asp Ser Cys Thr Pro405 410 415Ile Thr Ser Glu Val Ser Asp Thr Met Val Cys Gln Ser Ser Ser Thr420 425 430Val Gly Gln Ser Phe Ser Glu Gln His Ile Ser Gln Leu Gln Glu Ser435 440 445Ile Arg Ala Glu Ile Pro Cys Glu Asp Glu Gln Glu Gln Glu His Asn450 455 460Gly Pro Leu Asp Asn Lys Gly Lys Ser Thr Ala Gly Asn Phe Leu Val465 470 475 480Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Ala Glu Lys Leu Lys Val Lys Ile Ala485 490 495Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile500 505 510Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Leu Glu Val Leu Ile Gly Ser Gly Tyr515 520 525Asn Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu530 535 540Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Glu Tyr Thr545 550 555 560Arg Asp Glu Asp His Ile Ala Leu Ile Ile Glu Leu Leu Gly Lys Val565 570 575
Pro Arg Lys Leu Ile Val Ala Gly Lys Tyr Ser Lys Glu Phe Phe Thr580 585 590Lys Lys Gly Asp Leu Lys His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Gly Leu595 600 605Phe Glu Val Leu Val Glu Lys Tyr Glu Trp Ser Gln Glu Glu Ala Ala610 615 620Gly Phe Thr Asp Phe Leu Leu Pro Met Leu Glu Leu Ile Pro Glu Lys625 630 635 640Arg Ala Thr Ala Ala Glu Cys Leu Arg His Pro Trp Leu Asn Ser645 650 655<210>3<211>2058<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(2058)<223>
<400>3atg tca gtt aac tct gag aag tcg tcc tct tca gaa agg ccg gag cct48Met Ser Val Asn Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ser Glu Arg Pro Glu Pro1 5 10 15caa cag aaa gct cct tta gtt cct cct cct cca ccg cca cca cca cca96Gln Gln Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro20 25 30cca ccg cca cct ttg cca gac ccc aca ccc ccg gag cca gag gag gag144Pro Pro Pro Pro Leu Pro Asp Pro Thr Pro Pro Glu Pro Glu Glu Glu35 40 45atc ctg gga tca gat gat gag gag caa gag gac cct gcg gac tac tgc192Ile Leu Gly Ser Asp Asp Glu Glu Gln Glu Asp Pro Ala Asp Tyr Cys50 55 60aaa ggt gga tat cat cca gtg aaa att gga gac ctc ttc aat ggc cgg240
Lys Gly Gly Tyr His Pro Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg65 70 75 80tat cat gtt att aga aag ctt gga tgg ggg cac ttc tct act gtc tgg288Tyr His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp85 90 95ctg tgc tgg gat atg cag ggg aaa aga ttt gtt gca atg aaa gtt gta336Leu Cys Trp Asp Met Gln Gly Lys Arg Phe Val Ala Met Lys Val Val100 105 110aaa agt gcc cag cat tat acg gag aca gcc ttg gat gaa ata aaa ttg384Lys Ser Ala Gln His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Lys Leu115 120 125ctc aaa tgt gtt cga gaa agt gat ccc agt gac cca aac aaa gac atg432Leu Lys Cys Val Arg Glu Ser Asp Pro Ser Asp Pro Asn Lys Asp Met130 135 140gtg gtc cag ctc att gac gac ttc aag att tca ggc atg aat ggg ata480Val Val Gln Leu Ile Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Met Asn Gly Ile145 150 155 160cat gtc tgc atg gtc ttc gaa gta ctt ggc cac cat ctc ctc aag tgg528His Val Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp165 170 175atc atc aaa tcc aac tat caa ggc ctc cca gta cgt tgt gtg aag agt576Ile Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Val Arg Cys Val Lys Ser180 185 190atc att cga cag gtc ctt caa ggg tta gat tac tta cac agt aag tgc624Ile Ile Arg Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Ser Lys Cys195 200 205aag atc att cat act gac ata aag ccg gaa aat atc ttg atg tgt gtg672Lys Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Met Cys Val210 215 220gat gat gca tat gtg aga aga atg gca gct gag cct gag tgg cag aaa720Asp Asp Ala Tyr Val Arg Arg Met Ala Ala Glu Pro Glu Trp Gln Lys225 230 235 240gca ggt gct cct cct cct tca ggg tct gca gtg agt acg gct cca cag768
Ala Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln245 250 255cag aaa cct ata gga aaa ata tct aaa aac aaa aag aaa aaa ctg aaa816Gln Lys Pro Ile Gly Lys Ile Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys260 265 270aag aaa cag aag agg cag gct gag tta ttg gag aag cgc ctg cag gag864Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Leu Gln Glu275 280 285ata gaa gaa ttg gag cga gaa gct gaa agg aaa ata ata gaa gaa aac912Ile Glu Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Glu Asn290 295 300atc acc tca gct gca cct tcc aat gac cag gat ggc gaa tac tgc cca960Ile Thr Ser Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gln Asp Gly Glu Tyr Cys Pro305 310 315 320gag gtg aaa cta aaa aca aca gga tta gag gag gcg gct gag gca gag1008Glu Val Lys Leu Lys Thr Thr Gly Leu Glu Glu Ala Ala Glu Ala Glu325 330 335act gca aag gac aat ggt gaa gct gag gac cag gaa gag aaa gaa gat1056Thr Ala Lys Asp Asn Gly Glu Ala Glu Asp Gln Glu Glu Lys Glu Asp340 345 350gct gag aaa gaa aac att gaa aaa gat gaa gat gat gta gat cag gaa1104Ala Glu Lys Glu Asn Ile Glu Lys Asp Glu Asp Asp Val Asp Gln Glu355 360 365ctt gcg aac ata gac cct acg tgg ata gaa tca cct aaa acc aat ggc1152Leu Ala Asn Ile Asp Pro Thr Trp Ile Glu Ser Pro Lys Thr Asn Gly370 375 380cat att gag aat ggc cca ttc tca ctg gag cag caa ctg gac gat gaa1200His Ile Glu Asn Gly Pro Phe Ser Leu Glu Gln Gln Leu Asp Asp Glu385 390 395 400gat gat gat gaa gaa gac tgc cca aat cct gag gaa tat aat ctt gat1248Asp Asp Asp Glu Glu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Glu Tyr Asn Leu Asp405 410 415gag cca aat gca gaa agt gat tac aca tat agc agc tcc tat gaa caa1296
Glu Pro Asn Ala Glu Ser Asp Tyr Thr Tyr Ser Ser Ser Tyr Glu Gln420 425 430ttc aat ggt gaa ttg cca aat gga cga cat aaa att ccc gag tca cag1344Phe Asn Gly Glu Leu Pro Asn Gly Arg His Lys Ile Pro Glu Ser Gln435 440 445ttc cca gag ttt tcc acc tcg ttg ttc tct gga tcc tta gaa cct gtg1392Phe Pro Glu Phe Ser Thr Ser Leu Phe Ser Gly Ser Leu Glu Pro Val450 455 460gcc tgc ggc tct gtg ctt tct gag gga tca cca ctt act gag caa gag1440Ala Cys Gly Ser Val Leu Ser Glu Gly Ser Pro Leu Thr Glu Gln Glu465 470 475 480gag agc agt cca tcc cat gac aga agc aga acg gtt tca gcc tcc agt1488Glu Ser Ser Pro Ser His Asp Arg Ser Arg Thr Val Ser Ala Ser Ser485 490 495act ggg gat ttg cca aaa gca aaa acc cgg gca gct gac ttg ttg gtg1536Thr Gly Asp Leu Pro Lys Ala Lys Thr Arg Ala Ala Asp Leu Leu Val500 505 510aat ccc ctg gat ccg cgg aat cga gat aaa att aga gta aaa att gct1584Asn Pro Leu Asp Pro Arg Asn Arg Asp Lys Ile Arg Val Lys Ile Ala515 520 525gac ctg gga aat gct tgt tgg gtg cat aaa cac ttc acg gaa gac atc1632Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile530 535 540cag acg cgt cag tac cgc tcc ata gag gtt tta ata gga gcg ggg tac1680Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Ile Glu Val Leu Ile Gly Ala Gly Tyr545 550 555 560agc acc cct gcg gac atc tgg agc acg gcg tgt atg gca ttt gag ctg1728Ser Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu565 570 575gca acg gga gat tat ttg ttt gaa cca cat tct ggg gaa gac tat tcc1776Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Asp Tyr Ser580 585 590aga gac gaa gac cac ata gcc cac atc ata gag ctg cta ggc agt att1824
Arg Asp Glu Asp His Ile Ala His Ile Ile Glu Leu Leu Gly Ser Ile595 600 605cca agg cac ttt gct cta tct gga aaa tat tct cgg gaa ttc ttc aat1872Pro Arg His Phe Ala Leu Ser Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Phe Phe Asn610 615 620cgc aga gga gaa ctg cga cac atc acc aag ctg aag ccc tgg agc ctc1920Arg Arg Gly Glu Leu Arg His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Ser Leu625 630 635 640ttt gat gta ctt gtg gaa aag tat ggc tgg ccc cat gaa gat gct gca1968Phe Asp Val Leu Val Glu Lys Tyr Gly Trp Pro His Glu Asp Ala Ala645 650 655cag ttt aca gat ttc ctg atc ccg atg tta gaa atg gtt cca gaa aaa2016Gln Phe Thr Asp Phe Leu Ile Pro Met Leu Glu Met Val Pro Glu Lys660 665 670cga gcc tca gct ggc gaa tgt cgg cat cct tgg ttg aat tct2058Arg Ala Ser Ala Gly Glu Cys Arg His Pro Trp Leu Asn Ser675 680 685<210>4<211>686<212>PRT<213>人<400>4Met Ser Val Asn Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ser Glu Arg Pro Glu Pro1 5 10 15Gln Gln Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro20 25 30Pro Pro Pro Pro Leu Pro Asp Pro Thr Pro Pro Glu Pro Glu Glu Glu35 40 45Ile Leu Gly Ser Asp Asp Glu Glu Gln Glu Asp Pro Ala Asp Tyr Cys50 55 60Lys Gly Gly Tyr His Pro Val Lys Ile Gly Asp Leu Phe Asn Gly Arg65 70 75 80
Tyr His Val Ile Arg Lys Leu Gly Trp Gly His Phe Ser Thr Val Trp85 90 95Leu Cys Trp Asp Met Gln Gly Lys Arg Phe Val Ala Met Lys Val Val100 105 110Lys Ser Ala Gln His Tyr Thr Glu Thr Ala Leu Asp Glu Ile Lys Leu115 120 125Leu Lys Cys Val Arg Glu Ser Asp Pro Ser Asp Pro Asn Lys Asp Met130 135 140Val Val Gln Leu Ile Asp Asp Phe Lys Ile Ser Gly Met Asn Gly Ile145 150 155 160His Val Cys Met Val Phe Glu Val Leu Gly His His Leu Leu Lys Trp165 170 175Ile Ile Lys Ser Asn Tyr Gln Gly Leu Pro Val Arg Cys Val Lys Ser180 185 190Ile Ile Arg Gln Val Leu Gln Gly Leu Asp Tyr Leu His Ser Lys Cys195 200 205Lys Ile Ile His Thr Asp Ile Lys Pro Glu Asn Ile Leu Met Cys Val210 215 220Asp Asp Ala Tyr Val Arg Arg Met Ala Ala Glu Pro Glu Trp Gln Lys225 230 235 240Ala Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ala Val Ser Thr Ala Pro Gln245 250 255Gln Lys Pro Ile Gly Lys Ile Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Leu Lys260 265 270Lys Lys Gln Lys Arg Gln Ala Glu Leu Leu Glu Lys Arg Leu Gln Glu275 280 285Ile Glu Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Arg Lys Ile Ile Glu Glu Asn290 295 300Ile Thr Ser Ala Ala Pro Ser Asn Asp Gln Asp Gly Glu Tyr Cys Pro
305 310 315 320Glu Val Lys Leu Lys Thr Thr Gly Leu Glu Glu Ala Ala Glu Ala Glu325 330 335Thr Ala Lys Asp Asn Gly Glu Ala Glu Asp Gln Glu Glu Lys Glu Asp340 345 350Ala Glu Lys Glu Asn Ile Glu Lys Asp Glu Asp Asp Val Asp Gln Glu355 360 365Leu Ala Asn Ile Asp Pro Thr Trp Ile Glu Ser Pro Lys Thr Asn Gly370 375 380His Ile Glu Asn Gly Pro Phe Ser Leu Glu Gln Gln Leu Asp Asp Glu385 390 395 400Asp Asp Asp Glu Glu Asp Cys Pro Asn Pro Glu Glu Tyr Asn Leu Asp405 410 415Glu Pro Asn Ala Glu Ser Asp Tyr Thr Tyr Ser Ser Ser Tyr Glu Gln420 425 430Phe Asn Gly Glu Leu Pro Asn Gly Arg His Lys Ile Pro Glu Ser Gln435 440 445Phe Pro Glu Phe Ser Thr Ser Leu Phe Ser Gly Ser Leu Glu Pro Val450 455 460Ala Cys Gly Ser Val Leu Ser Glu Gly Ser Pro Leu Thr Glu Gln Glu465 470 475 480Glu Ser Ser Pro Ser His Asp Arg Ser Arg Thr Val Ser Ala Ser Ser485 490 495Thr Gly Asp Leu Pro Lys Ala Lys Thr Arg Ala Ala Asp Leu Leu Val500 505 510Asn Pro Leu Asp Pro Arg Asn Arg Asp Lys Ile Arg Val Lys Ile Ala515 520 525Asp Leu Gly Asn Ala Cys Trp Val His Lys His Phe Thr Glu Asp Ile530 535 540
Gln Thr Arg Gln Tyr Arg Ser Ile Glu Val Leu Ile Gly Ala Gly Tyr545 550 555 560Ser Thr Pro Ala Asp Ile Trp Ser Thr Ala Cys Met Ala Phe Glu Leu565 570 575Ala Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Glu Pro His Ser Gly Glu Asp Tyr Ser580 585 590Arg Asp Glu Asp His Ile Ala His Ile Ile Glu Leu Leu Gly Ser Ile595 600 605Pro Arg His Phe Ala Leu Ser Gly Lys Tyr Ser Arg Glu Phe Phe Asn610 615 620Arg Arg Gly Glu Leu Arg His Ile Thr Lys Leu Lys Pro Trp Ser Leu625 630 635 640Phe Asp Val Leu Val Glu Lys Tyr Gly Trp Pro His Glu Asp Ala Ala645 650 655Gln Phe Thr Asp Phe Leu Ile Pro Met Leu Glu Met Val Pro Glu Lys660 665 670Arg Ala Ser Ala Gly Glu Cys Arg His Pro Trp Leu Asn Ser675 680 685<210>5<211>29<212>PRT<213>人工的<220>
<223>SRPK的底物肽<400>5Arg Ser Pro Ser Tyr Gly Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser1 5 10 15Arg Ser Arg Ser Arg Ser Asn Ser Arg Ser Arg Ser Tyr20 2权利要求
1.抗病毒剂，其含有控制SR蛋白质活性的SR活性控制剂作为有效成分。
2.权利要求1所述的抗病毒剂，其中SR蛋白质为SF2/ASF/SRp30a、SC35/PR264/SRp30b、SRp30c、HRS/SRp40、SRp46或SRp75的任意一种。
3.权利要求1或2所述的抗病毒剂，其中SR活性控制剂为促进SR蛋白质脱磷酸化的物质或组合物。
4.权利要求3所述的抗病毒剂，其是活化磷酸酶2A的活化剂。
5.权利要求4所述的抗病毒剂，其是载有HIV的tat基因、腺病毒的E4-ORF4基因或牛痘病毒的VH1基因的基因治疗用表达载体。
6.权利要求1或2所述的抗病毒剂，其中SR活性控制剂为抑制SRPK的物质。
7.权利要求6所述的抗病毒剂，其中SRPK为SRPK1或SRPK2，
8.权利要求1或2所述的抗病毒剂，其中，SR活性控制剂为SRPK基因的表达抑制剂。
9.权利要求8所述的抗病毒剂，其中SRPK基因的表达抑制剂为针对SRPK的miRNA、siRNA或吗林代低聚物、或该miRNA或siRMA的表达载体。
10.权利要求1或2所述的抗病毒剂，其中，SR活性控制剂为具有与SR蛋白质活性相反活性的物质。
11.权利要求10所述的抗病毒剂，其中具有与SR蛋白质活性相反活性的物质为hnRNPA1表达载体。
12.权利要求1～11任意一项所述的抗病毒剂，其中，病毒为(1)人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸道综合症(SARS)、脊髓灰质炎病毒、人类鼻病毒、成人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、甲型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒、牛痘病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒、人冠状病毒、Ebola出血热病毒、流感病毒、或辛德比斯病毒中的任意一种RNA病毒；或者(2)包括单纯疱疹病毒、人腺病毒的、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒、天花病毒、多瘤病毒、或人乳头瘤病毒中的任意一种DNA型病毒。
13.抗病毒剂的筛选方法，其包括使试验化合物作用于SRPK的步骤、检测SRPK磷酸化SR蛋白质能力的步骤以及筛选抑制该能力的化合物。
14.权利要求13所述的筛选方法，其包括将SR蛋白质，或者2个或2个以上连续的Arg-Ser(RS)或Ser-Arg(SR)的肽作为SRPK的基质，检测磷酸化SR蛋白质的能力的步骤。
15.抗病毒剂的制备方法，其包括将由权利要求13或14的方法得到的化合物制剂化的步骤。
16.下述通式(I)表示的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物， 式中，R1表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C2-6炔基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、硝基、氰基、叠氮基、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的C1-6烷基磺酰基、羧基、甲酰基、可以具有取代基的C1-6烷氧基羰基、酰基、酰基氨基、或氨磺酰基；R2表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或可以具有取代基的芳基；R3表示可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C2-6烯基、可以具有取代基的C6-10芳基、可以具有取代基的含氮杂环或可以具有取代基的稠合芳杂环；R4表示氢原子或卤原子；Q表示-C(O)-、-C(S)-、-SO2-、-C(S)NHC(O)-、-C(O)NHC(O)-或-C(O)NHC(S)-；W表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的C6-10芳基、卤原子、羟基、可以具有取代基的C1-6烷氧基、可以具有取代基的C1-6烷硫基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环或下述通式(II) 式中，R5和R6相同或不同，表示氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基、可以具有取代基的含氮杂环、可以具有取代基的稠合芳杂环、酰基或酰基氨基；而且上述R5和R6可以与相邻的氮原子连接形成可以具有取代基的杂环，该杂环也可以是可以具有取代基的稠合芳杂环；上述R5和R6也可以是可以具有取代基的环亚烷基氨基或可以具有取代基的芳环稠合环亚烷基。
17.权利要求16所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物，其中，上述R1为氢原子、可以具有取代基的C1-6烷基或卤原子。
18.权利要求16或17所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物，其中，上述R2为氢原子或C1-6烷基。
19.权利要求16～18任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物，其中，上述R3为可以具有取代基的C6-10芳基或可以具有取代基的5～10元含氮杂芳基。
20.权利要求16～19任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物，其中，上述R4为氢原子。
21.权利要求16～20任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物，其中，上述W为氢原子、卤原子或下述通式(II)， 式中，R5和R6相同或不同，表示可以具有取代基的C1-6烷基；而且上述R5和R6可以与相邻的氮原子连接，形成可以具有取代基的杂环基，该杂环基也可以是可以具有取代基的稠合芳杂环基。
22.SRPK抑制剂，其含有权利要求16～21任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物作为有效成分。
23.抗病毒剂，其含有权利要求16～21任意一项所述的苯胺衍生物、其可药用的盐或它们的水合物作为有效成分。
全文摘要
本发明提供(1)降低或抑制SR蛋白质的活性的抗病毒剂、更具体地(i)促进SR蛋白质的脱磷酸化的抗病毒剂、以及(ii)抑制磷酸化SR蛋白质的蛋白质的抗病毒剂；(2)抑制SR蛋白质表达的抗病毒剂；以及(3)活化具有与SR蛋白质相反功能的蛋白质的抗病毒剂。另外本发明提供抑制使SR蛋白质磷酸化的SRPK的化合物。这些化合物抑制SR蛋白质的活性，显示抗病毒作用。
文档编号H04M1/21GK1921885SQ20048004216
公开日2007年2月28日 申请日期2004年12月24日 优先权日2003年12月26日
发明者萩原正敏, 福原武志, 铃木正昭, 细谷孝充 申请人:萩原正敏