槲皮素及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及磷酸化蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及磷酸化蛋白质的一种新的 荧光染料。
【背景技术】
[0002] 蛋白质磷酸化是最常见也是最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。人体众多的氨 基酸中，磷酸化过程基本上发生在酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸等氨基酸残基上。蛋白质的这一 修饰变化，与细胞的增殖、分化、发育、凋亡等许多生命活动息息相关。因此，蛋白质的磷酸 化修饰在生命的各个活动中显得尤为重要，使得疾病状态下磷酸化蛋白表差异、修饰位点 等成为了蛋白质组学和生物化学领域研究和探讨的热点。
[0003] 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是一种稳定可靠的蛋白分离技术，目前仍被广泛使用于 蛋白质组学的研究。该技术通常与凝胶上蛋白质染色检测技术相结合，用于蛋白质组学研 究工作的开展。这两项技术的相结合通常也用于磷酸化蛋白质组学研究。
[0004] 现存的凝胶上磷酸化蛋白质检测方法有很多，包括Pro-Q Diamond检测技术、 GelCode?检测技术、Stains-All检测技术等。其中Pro-Q Diamond是目前特异性最强、应 用最广、操作较为简便、灵敏度较高的检测方法。
[0005] 本发明首次将槲皮素及其衍生物应用于磷酸化蛋白质荧光检测，相比于其他检测 技术，具有众多优点，在蛋白质组学研究中将具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种槲皮素及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应 用。
[0007] 本发明所述的槲皮素相关化合物是指以槲皮素为母核的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸 盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐等。
[0008] 槲皮素母核为：
[0010] 下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤：
[0011] 1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定10~60min，弃 固定液，然后用去离子水冲洗1~20min ;优选的固定时间为20min，去离子水冲洗时间为 5min (共2次），固定液可以是含有30%甲醇和10%乙酸的水溶液；
[0012] 2)加入荧光染色液染色1~120min，其中所述染色液为含按摩尔浓度比5~ 50 μ M的槲皮素，按摩尔浓度比5~100 μ M的铝离子，按溶液体积比10~30%的1，2-丙 二醇，以及按溶液体积比10~50%的甲醇；染色液中优选的槲皮素或其衍生物的浓度为 25μΜ，优选的铝离子浓度为50μΜ，优选的1，2_丙二醇浓度为20%，优选的甲醇浓度为 40%，优选的染色时间为60min ;
[0013] 3)将染色完毕的凝胶置于脱色液中脱色1~lOmin，其中所述脱色液为含按溶液 体积比10~50%的甲醇，按摩尔浓度比50~500mM乙酸钠，用乙酸将溶液pH调节至4~ 5 ;脱色液中优选的甲醇浓度为50%，优选的乙酸钠浓度为250mM，优选的pH为4. 5,优选的 脱色时间为3min ;
[0014] 4)检测，检测波长为250~370nm，优选为312nm。
[0015] 本发明方法具有如下优点：
[0016] 1)高灵敏度：荧光染料比普通染料的灵敏度要高很多倍；
[0017] 2)操作简单迅速：操作步骤少，可在90min内完成；
[0018] 3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；
[0019] 4)染色背景好；
[0020] 5)线性关系好：能在较大范围内对蛋白质进行半定量测定；
[0021] 6)可逆性好：容易脱色；
[0022] 7)兼容性好：可与MALDI-TOF等质谱仪器高度兼容；
[0023] 8)使用安全：采用毒性很低的天然荧光染料，提高实验操作的安全性，对环境污 染小；
[0024] 9)特异性强；
[0025] 10)成本低。
【附图说明】
[0026] 图1.槲皮素的化学结构；
[0027] 图2.槲皮素荧光染色法和其他常用染色法灵敏度和特异性的比较。其中（A)为槲 皮素染色法，（B)为 Pro-Q Diamond 染色法，（C)为 Stains-All 染色法，（D)为 SYPRO-Ruby 染法。磷酸化蛋白质为商品化标准品，从上至下分别为转铁蛋白（transferrin)，牛血清白 蛋白（bovine serum albumin)，卵白蛋白（OVA)，卵黄高憐脂蛋白（phosvitin)，α-酿蛋白 (α-casein), β-酿蛋白（β-casein)。蛋白质载样量（每条带）如下：带l，2000ng;带 2, 1000 ng ;带 3, 500ng ;带 4, 250ng ;带 5,125ng ;带 6,62. 5ng ;带 7, 31ng ;带 8,16ng ;带 9， 8ng ;带 10,4ng。
[0028] 图3.槲皮素荧光染色法实用性考察。其中（A)为槲皮素染色法，（B)为Pro-Q Diamond染色法。实验选用小鼠大脑总蛋白作为生物实际样品，对倍稀释后上样电泳。
[0029] 图4.槲皮素荧光染色检测法与二维凝胶电泳技术的兼容性考察。其中（A)为槲 皮素染色法，（B)为Pro-Q Diamond染色法。实验选用小鼠大脑总蛋白作为生物实际样品， 800 μ g上样。
【具体实施方式】：
[0030] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明 本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0031] 实施例1槲皮素染色
[0032] 槲皮素磷酸化蛋白质荧光染色实验采用下述步骤进行：
[0033] (1)固定：将电泳结束后的凝胶放置于50mL30%甲醇/10%乙酸的固定液中固定 20分钟（平缓振摇）；
[0034] (2)水洗：将凝胶放置于50mL去离子水中平缓振摇，洗涤2次，每次5分钟；
[0035] (3)染色：将水洗之后的凝胶放置于50mL25yM槲皮素（母液用二甲基亚砜溶 解），5(^獻1 3+，20%1，2-丙二醇，40%甲醇的染色液中染色60分钟；
[0036] (4)脱色：将染色完毕的凝胶放置于50mL50%甲醇，pH4. 5250mM乙酸钠-乙酸脱 色液中脱色3分钟。
[0037] (5)被染色的凝胶直接放在透射仪上，312nm处透射，记录影像。
[0038] 按照上述方法分别用槲皮素的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣 酸盐、氢碘酸盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能得到类似于槲皮素的检测结 果。SDS-PAGE参照《分子克隆实验指南》第三版相关部分进行。
[0039] 实验例1槲皮素与其他染料染色效果对比
[0040] 采用不同染料进行染色，（A)为槲皮素染色法，（B)为Pro-Q Diamond染色法，（C) 为Stains-All染色，（D)为SYPRO-Ruby染色。蛋白质载样量（每条带）如下：带l，2000ng; 带 2, 1000 ng ;带 3,500ng ;带 4,250ng ;带 5,125ng ;带 6,62. 5ng ;带 7,31ng ;带 8,16ng ;带 9,8ng ;带10,4ng。结果如图2所示，槲皮素染色法灵敏度比Stains-A