专利名称：一种富集棉花磷酸化蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种富集棉花磷酸化蛋白质的方法，属于生物技术领域，涉及棉花磷 酸化蛋白质的分离富集。
背景技术：
蛋白质的分离纯化分析是近 年来生物分离分析领域的研究热点，蛋白质的翻译后 修饰是影响蛋白质结构和功能的重要因素，在生物化学途径的调控中起着重要的作用，而 其中蛋白质磷酸化是最常见也是最重要的一种翻译后修饰方式，是蛋白质组学研究的热点 和难点。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节者生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育 和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化-脱磷酸化是细胞内的 主要信号转导方式。磷酸化蛋白质在细胞生命活动中的重要作用，使其成为蛋白质组学和分子生物学 研究的热点。但是由于磷酸化蛋白自身的一些特点，使得磷酸化蛋白质分析仍是一件很具 挑战性的工作。首先，绝大多数磷酸化蛋白质在细胞中的丰度都很低；其次，磷酸化的可变 性，使得在不同条件下蛋白存在不同的磷酸化形式；再次，现有的分析方法缺乏对磷酸化位 点的动态分析，使得部分位点难以鉴定。最后，磷酸酶的存在使得在样品制备过程产生脱磷 酸化现象。因此对磷酸化蛋白或者磷酸化肽段进行富集，提高磷酸蛋白的相对含量，成为磷 酸化蛋白质组研究的重要技术环节。本发明主要是利用金属氧化物/氢氧化物亲和层析法(MOAC)来富集棉花磷酸 化蛋白质。金属氧化物/氢氧化物亲和层析主要利用的是一些金属氧化物/氢氧化物可 以选择性的吸附水溶性的磷酸化合物。目前使用的金属氧化物主要有三种Ti02、ZrO2和 Al(OH)30 TiO2富集法是目前最为成熟的金属氧化物富集法。但是利用TiO2层析柱对磷 酸化蛋白进行富集，会发生富含酸性氨基酸的磷酸化蛋白的非特异富集现象。而以此技术 为基础的磷酸化蛋白质富集层析柱试剂盒(Qiagen)不仅价格昂贵，而且用于植物磷酸化 蛋白质富集时，富集效率极低，以棉花为例，每2. 5mg总蛋白只能富集5 μ g磷酸化蛋白质 (2 μ g/mg)，远远不能满足实验的需要。2005年，Wolschin报道了以Al (OH)3作为基质对磷 酸蛋白质和磷酸肽进行富集的研究(Wolschin F, Wienkoop S, Weckwerth W. Enrichment of phosphorylated proteins and peptides from complex mixtures using metal oxide/ hydroxide affinity chromatography (MOAC)[J]. Proteomics,2005, 5(17) :4389_4397.)， 但是用该方法来富集棉花磷酸化蛋白质时，富集效率也很低(5 μ g/mg)，对于取样比较难的 珍贵样品难以富集足量的磷酸化蛋白质用于进一步研究。本发明就是以Al (OH) 3作为基 质，在优化各种技术参数之后，利用金属氧化物/氢氧化物亲和层析法(MOAC)来富集棉花 磷酸化蛋白质，建立了一种富集效率较高、特异性较强、经济实用、可以大规模富集棉花磷 酸化蛋白质的方法。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种利用Al (OH)3亲和层析法(MOAC)富集棉花磷酸化蛋白质的方法，完成磷酸化蛋白质从复杂的生物样品的高效率、高选择性地分离富集，提高棉 花磷酸化蛋白质的相对含量，利于磷酸化蛋白质的质谱技术分析，对于棉花的磷酸化蛋白 质组学研究、分子生物学研究具有重要的意义。为实现上述目的。技术方案一种富集棉花磷酸化蛋白质的方法，其特征在于1棉花总蛋白的提取取Ig新鲜的棉花胚珠或叶片，加入等量的交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP和等量的石英 砂，在液氮中研磨至粉末，加入IOmL含体积百分比的β-巯基乙醇的冰丙酮，充分颠倒混 勻50次；10, OOOg离心20min后，沉淀加入2mL提取缓冲液，6mL pH为8. 0的Tris饱和酚， 混勻，4°C静置30min ；4°C，10，OOOg离心lOmin，收集酚相，加入5倍体积的冰丙酮，_20°C过夜 后，15，OOOg离心lOmin，沉淀悬浮于5mL冷甲醇，冷甲醇洗涤两次，再用5mL体积百分比浓度 为80%的冰丙酮洗涤一次，4°C真空干燥，得到总蛋白，-70°C密封保存备用。2利用Al (OH)3亲和层析法MOAC富集棉花磷酸化蛋白质(1)取7mg总蛋白溶解于12mL孵育缓冲液IB，10°C孵育过夜；(2)超声波破碎处理，促进蛋白质溶解功率100W，3s脉冲激发，共破碎3min ；(3) 12，OOOg离心6min，上清液即为总蛋白质的水溶液，保存于冰水中；(4)基质的平衡称取1400mg Al (OH) 3，加入7mL IB,涡旋5次，每次2min，常温孵 育30min，5，OOOg离心5min，弃上清，沉淀再重复平衡两次；(5)将总蛋白的水溶液加入经过IB平衡的Al (OH) 3基质中，10°C涡旋60min，使磷 酸化蛋白质充分吸附到基质中；(6) 12，OOOg离心6min，去上清，基质用IOmL IB洗涤3次，然后再用IOmL洗涤缓 冲液WB洗涤1次；(7)最后用20mL洗脱液EB，分两次，每次IOmL洗涤基质，将结合到基质上的磷酸 化蛋白质洗脱下来，收集洗出液，合并两次洗脱的洗出液；(8)向洗出液中加入0. 01倍体积的质量体积百分比2%脱氧胆酸钠D0C，涡旋 lmin，再加入0. 1倍体积的质量体积比100% TCA，混勻后放于冰上lh，沉淀磷酸化蛋白质；(9) 14，OOOg离心lOmin，沉淀用质量体积比25 0Z0 TCA洗涤一次，离心后，沉淀悬 浮于5mL含有10mmol/L pH7. 5Tris_HCl的体积百分比80%冰丙酮中，涡旋，14，OOOg离心 IOmin ；(10)用5mL冰丙酮洗涤沉淀，15，OOOg离心15min，沉淀真空干燥，即得到纯化的磷 酸化蛋白质干粉，-70°C密封保存。有益效果本发明是一种利用Al (OH)3亲和层析(MOAC)富集棉花磷酸化蛋白质的方法，以 Al (OH)3作为富集基质，其主要优点是与TiO2和&02相比，Al (OH)3价格便宜，并能从复杂 的生物样品中高效率(12 μ g/mg)、高选择性地分离富集磷酸化蛋白质。现有的商品化试剂盒富集棉花磷酸化蛋白质效率过低每毫克蛋白质只能回收2微克磷酸化蛋白质，按照双 向电泳最低上样量200微克计算，需要IOOmg总蛋白，十个Qiagen亲和层析预装柱，价值约 6000元。不仅价格昂贵，而且需要大量的总蛋白，对于难以获得大量总蛋白质的样品(如 幼小胚珠、纤维等)几乎不可能实际应用。同样200yg磷酸化蛋白质，采用本方法，只需要 不到IOmg总蛋白，实验成本不到500元。因此该方法可以用于大规模富集棉花磷酸化蛋白 质，基本满足从珍贵样品中富集足量的磷酸化蛋白质，用于双向电泳、抗体制备等研究的需 要。 四
图1利用苯酚法和TCA+苯酚法提取的棉花总蛋白的SDS-PAGE电泳图。优化后的
苯酚法蛋白质提取得率提高一倍。图2利用改进前的苯酚法和TCA+苯酚法提取的棉花胚珠总蛋白富集的磷酸化蛋 白质的双向电泳结果。左图为由苯酚法提取的总蛋白富集的磷酸化蛋白质，右图为由TCA+ 苯酚法提取的总蛋白富集的磷酸化蛋白质的双向电泳图。图3利用苯酚法和改良的苯酚法提取的棉花胚珠总蛋白富集的磷酸化蛋白质的 双向电泳结果。左图为由苯酚法提取的总蛋白富集的磷酸化蛋白质，右图为由改良的苯酚 法提取的总蛋白富集的磷酸化蛋白质的双向电泳图。改良苯酚法提取的蛋白质中富集的磷 酸化蛋白质点比未改良的苯酚法多出89士 17个，而且前者的蛋白质点更清晰。图4通过MOAC法富集到的磷酸化蛋白质及第一、二、三、四次洗涤出的非磷酸化蛋 白质的SDS-PAGE电泳图。表明三次洗涤基本完全去除了非特异性结合的非磷酸化蛋白质。图5利用改良的苯酚法提取的棉花总蛋白的双向电泳图。蛋白质点多，轮廓清晰。图6利用Al (OH) 3亲和层析法富集的棉花磷酸化蛋白质的双向电泳图，蛋白质点 集中在酸性范围。图7利用Al (OH)3亲和层析法(MOAC)洗涤出的棉花非磷酸化蛋白质的双向电泳图。
五具体实施例方式(一 )最佳棉花总蛋白提取方法的确定1、首先，分别利用苯酚法和TCA+苯酚法提取棉花总蛋白。本发明分别以棉花胚珠或叶片为实验材料进行棉花总蛋白的提取，先后摸索了两 种提取总蛋白的方法——苯酚法和TCA+苯酚法。(1)苯酚法lg棉花胚珠或叶片加入等量的PVPP和石英砂在液氮研中磨至粉末， 加入5mL提取缓冲液，15mL pH8. OTris-HCl饱和酚，涡旋10min，4°C下静置30min。4°C, 10，OOOg离心lOmin。收集酚相，加入5倍体积的冰丙酮，_20°C过夜后，15，OOOg离心15min， 沉淀悬浮于冷甲醇，洗涤两次，4°C真空干燥，得到总蛋白，-70°C密封保存备用。TCA+苯酚法Ig棉花胚珠或叶片加入等量的PVPP和石英砂在液氮中研磨至粉末， 加入IOmL冰丙酮，混勻。4°C，5，OOOg离心lOmin。沉淀悬浮于5mL含质量体积百分比10% TCA的丙酮，5，OOOg离心lOmin，沉淀悬浮于5mL含质量体积百分比20% TCA的丙酮溶液， 5，OOOg离心lOmin，沉淀用体积百分比80%冰丙酮洗涤一次。5，OOOg离心lOmin，沉淀悬浮于8mL提取缓冲液和8mL ρΗ8· OTris-HCl饱和酚，充分涡旋5次，每次2min, 10，OOOg离心 IOmin0收集酚相，加入5倍体积的IOOmol/L NH4AC的甲醇溶液，_20°C过夜后，12，OOOg离 心15min。沉淀用冰甲醇洗涤一次，10，OOOg离心10min，80%冰丙酮洗涤一次，4°C真空干 燥，得到总蛋白，-70°C密封保存备用。将两种方法所得棉花总蛋白进行SDS-PAGE电泳和双向电泳。实验结果显示，利用 TCA+酚法提取到的总蛋白杂质较少，颜色为纯白色，双向电泳图片清晰品质较好(图2)。但 是，蛋白获得率只有苯酚法的50% (图1)，即5mg蛋白质/g棉花胚珠。2、为了进一步提高棉花胚珠或叶片总蛋白的提取获得率，将提取总蛋白的苯酚法 进一步优化改进。优化的苯酚法步骤如下lg棉花胚珠或叶片用液氮研磨至粉末(加等量的PVPP 和石英砂)，加入IOmL含1 %体积百分比β -巯基乙醇的冰丙酮，充分颠倒50次混勻。 10，OOOg离心20min后，沉淀加入2mL提取缓冲液，6mLpH8. OTris饱和酚，充分混勻(涡旋 5次，每次2min)，4°C静置30min后，4°C，10，OOOg离心IOmin,收集酚相，加入5倍体积的冰 丙酮，-20°C过夜后，15，OOOg离心lOmin，沉淀悬浮于冷甲醇，洗涤两次，再用体积百分比浓 度为80%的冰丙酮洗涤一次，4°C真空干燥，得到总蛋白，_70°C密封保存备用。与普通的苯酚法相比，改良的苯酚法提取的棉花胚珠总蛋白获得率达到10mg/g 鲜重胚珠，与改进前相当。从中富集的磷酸化蛋白质的双向电泳图中的竖纹明显较改进前 明显减少(图3右)，说明改良后的苯酚法将脂类等杂质洗涤的更干净，蛋白点数也较多 (平均多出89士 17)。改良的苯酚法不仅提高了总蛋白获得率，还提高了蛋白质的纯度。所 以，本发明使用改良的苯酚法进行棉花组织中的总蛋白的提取。(二)最优化的利用Al (OH)3亲和层析法(MOAC)富集棉花磷酸化蛋白质方法的确
定1、根据有关文献，将拟南芥叶片、种子所用的Al (OH)3亲和层析法富集磷酸化蛋白 质的方法直接应用于棉花胚珠和叶片磷酸化蛋白质的富集，步骤如下(l)7mg总蛋白(分别来自叶片、胚珠)溶于1. SmL孵育缓冲液中，剧烈振荡5min， 20，00(^离心301^11，取上清。孵育缓冲液为30mmol/L MES，200mol/L谷氨酸钠，200mmol/ L 天冬氨酸钾，2(kimol/L 咪唑，0. 25% CHAPS,8mol/L 尿素。(2)取 80mgAl (OH) 3 用 1. 8mL 孵育缓冲液平衡 2 次，10，OOOrpm 离心 2min。(3)从溶解的蛋白溶液中取出Img加入到已平衡的80mgAl (OH) 3中，4 °C涡旋 30mino(4)用1. SmL孵育缓冲液洗涤基质，重复5次。(5)洗脱用800 μ L洗脱缓冲液洗涤基质，室温静置30min，10，OOOrpm离心2min，
收集上清。(6)上清液用甲醇/氯仿沉淀，得到磷酸化蛋白质。实验结果很不理想，得到的磷酸化蛋白质极少(0. 1 μ g/mg)。很难达到实验要求。 于是对此方法进行了改进和优化。2、最终确定优化后的Al (OH)3亲和层析法(MOAC)富集磷酸化蛋白质的步骤如下(1)取7mg总蛋白溶解于12mL孵育缓冲液IB，10°C孵育过夜；(2)超声波破碎处理，促进蛋白质溶解功率100W，3s脉冲激发，共破碎3min ；
(3) 12，OOOg离心6min，上清液即为总蛋白质的水溶液，保存于冰水中；(4)基质的平衡称取1400mg Al (OH) 3，加入7mL IB,涡旋5次，每次2min，常温孵 育30min，5，OOOg离心5min，弃上清，沉淀再重复平衡两次；(5)将总蛋白的水溶液加入经过IB平衡的Al (OH) 3基质中，10°C涡旋60min，使磷 酸化蛋白质充分吸附到基质中；(6) 12，OOOg离心6min，去上清，基质用IOmL IB洗涤3次，然后再用IOmL洗涤缓 冲液WB洗涤1次；(7)最后用20mL洗脱液EB，分两次，每次IOmL洗涤基质，将结合到基质上的磷酸 化蛋白质洗脱下来，收集洗出液，合并两次洗脱的洗出液；(8)向洗出液中加入0. 01倍体积的质量体积百分比2%脱氧胆酸钠D0C，涡旋 lmin，再加入0. 1倍体积的质量体积比100% TCA，混勻后放于冰上lh，沉淀磷酸化蛋白质；(9) 14，OOOg离心lOmin，沉淀用质量体积比25% TCA洗涤一次，离心后，沉淀悬 浮于5mL含有IOmmol/L pH7. 5Tris_HCl的体积百分比80%冰丙酮中，涡旋，14，OOOg离心 IOmin ；(10)用5mL冰丙酮洗涤沉淀，15，OOOg离心15min，沉淀真空干燥，即得到纯化的磷 酸化蛋白质干粉，-70°C密封保存。优化后的富集方法效果明显改善。首先，通过同步增大基质和总蛋白的量，提高了 磷酸化蛋白质的获得量；其次，采用多次反复吸附和洗涤，孵育液中只使用两性去污剂，不 使用SDS等离子型去污剂；其三，增加超声波处理助溶步骤，提高了蛋白的溶解，但是不会 导致磷酸化蛋白质的降解和脱磷酸。最后，通过实验发现(图4)，用IB洗涤两次，WB洗涤 一次，就能将非磷酸化蛋白质洗涤干净，确保最后洗出的为磷酸化蛋白质。(三)实施例用改良的苯酚法提取棉花胚珠总蛋白，利用Al (OH)3亲和层析法(MOAC)富集棉花 磷酸化蛋白质，然后进行双向电泳检测。1、改良的苯酚法提取棉花胚珠总蛋白取Ig新鲜的棉花胚珠，加入等量的交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP和等量的石英砂，在 液氮中研磨至粉末，加入IOmL含体积百分比的β-巯基乙醇的冰丙酮，充分颠倒混勻 50次；10，OOOg离心20min后，沉淀加入2mL提取缓冲液，6mL pH为8. O的Tris饱和酚，混 勻，4°C静置30min ；4°C，10，OOOg离心lOmin，收集酚相，加入5倍体积的冰丙酮，_20°C过夜 后，15，OOOg离心lOmin，沉淀悬浮于5mL冷甲醇，冷甲醇洗涤两次，再用5mL体积百分比浓 度为80%的冰丙酮洗涤一次，4°C真空干燥，得到总蛋白，-70°C密封保存备用。2利用Al (OH)3亲和层析法(MOAC)富集棉花胚珠磷酸化蛋白质(1)取7mg总蛋白溶解于12mL孵育缓冲液IB，10°C孵育过夜；(2)超声波破碎处理，促进蛋白质溶解功率100W，3s脉冲激发，共破碎3min ；(3) 12，OOOg离心6min，上清液即为总蛋白质的水溶液，保存于冰水中；(4)基质的平衡称取1400mg Al (OH) 3，加入7mL IB,涡旋5次，每次2min，常温孵 育30min，5，OOOg离心5min，弃上清，沉淀再重复平衡两次；(5)将总蛋白的水溶液加入经过IB平衡的Al (OH) 3基质中，10°C涡旋60min，使磷 酸化蛋白质充分吸附到基质中；
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(6) 12，OOOg离心6min，去上清，基质用IOmL IB洗涤3次，然后再用IOmL洗涤缓 冲液WB洗涤1次；(7)最后用20mL洗脱液EB，分两次，每次IOmL洗涤基质，将结合到基质上的磷酸 化蛋白质洗脱下来，收集洗出液，合并两次洗脱的洗出液；(8)向洗出液中加入0. 01倍体积的质量体积百分比2%脱氧胆酸钠D0C，涡旋 lmin，再加入0. 1倍体积的质量体积比100% TCA，混勻后放于冰上lh，沉淀磷酸化蛋白质；(9) 14，OOOg离心lOmin，沉淀用质量体积比25% TCA洗涤一次，离心后，沉淀悬 浮于5mL含有IOmmol/L pH7. 5Tris_HCl的体积百分比80%冰丙酮中，涡旋，14，OOOg离心 IOmin ；(10)用5mL冰丙酮洗涤沉淀，15，OOOg离心15min，沉淀真空干燥，即得到纯化的磷 酸化蛋白质干粉，-70°C密封保存。结果显示(1)优化的苯酚蛋白质提取方法，获得的蛋白质的量与普通苯酚法相当，是TCA+ 苯酚法的2倍左右(不同组织有所区别)，达到10mg/g鲜重胚珠。优化后的苯酚法和TCA+ 苯酚法提取的棉花胚珠总蛋白的双向电泳图谱质量相当在PH3-10的双向电泳图谱上， 蛋白质点数均达到1200个左右，蛋白质分离效果良好，没有或者极少有条纹。优于改良前 的苯酚法。从三种方法提取棉花胚珠总蛋白中富集的磷酸化蛋白质的效率基本一致，都在 12ug/mg总蛋白质左右，而对于双向电泳图谱，改进后的苯酚法提取的总蛋白质中富集的 磷酸化蛋白质，蛋白质点更清晰，数目较改进前平均增加89个(图2、图3)。说明本发明 优化后的蛋白质提取方法在保持高比例的蛋白质产率的同时，磷酸化蛋白质的比例没有下 降，而且提高了磷酸化蛋白质的纯度。(2)用优化的MOAC法富集到的磷酸化蛋白质与未吸附的非磷酸化的ID蛋白质电 泳条带(图4)和2-DE图谱(图6、图7)有明显区别，磷酸化蛋白质主要为酸性蛋白。三次 洗涤可以完全洗去非磷酸化蛋白质。
权利要求
一种富集棉花磷酸化蛋白质的方法，其特征在于1)溶液配制(1)0.5mol/L pH7.54 羟乙基哌嗪乙磺酸Hepes缓冲液0.5mol Hepes溶解于800mL双蒸水，NaOH调节pH到7.5，定容到1L；(2)0.5mol/L pH6.12 N 吗啉乙磺酸MES缓冲液0.5mol MES溶解于800mL双蒸水，NaOH调节pH到6.1，定容到1L；(3)提取缓冲液含50mmol/L pH为7.5Hepes缓冲液，质量体积百分比40％蔗糖，60mmol/L氟化钠NaF，体积百分比浓度为2％的β 巯基乙醇，1mmol/L苯甲基磺酰氟PMSF，质量体积比2％聚乙烯吡咯烷酮PVP，质量体积百分比浓度为2％的十二烷基磺酸钠SDS。混合、双蒸水溶解、定容；(4)孵育缓冲液IB含30mmol/L pH6.1的MES缓冲液，100mmol/L谷氨酸钠，100mmol/L天冬氨酸钾，质量体积百分比0.25％3 [(3 胆酰胺丙基) 二乙胺] 丙磺酸CHAPS和8mol/L尿素。混合、双蒸水溶解、定容；(5)洗涤缓冲液WB为含30mmol/L pH6.1的MES缓冲液，150mmol/L谷氨酸钠，150mmol/L天冬氨酸钾，质量体积百分比0.25％CHAPS和8mol/L尿素。混合、双蒸水溶解、定容；(6)洗脱液EB为200mmol/L焦磷酸钾，8mol/L尿素，调节溶液pH到9.0；(7)质量体积百分比浓度为100％三氯乙酸TCA直接向500g TCA中加入237mL双蒸水，溶解后即为100％TCA。2)棉花总蛋白的提取取1g新鲜的棉花胚珠或叶片，加入等量的交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP和等量的石英砂，在液氮中研磨至粉末，加入10mL含体积百分比1％的β 巯基乙醇的冰丙酮，充分颠倒混匀50次；10,000g离心20min后，沉淀加入2mL提取缓冲液，6mL pH为8.0的Tris饱和酚，混匀，4℃静置30min；4℃，10,000g离心10min，收集酚相，加入5倍体积的冰丙酮， 20℃过夜后，15,000g离心10min，沉淀悬浮于5mL冷甲醇，冷甲醇洗涤两次，再用5mL体积百分比浓度为80％的冰丙酮洗涤一次，4℃真空干燥，得到总蛋白， 70℃密封保存备用。3)利用Al(OH)3亲和层析法MOAC富集棉花磷酸化蛋白质(1)取7mg总蛋白溶解于12mL孵育缓冲液IB，10℃孵育过夜；(2)超声波破碎处理，促进蛋白质溶解功率100W，3s脉冲激发，共破碎3min；(3)12,000g离心6min，上清液即为总蛋白质的水溶液，保存于冰水中；(4)基质的平衡称取1400mg Al(OH)3，加入7mL IB，涡旋5次，每次2min，常温孵育30min，5,000g离心5min，弃上清，沉淀再重复平衡两次；(5)将总蛋白的水溶液加入经过IB平衡的Al(OH)3基质中，10℃涡旋60min，使磷酸化蛋白质充分吸附到基质中；(6)12,000g离心6min，去上清，基质用10mL IB洗涤3次，然后再用10mL洗涤缓冲液WB洗涤1次；(7)最后用20mL洗脱液EB，分两次，每次10mL洗涤基质，将结合到基质上的磷酸化蛋白质洗脱下来，收集洗出液，合并两次洗脱的洗出液；(8)向洗出液中加入0.01倍体积的质量体积百分比2％脱氧胆酸钠DOC，涡旋1min，再加入0.1倍体积的质量体积比100％TCA，混匀后放于冰上1h，沉淀磷酸化蛋白质；(9)14,000g离心10min，沉淀用质量体积比25％TCA洗涤一次，离心后，沉淀悬浮于5mL含有10mmol/L pH7.5Tris HCl的体积百分比80％冰丙酮中，涡旋，14,000g离心10min；(10)用5mL冰丙酮洗涤沉淀，15,000g离心15min，沉淀真空干燥，即得到纯化的磷酸化蛋白质干粉， 70℃密封保存。
全文摘要
本发明涉及一种富集棉花组织中磷酸化蛋白质的方法，属于生物技术领域。包括棉花总蛋白的提取和利用Al(OH)3亲和层析法(MOAC)富集棉花磷酸化蛋白质。本发明从1mg棉花总蛋白质中富集得到12μg磷酸化蛋白质，富集效率是进口Qiagen试剂盒富集的6倍以上。用这种方法富集的磷酸化蛋白质经双向电泳和磷酸化蛋白质特异性染料ProQ diamondTM(Invitrogen)染色检验，未发现非磷酸化蛋白质混杂。该方法可以取代昂贵的进口试剂盒，高效、专一富集磷酸化蛋白质，广泛应用于磷酸化蛋白质组学、细胞信号等研究。
文档编号C07K1/22GK101967181SQ20101029032
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者刘康, 郝佩佩 申请人:南京农业大学