专利名称：降低血磷水平的人fgf23蛋白质突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及降低血磷水平的FGF23蛋白质突变体及这些突变体的用途。
背景技术：
FGF23是一种由Ito等在Kyoto大学克隆的基因，其在脑中表达已被确认(Yamashita T.et al.(2000)Biochem.Biophy.Res.Commun.277494-498；WO01/66596)。进一步地，Luethy等已克隆FGF23基因以生产可表达此基因的转基因小鼠并分析该小鼠的表型(WO01/61007)另外，基于对患有佝偻病(一种先天性低磷酸盐血症)的病人的基因谱分析，报道此病是由于FGF23的突变(R176Q，R179Q，R179W)造成(The ADHRConsortium(2000)Nat.Genet 26345-348)。
然而，此报道既未提及获得了蛋白质或全长cDNA，也未提及前述观察到的FGF23基因突变与低磷酸盐血症之间的因果联系。
发明内容
本发明是鉴于前述观察资料完成的。本发明的目的特别包括了提供降低血磷水平的FGF23蛋白质突变体，编码这些突变体的DNA和这些突变体及DNA的用途。
本发明者为达到前述目的进行了广泛的研究，目的在于获得希望降低血磷水平的FGF23蛋白质的突变体。首先分离人FGF23基因的全长cDNA，然后用PCR技术合成编码突变体的DNA并克隆入表达载体。经由静脉内给药将此表达载体导入小鼠以在其体内表达此突变体，其后检测小鼠的血磷水平。结果表明由于FGF23突变体的表达，小鼠的血磷水平显著降低。
特别是，除成功制备出FGF23蛋白质突变体外，本发明者还用这些突变体成功降低了小鼠的血磷水平，最后达到了本发明的目的。因为本发明的FGF23蛋白质突变体能如前述降低血磷水平，所以人们十分希望它们可用做治疗高磷酸盐血症的药物。
本发明涉及降低血磷水平的FGF23蛋白质的突变体，编码这些突变体的DNA和这些突变体及DNA的用途。更为具体地，本发明提供了(1)一种DNA，编码含有氨基酸序列为SEQ ID NO2的蛋白质，此氨基酸序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
(2)一种编码包含蛋白质的至少1到190位氨基酸序列的片段的DNA，该蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，该序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
(3)一种载体，其中插入了根据权利要求1或2的DNA。
(4)一种转化细胞，其包含根据权利要求1或2的DNA或根据权利要求3的载体。
(5)一种含有氨基酸序列为SEQ ID NO2的蛋白质，该序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
(6)一种含有蛋白质至少其位置1到190的氨基酸序列的片段，该蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，该序列包含选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
(7)一种制备根据权利要求5或6的蛋白质的方法，其包括培养根据权利要求4的转化细胞的步骤和从此转化细胞或其培养上清收集表达蛋白质的步骤。
(8)一种降低血磷水平的药物组合物，其包含根据权利要求1或2的DNA，根据权利要求3的载体或根据权利要求5或6的蛋白质。
(9)权利要求8的药物组合物，其不影响血钙水平。
(10)权利要求8或9的药物组合物，用于治疗高磷酸盐血症。
(11)一种治疗高磷酸盐血症的方法，包括向患者给药根据权利要求1或2的DNA的步骤。
本发明提供编码降低血磷水平的FGF23蛋白质突变体的DNA。本发明DNA所编码的这些突变体包含SEQ ID NO2的人FGF23蛋白质氨基酸序列上位置176上的精氨酸为谷氨酰胺取代的突变体，位置179上的精氨酸为谷氨酰胺取代的突变体和位置179上的精氨酸为色氨酸取代的突变体(在下文中，这些突变体分别被称为“R176Q突变体”，“R179Q突变体”和“R179W突变体”，并且它们所有都被称为“FGF突变体”)。在这些突变体中，R176Q突变体和R179Q突变体是优选的，并且R179Q突变体是最优选的。
本发明也提供了这些FGF突变体的片段。优选片段至少含有从FGF突变体位置1到190的氨基酸序列。
本发明的这些FGF23突变体能够降低血磷水平。因此，人们希望能用这些FGF23突变体对由于血液中磷水平高而引起的疾病起到治疗和预防的效果。根据本发明的优选实施方案，FGF23突变体不会影响血钙水平。
人们期待能够对此发挥治疗和预防效果的疾病实例是高磷酸盐血症。高磷酸盐血症通常由于肾脏分泌的PO4降低而发生。进行性(advanced)肾衰(肾小球滤过率(GFR)低于20mL/min)会造成足以导致血浆PO4升高的分泌降低。即使没有肾衰的病因，假性甲状旁腺功能衰退或甲状旁腺功能衰退也可能会引发肾脏PO4分泌紊乱。由于口服用药PO4过量或有时含磷酸盐的灌肠剂的应用过量同样会造成高磷酸盐血症。而且，高磷酸盐血症会作为细胞内PO4迁移到细胞外的结果出现。此种迁移常在糖尿病酮症酸中毒(不考虑全身PO4丢失)，瘀伤，无创伤性横纹肌溶解，全身感染和肿瘤溶解综合症中出现。并且，高磷酸盐血症在继发性甲状旁腺功能衰退的发作和长时间接受透析治疗的病人其肾性骨营养不良的发作中起到重要作用。
本发明的DNA用于体内和体外制备本发明下面所描述的突变体。另外，它们可用于基因治疗由于血磷水平高引起的疾病。本发明的DNA可呈现任何形式，只要它们编码本发明的突变体。例如，DNA可为由mRNA合成的cDNA，为基因组DNA或经由化学合成。而且，基于遗传密码简并性而具有主观核苷酸序列的DNA包含在本发明的DNA中，只要它们编码出此发明的突变体。
本发明的DNA可通过修饰人FGF23 cDNA而制成。此种人FGF23cDNA可以用业内人士已知的方法来制备。例如，其可通过从表达FGF23的细胞制备cDNA文库再用FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1))的部分作为探针进行杂交。例如，cDNA文库可用文献(Sambrook，J.et al.，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))描述的方法制备，或应用商品化的DNA文库。进一步，文库可如下制备(1)从表达FGF23的细胞制备RNA；(2)用逆转录酶合成cDNA(3)合成一段基于FGF23 cDNA序列(SEQ ID NO1)的寡DNA；并且(4)用此寡DNA作为引物进行PCR以扩增编码本发明多肽的cDNA。
更为具体地，mRNA可以首先从表达FGF23的细胞，组织或器官中分离，已知方法可用于分离mRNA。例如，总RNA可用胍超速离心(ChirgwinJ.M.et al.，Biochemistry 185294-5299(1979))或用AGPC法(Comczynski P.和Sacchi n.，Anal.Biochem.162156-159(1987)制备，mRNA则可用一种mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)纯化自总RNA，等等。或者，mRNA可以直接用一种QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)来制备。
得到的mRNA可用逆转录酶来合成cDNA。cDNA可用一种试剂盒如AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)来合成。或者cDNA可按照5’-RACE法(Frohman M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.858998-9002(1988)；Belyavsky A.et al.，Nucleic Acids Res.172919-2932(1989))来合成并扩增，其所用引物是基于SEQ ID NO1，5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和聚合酶链式反应(PCR)中描述的序列来制备的。
所要的DNA片段是由PCR产物制备并连接到载体DNA上。重组载体用于转化大肠杆菌等。而且想要的重组载体是从选择的菌落来制备的。此所要的DNA的核苷酸序列可用传统方法来验证，如双脱氧核苷酸链终止法。
具体地，可以获得人FGF23 cDNA，例如，用如下例1介绍的方法。
用于制备本发明FGF23突变体时对人FGF23 cDNA所做的修饰可以用业内人士通常使用的DNA诱变方法来进行。例如，所述修饰可用如下例2中的方法。
本发明也提供由本发明前述DNA编码的突变体。本发明的这些突变体可能在它们的氨基酸，分子量，等电点，或糖链的存在或形式上有所不同，此不同依赖于生产突变体的细胞或宿主，或如下所述制备方法的不同。然而，只要得到的突变体能降低血磷水平，它们都包括在本发明中。例如，当本发明的突变体在一种原核细胞如大肠杆菌中表达时，原来突变体的氨基酸序列N末端就会被添加上一个蛋氨酸残基。此种突变体也被包括在本发明中。
本发明的突变体可用业内人士已知的方法制备成重组多肽。这种重组多肽可经如下过程来制备将编码本发明突变体的DNA插入适宜的表达载体，收集将载体转染入适宜宿主细胞得到的转化子，并在得到提取物后用层析法来纯化多肽，如离子交换层析法，反相层析法，凝胶过滤层析法或亲和层析法。在亲和层析法中，抗本发明突变体的抗体可固定在一个层析柱上或将多个这样的层析柱进行组合。
而且，当本发明的突变体在一种宿主细胞(例如，动物细胞，大肠杆菌等)中表达为一种与谷胱甘肽S-转移酶蛋白质融合的多肽或一种添加了多个组氨酸的重组多肽时，此表达重组多肽可以用谷胱甘肽柱或镍柱来纯化。纯化融合多肽后，如果必要可以用凝血酶，凝血因子Xa等将非所需的突变体区域从融合多肽上切除。
本发明也提供其中插入了本发明DNA的载体。本发明的载体用于在宿主细胞内维持本发明的DNA或表达本发明的突变体。
当大肠杆菌用作宿主细胞时，除了载体应有一个“ori”和一个标记基因外没有其它限制。此“ori”用于扩增并大规模制备大肠杆菌内载体(例如，JM109，DH5α，HB101，或XL1Blue)。标记基因用于选择转化的大肠杆菌(例如，通过药物如氨苄青霉素，四环素，卡那霉素，或氯霉素选择的抗性基因)。例如，可用M13-系列载体，pUC系列载体，pBR322，pBluescript，pCR-Script等等。除上述载体外，pGEM-T，pDIRECT，pT7等也可用做cDNA的亚克隆和切割。在一种载体用于制备本发明突变体时，尤其有用的是表达载体。当表达载体在大肠杆菌内表达时，此表达载体应具有上述特征以在大肠杆菌中扩增。而且，在大肠杆菌，如JM109，DH5α，HB101，或XL1Blue用做宿主细胞时，载体应具有启动子，例如lacZ启动子(Wizard etal.(1989)Nature 341544-546；(1992)FASEB J.62422-2427)，araB启动子(Better et al.(1988)Science 2401041-1043)，或能有效促进所需基因在大肠杆菌内表达的T7启动子。其它载体的例子为pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress系统”(QIAGEN)，pEGFP和pET(对此种载体，一种表达T7RNA聚合酶的菌株BL21优选作为宿主使用)。
而且，载体可包含一段分泌多肽的信号序列。为将多肽制备到大肠杆菌周质中，pelB信号序列(Lei，S.P.et al.(1987)J.Bacteriol.1694379)可用作多肽分泌的信号序列。例如，氯化钙法或电穿孔法可以用来将载体导入宿主细胞。
作为用于制备本发明突变体的载体，本文提及来自哺乳动物的表达载体(如pCDNA3(Invitrogen)，pEGF-BOS (Nucleic Acids Res.(1990)18(17)5322)，pEF，pCDM8)，来自昆虫细胞的表达载体(如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO-BRL)，pBacPAK8)，来自植物的表达载体(如pMH1，pMH2)，来自动物病毒的表达载体(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，来自逆转录病毒的表达载体(如pZIPneo)，来自酵母的表达载体(如“毕赤氏酵母表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)和来自枯草芽孢杆菌的表达载体(如pPL608，pKTH50)，而来自大肠杆菌的那些表达载体未提及。
为在动物细胞如CHO，COS，和NIH3T3细胞中表达蛋白质，载体必须具有在所述细胞中用于表达所必需的启动子(例如SV40启动子(Mulliganet al.(1979)Nature 277108)，MMLV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima etal.(1990)Nucleic Acids Res.185322)，CMV启动子等)。如果载体另外还有一个用于选择转化子的标记基因就更优选(例如，一种由药物(如新霉素，G418等)选择的抗药基因)。具有此种特征的载体例子可包括pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV，pOP13等。
而且，为了稳定表达基因并在细胞内增加其拷贝数，可采用如下方法将核酸合成途径缺陷的CHO细胞用作宿主，向此CHO细胞中导入一种含有DHFR基因以弥补此细胞缺陷的载体(如pCHOI)，并用氨甲蝶呤(MTX)来扩增载体。而且为了瞬间表达一种基因，可用如下方法用含有SV40复制起始点的载体(如pcD)，转化染色体上有SV40 T抗原基因的COS细胞。所述复制起始点可以是多瘤病毒，腺病毒，牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起始点。另外，为增加宿主细胞内的基因拷贝数，选择性标记如氨基糖苷转移酶(APH)基因，胸腺嘧啶激酶(TK)基因，大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因，及二氢叶酸还原酶(dhfr)基因可导入表达载体。
在动物体内表达本发明的DNA的例子包括将此发明DNA插入适宜载体，并用逆转录病毒法、脂质体法、阳离子脂质体法、腺病毒法等将此载体导入活体。因此，可用于基因治疗由于血磷水平高而引发的疾病。这些方法中所用载体包括但不局限于腺病毒载体(如pAdexlcw)、逆转录病毒载体(如pZIPneo)等。基因操作的一般技术，如将本发明的DNA插入一种载体可根据传统方法(Molecular Cloning，5.61-5.63)进行操作。对于活体的给药可根据回体(ex vivo)方法或体内方法进行操作。
本发明也提供了该发明载体所导入的宿主细胞。此发明载体导入的宿主细胞不受特殊限制。例如，大肠杆菌和多种动物就可以被应用。本发明宿主细胞可用作，例如，制备和表达本发明蛋白质的制备系统。蛋白质制备系统包括体外和体内系统。应用真核细胞或原核细胞的这些制备系统用作体外制备系统。
例如，可以应用真核宿主细胞，动物细胞，植物细胞和真菌细胞。哺乳动物细胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108945)，COS，3T3，骨髓瘤，BHK(幼年仓鼠肾)，Hela，Vero，两栖动物细胞(如滑爪蟾卵母细胞(Valle et al.(1981)Nature 291358-340))及昆虫细胞(如Sf9，Sf21，Tn5)均已知为动物细胞。CHO细胞中，那些具有DHFR基因缺陷的细胞、dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)774216-4220)和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)601275)的特别优选。在动物细胞中，CHO细胞特别优选做大规模表达。一种载体可以被导入宿主细胞通过，例如磷酸钙法、DEAE-dextran法、用阳离子脂质体DOTAP(Boehringer-Mannheim)的方法、电穿孔法、脂质转染法等。
已知来自烟草(Nicotiana tabacum)的植物细胞为多肽制备系统，其可用作胼胝体(callus)培养物。作为真菌细胞，酵母细胞如酵母属包括酿酒酵母(Saccharomeyces cerevisiae)，或丝状真菌如曲霉属，包括黑曲霉(Aspergillusniger)是已知的。
用作多肽制备的有用原核细胞包括细菌细胞。细菌细胞如大肠杆菌(例如JM109，DH5α，HB101等)和枯草芽孢杆菌已知可用于多肽制备。
这些细胞用理想的DNA转化，得到的转化子在体外培养以得到多肽。转化子可用已知方法培养。例如，培养基如添加或不添加血清如胚胎小牛血清(FCS)的DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM可用作动物细胞的培养基。培养基的pH优选在大约6到大约8。这些细胞通常在大约30℃到大约40℃孵育大约15到大约200个小时，且如果必要，培养基可以置换、通气或搅动。
动物和植物宿主可以用作体内多肽制备。例如，编码本发明突变体的DNA可以导入一种动物或者植物宿主。此突变体可在体内制备再回收。这些动物和植物宿主包括在本发明的宿主中。
前述制备系统中所用的动物包括哺乳动物和昆虫。哺乳动物如羊、猪、绵羊、小鼠和牛是可用的(Vicki Glaser(1993)SPECTRUM BiotechnologyApplications)。或者哺乳动物可为转基因动物。
例如，编码本发明突变体的DNA可以与基因如羊β酪蛋白基因(编码特异地进入奶中的多肽)形成融合基因以此为制备。含有融合基因的DNA片段注入羊胚胎，其可再返回导入母羊。此发明突变体可以从转基因羊(即那些接受了修饰胚胎的羊所娩出的羊)产的奶中得到或从它们的后代得到。为提高含有转基因羊制造的多肽的奶量，可给药适当的激素(Ebert，K.M.etal.，(1994)Bio/Technology 12699-702)。
或者，昆虫如蚕(silkworm)可以应用。编码本发明突变体的DNA所插入的杆状病毒可用来感染蚕，并且突变体可以从体液中回收(Susumu M.etal.，(1985)Nature 315592-594)。
在植物细胞中，烟草可以应用。当应用烟草时，编码本发明突变体的DNA可插入植物表达载体中，如pMON530，其可导入细菌，如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。因而，用细菌感染烟草如烟草(Nicotianatabacum)，可从叶片中回收想要的突变体(Julian K.-C.Ma et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24131-138)。
如前获得的本发明突变体可从宿主细胞内部或外部(如培养基)分离得到，且纯化成为基本纯的均一多肽。此种多肽分离纯化的方法不限于任何特定方法。事实上，可用任何标准方法。例如柱层析法、过滤法、超滤法、盐析法、溶剂沉淀法、溶剂萃取法、蒸馏法、免疫沉淀法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电点电泳法、透析法和重结晶法，可从其中适当选择并组合方法以分离纯化多肽。
对于层析、例如亲和层析，离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等都可以应用(Strategies for Protein Purification andCharacterizationa Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。这些层析可用液相层析如HPLC和FPLC来操作。因此，本发明依前法制作可提供高纯度的突变体。
本发明突变体可在纯化前后用合适的蛋白质修饰酶处理，从而被选择性修饰或部分去除。例如，胰蛋白质酶、胰凝乳蛋白质酶、赖氨酰内肽酶、蛋白质激酶、葡萄糖苷酶等可用作蛋白质修饰酶。
本发明进一步提供了药用化合物以降低血磷水平，此种化合物包含本发明的突变体、编码突变体的DNA或DNA导入的载体。
当本发明突变体作为药物用于人体和其他动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、鸡、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴子、狒狒(baboons)和黑猩猩时，突变体可直接或作为用已知药物制备方法配制的药用化合物用药给受试者。例如，根据预期的应用，药物可作为糖衣药片、胶囊、酏剂和微胶囊口服或以水或其它可药用液体制成的无菌溶液、悬液的注射剂形式非口服给药。例如，化合物可以以通常接受的使用药物所需的单位剂量形式，与药学上可接受的载体或介质混合，具体是无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、溶剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、载体(vehicles)、防腐剂和粘合剂。这些制剂中活性成分的量为在指定要求范围内适宜的量。
可与之混合制成药片或胶囊的添加剂的例子是粘合剂如明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和褐藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；增甜剂如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂如薄荷油、白株树腺毛油(Gaultheria adenothrix oil)和樱桃(cherry)。当单位剂量形式为胶囊、液体载体，如油也可包括在上述成分中。无菌注射用组合物按通常的药物配制方法，应用载体如注射用蒸馏水来配制。
生理盐水、葡萄糖和其他等渗液体包括佐剂，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠可用作注射用水溶液。这些可与适宜增溶剂如醇、尤其是乙醇，多元醇如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂如Polysor bate 80TM和HCO-50联合应用。
芝麻油或大豆油可用作油质液体，并可与苯甲基安息香酸酯或苯甲基乙醇联合用作增溶剂；其可与缓冲液如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液来配制；可与止痛剂如盐酸普鲁卡因；稳定剂如苯甲基乙醇、苯酚；以及抗氧化剂配制。制备好的注射剂注入合适的安瓿中。
业内人员已知的方法可用于向病人给药此药物化合物。例子包括动脉内注射、静脉内注射、皮下注射、鼻内给药、经气管给药、肌肉内给药、经皮给药和口服用药。剂量可根据病人体重和年龄及用药方法而有所变化。
本发明突变体的剂量可根据个体、靶器官、症状和用药方法而不同，但通常一个成年人(体重60kg)每天大约100μg到大约20mg。
尽管会随个体、靶器官、症状和用药方法变化，肠胃外给药的化合物的单次剂量，在静脉内注射给药正常成年人(60kg体重)时每天优选在大约0.01mg到大约30mg的范围，优选在约0.1mg到约20mg的范围，更优选在约0.1mg到约10mg的范围。转换成60kg体重或单位体表面积的剂量可以给药其它动物。
而且，当本发明DNA用作药物组合物时，其可插入载体以确保前述本发明DNA的体内表达，并通过例如逆转录病毒法、脂质体法、阳离子脂质体法、腺病毒法等导入活的个体。用此方法，可以进行针对由高血磷水平引发的疾病的基因治疗。回体方法和体内方法可用于向活的个体内给药。
附图简述
图1此图显示FGF23突变体对于血清无机磷水平的作用。血清无机磷水平在导入DNA载体4天后检测。数据以均值±SEM表示。柱体数字为动物数量。与模拟对照相比*P＜0.05(不对称t-检验)。
图2此图显示FGF23对于血清无机磷水平的作用。血清无机磷水平在导入DNA载体4天后检测。数据以均值±SEM表示。柱体数字为动物数量。与模拟对照相比*P＜0.05(不对称t-检验)。
图3此图显示FGF23和FGF23突变体对于血清1α，25(OH)2D3水平的作用。血清1α，25(OH)2D3水平在导入DNA载体4天后检测。混合3只动物所得血清用于检测(n＝2，6只动物/组)。其数据以均值表示。
图4此图显示FGF23突变体对于自肾分离的刷状缘膜囊泡磷转运活性的作用。检测肾刷状缘膜囊泡对导入小鼠的裸DNA载体的Pi摄取量(导入4天后)。取2只动物的肾用于检测(n＝3，6动物/组)。其数据以均值表示。
图5此照片显示FGF-23(突变体)M2-F的SDS-PAGE(考马斯亮蓝(CBB)染色)分析的结果。M表示分子量标记(BIO-RAD Laboratories，宽范围的分子量标记)。
图6此图显示C末端缺失的M2FGF23突变体对血清磷水平的降低作用。“模拟”表示导入亲代载体pCAGGS的小鼠。“Normal”表示的正常小鼠。
图7此图显示PTH(1-34)和M2FGF23降低TPTX大鼠血清磷的作用。
图8此图显示PTH(1-34)和M2FGF23对TPTX大鼠血清钙的作用。
图9此图显示PTH(1-34)和M2FGF23对TPTX大鼠肾脏磷酸分泌的作用。
具体实施方案在下文中，本发明参考实施例进行具体阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1克隆人FGF23的全长cDNA(ORF部分)克隆FGF23全长cDNA(ORF部分)采用PCR法。根据GenBank数据，向序列(5’ggAATTCTCgAgCCACCATgTTgggggCCCgCCTCAggCTCTg-3’/SEQ ID NO3；和5’ggAATTCTCgAgCTACTAgATgAACTTggCgAAgg-3’/SEQ ID NO4)添加EcoR I位点和Xho I位点以设计引物(登录号AB037973)。之后，对于5’引物将Kozak序列(CCACC)添加至其ATG起始密码子上游，并且两个TGA终止子被添加到3’端序列。引物承包给Sawady Technology构建。人心脏cDNA(Multiple cDNA试剂盒，Cat.No.CH-1101，OriGene)用作模板，QIAGEN PCR试剂盒(Cat.No.201223，QIAGEN)用于PCR反应。更为具体的是，0.75μl人心脏cDNA(Multiple cDNA试剂盒，OriGene)，2.5μl QIAGEN10×PCR缓冲液，0.5μl dNTP混合物(200mM)，0.25μl QIAGEN Taq DNA聚合酶，5.0μl 5×Q-溶液，0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO3)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQ ID NO4)和15μl去离子蒸馏水(DDW)混合至PCR反应总体积为25μl。此PCR反应是用热循环仪ABI2400按如下条件进行初次变性95℃2分钟，2步穿梭(shuttle)PCR的35轮循环(94℃40秒，然后60℃1分钟)，延伸反应72℃7分钟以完成PCR反应。之后用1.0％琼脂糖凝胶电泳确认PCR反应扩增产物。结果呈现为一条特异性条带位于750bp附近。再用TOPO TA克隆试剂盒(Cat.No.K45000-01，Invitrogen)，用2μl PCR反应溶液将扩增的DNA亚克隆至TA载体pCR2.1。其后步骤根据试剂盒提供的流程。然后，对用TA克隆的克隆#3进行核苷酸序列分析，该分析是来用M13的M4引物(Cat.No.3832A，TaKaRa)，M13的RV引物(Cat.No.3830A，TaKaRa)，引物SEQ ID NO5(5’CgCACCCCATCAgACCATCT-3’) 和引物SEQ ID NO6(5’gCAgTTCTCCgggTCgAAATA-3’)在ABI377DNA测序仪上进行的。结果是克隆#3的内部序列与人FGF23的完全吻合。最后完成FGF23的克隆。
实施例2人FGF突变体(R176Q，R179Q，R179W，R176Q+R179Q和R176Q+R179W)的制备以人FGF23作为模板，FGF突变体R176Q(M1)，R179Q(M2)，R179W(M3)，R176Q+R179Q(M4)和R176Q+R179W(M5)得以制备。根据文献(“常染色体显性低磷酸盐血佝偻病与FGF23的突变之间的关联”，NatureGenetics.Vol.26，p345-348，November 2000)，三种突变体527G？A(R176Q)，536G-A(R179Q)和535C-T(R179W)，以及它们的组合，M4(R176Q+R179Q)和M5(R176Q+R179W)可自人FGF23制备。引物合成承包给SawadyTechnology。所用引物的核苷酸序列如下5’CACggCAgCACACCCggAgC-3’(SEQ ID NO7)；5’CACggCggCACACCCAgAgC-3’(SEQ ID NO8)；5’CACggCggCACACCTggAgC-3’(SEQ ID NO9)；5’CACggCAgCACACCCAgAgC-3’(SEQ ID NO10)；和5’-CACggCAgCACACCTggAgC-3’(SEQ ID NO11)。
诱变用包含如下3个步骤的方法进行经过第一次PCR制备用于诱变的部分片段，制备含第二次PCR中的突变的全长突变体的模板，最后在第三次PCR中得到完全的突变体。具体为0.2μl人FGF23克隆#3(40ng/μl)，5μl TaKaRa EX 10×PCR缓冲液，4μl dNTP混合物(50μM)，0.5μl TaKaRaExTaq DNA聚合酶，0.5μl特定突变体引物(50μM，SEQ ID NOs7，8，9，10或11)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQ ID NO4)和39.3μl DDW混合至总体积50μl，以在热循环仪ABI2400上进行PCR反应。反应条件如下初次变性95℃2分钟，2步穿梭PCR的35轮循环(94℃40秒，然后60℃30秒)，最后延伸反应72℃4分钟以完成反应。之后用1.0％琼脂糖凝胶电泳确认PCR反应扩增产物。结果呈现为一条特异性条带位于200bp附近。用QIAquick Gel Extraction Kit(Cat.No.28704，QIAGEN)按试剂盒提供的流程从胶中纯化每条特异性扩增的片段。之后，用该纯化片段(突变体部分序列)，进行第二次PCR反应(制备全长突变体模板)。用1μl纯化片段作为引物，0.1μl人FGF23克隆#3(40ng/μl)，2.5μl TaKaRa EX 10×PCR缓冲液，2μldNTP混合物(50μM)，0.25μl TaKaRa ExTaq DNA聚合酶，和18.15μl DDW混合至总体积24μL，以在热循环仪ABI2400上进行第二次PCR反应。反应条件如下初次变性95℃2分钟，3步循环PCR的5轮循环(94℃1分钟，60℃1分钟，然后72℃1分钟)以完成第二次PCR反应。之后，将0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO3)和0.5μl特定反向PCR引物(50μM，SEQID NO4)加入此反应溶液达到总体积25μl，在热循环仪ABI2400上以如下反应条件进行第三次PCR反应初次变性95℃2分钟，2步穿梭PCR的35轮循环(94℃40秒，然后60℃1分钟)，最后延伸反应72℃7分钟以完成PCR反应。之后用1.0％琼脂糖凝胶电泳确认PCR反应的最终扩增产物，其显示为一条特异性扩增的条带位于750bp附近。
根据类似实施例1的方法进行其后的分析。具体为在内部序列的TA克隆之后进行内部序列的核苷酸序列分析。其结果为成功获得各自含有所需突变的突变体克隆。
实施例3表达载体制备每个克隆的表达载体都是通过将FGF23的各自的内部序列和每种突变体(M1到M5)插入到pCAGGS3制备。具体为每个克隆都用EcoRI限制性酶切割，得到的EcoRI片段用QIAquick Gel Extraction Kit(Cat.No.28704，QIAGEN)纯化以插入到EcoRI切割的pCAGGS3。载体分别称为pCGF23和pCGFM1到pCGFM5。
实施例4无内毒素的质粒的制备为直接体内用药质粒DNA，进行质粒纯化时添加了内毒素去除处理。更具体地，pCGF23和pCGFM1到pCGFM5可用Endofree plasmid MaxiKit(Cat.No.12362，QIAGEN)根据其提供的流程纯化成无内毒素型质粒。
实施例5添加C末端FLAG-标记至FGF-23和M2(R179Q)在C末端含有FLAG序列的突变体可用模板为pCGF23和pCGFM2，引物为含有SEQ ID NO3序列和FLAG序列的SEQ ID NO12来制备。更具体地，1μl pCGF23或pCGFM2(30ng/μL)，2.5μl TaKaRa EX 10×PCR缓冲液，2μl dNTP混合物(50μM)，0.25μl TaKaRa ExTaq DNA聚合酶，0.5μl特定正向PCR引物(50μM，SEQ ID NO11)，0.5μl特定反向PCR引物(50μM，5’ggATCCgAATTCATATgTCACTTATCgTCgTCATCCTTgTAATCgATGAACTTggCgAAgg-3’/SEQ ID NO12)和18.5μl DDW混合至总体积25μl，以在热循环仪ABI2400上进行PCR反应。反应条件如下初次变性95℃2分钟，2步穿梭PCR的30轮循环(94℃30秒，然后60℃1分钟)，最后延伸反应72℃7分钟以完成PCR反应。之后用1.0％琼脂糖凝胶电泳确认PCR反应的最终扩增产物，其显示为一条特异性扩增的条带位于800bp附近。其后的分析用类似实施例1到4的方法进行，最后制备pCGF23-F和pCGFM2-F表达载体。
实施例6添加N末端FLAG-标记至FGF-23和M2(R179Q)含N末端FLAG标记的FGF23表达载体用如下PCR法构建。第一阶段PCR反应(25个循环即96℃15秒，55℃15秒，然后72℃2分钟)用3ngpCG23作模板，100pmol每种特定的正向PCR引物和23N FLAG R(GCCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCTCTGAGGACGCTC/SEQ IDNO13)或23NR1(GGCTCGAGTCAGATGAACTTGGCGAAGG/ SEQ IDNO14)与23NFLAGF(GATGACGACGATAAGGGCGGAGGTTCCAGAGCCTATCCCAATG/SEQ ID NO15)作为引物组，并用此处提供的TaKaRa ExTaq及其缓冲液来进行。在通过Microcon-30(Millipore)过滤从PCR反应产物中除去引物后，得每种PCR反应产物的混合物用作模板，FGFF与23R1作为引物组，在与第一阶段同样的条件下进行第二阶段的PCR反应。反应完成后，用琼脂糖电泳纯化PCR反应产物。然后用TOPO Cloning Kit(Invitrogen)来克隆片段，测定其DNA序列以确认导入了所需的突变而非不需要的突变。制备含有确认序列的质粒，用EcoRI切割，收集所得片段用于插入到已经EcoRI切割的pCAGGS3中。最后，确认片段插入的方向后，此表达载体被称为pCGF23NF。
携带N末端FLAG标记的FGF23M2载体可用上述同种方法制备。不同的是在第一阶段PCRpCGFM2用作模板，该载体称为pCGFM23NF。
实施例7制造表达载体用于裸DNA注入的动物实验使用裸DNA注射法，检测FGF23及其突变体能否直接或间接影响成年小鼠磷代谢。
所用材料如下FGF23表达载体(pCGF23)R176Q FGF23突变体表达载体((pCGFM1))R179Q FGF23突变体表达载体(pCGFM2)R179W FGF23突变体表达载体(pCGFM3)R176QR179Q FGF23突变体表达载体(pCGFM4)
R176QR179WFGF23突变体表达载体(pCGFM5)<对照物(阴性对照物)>
模拟载体(pCAGGS)剂型10mMTris/1mMEDTA(pH8.0)溶液保存-20℃，避光保存<制备方法>
剂型为溶液，制备方法依照TransIT In Vivo Gene Delivery System(Pan Vera)(TransITIn Vivo Gene Delivery System(Pan Vera)标准流程)。10μg模拟载体，FGF23表达载体或FGF23突变体表达载体用于给药每只动物。10μl TransIT聚合物溶液及适量无菌水在50mL Falcon试管中混合至终体积200μl。室温放置5分钟后，2.8mL 1×Delivery溶液加至上述200μl混合溶液以达到给药溶液总体积3.0mL。如给药6只动物，制备用于7只动物即21mL的溶液量。给药溶液在制备的当天用完。
本实验所用动物及其居住条件如下<所用动物>
动物种类小鼠谱系JclCD-1(ICR)或CrjCD-1(ICR)性别雄性体重35g到40g年龄给药时为8到9周提供者CLEA日本或Charles River日本安乐死方法麻醉下放血顺应时间大约2周分组方法随机分配<繁殖环境>
室温24±2℃相对湿度55±10％通风频率10到30次/小时照明时间5:00到19:00饲养CE-2(CLEA日本)随意饮水自来水
<实验方法>
静脉内给药每剂3mL，8秒钟内给药总剂量。
<样本收集>
(1)血清在给药后第4天，醚麻醉状态下从腹主动脉收集全血。收集血液置于Separapid tube mini(Sekisui chemical)中，离心(1,400×g，10分钟，4℃)以分离血清。此血清储存于设置为-20℃的冰箱直到检测。
(2)尿在给药后第3天，将小鼠置于玻璃代谢笼(METABOLICA，SUGIYAMA-GEN IRIKI)，汇聚第四天24小时尿收集物。检测前将此尿一直储存于设置为-20℃的冰箱。
(3)肾收集血清后，双肾摘除，去被膜，并对刷状缘膜囊泡进行纯化。
<各项指标检测>
血清和尿中无机磷(Pi)，钙(Ca)，尿素氮(UN)和肌酸酐(CRE)用自动分析仪检测(Hitachi 7170E型)。25-羟基维生素D和24，25-二羟基维生素D用竞争性蛋白质结合试验(CPBA)来检测，而1α，25-二羟基维生素D则用RIA2抗体法来检测。
<统计分析方法>
不对称t-检验在模拟载体给药组和FGF23表达载体给药组或每个FGF23突变体表达载体给药组之间进行。显著性水平为5％(双尾)。SASVer.6.12在此用作分析软件。
其结果如图1所示，对血清生化作用方面，与模拟给药组比较，不考虑突变体类型，给药3种FGF23突变体表达载体(它们导入了从常染色体显性低磷酸盐血佝偻病(ADHR)病人鉴定出的点突变)中任何一种(即FGF23-M1，FGF23-M2或FF23-M3)的给药组，血磷水平可见显著下降。然而，在给药具有这些点突变的组合的两种突变体表达载体中任何一种(即FGF23-M4或FGF23-M5)的给药组，尽管可见类似的血清磷水平降低作用，但不能确定由于点突变的组合带来了累加或协同作用。野生型FGF23(FGF23-Wild)给药组，无血清磷水平降低作用(图2)。
表1所示，比较模拟组和野生型FGF23组或FGF23-M2组，其它血清生化指标(钙，肌酸酐和尿素氮)无明显差异。
表1
而且，关于突变体对于尿生化的作用结果，如表2所示，比较FGF23-M2给药组和模拟组，在FGF23-M2给药组可见每天磷分泌水平升高的趋势，然而差异不明显。
表2
而且，关于突变体对于血清1α，25(OH)2D3的作用结果，如图3所示，与模拟给药组相比，FGF23-M2给药组和野生型FGF23组可见1α，25(OH)2D3水平显著下降。在野生型FGF23组，1α，25(OH)2D3水平降至大约一半，而在FGF23-M2给药组，1α，25(OH)2D3水平降低到检测灵敏度以下。
另一方面，在模拟给药组，野生型FGF23给药组和FGF23-M2给药组中，体内前体25(OH)D3水平无明显差异。然而，尽管在野生型FGF23给药组和模拟给药组之间24，25(OH)2D3水平无差异，但在FGF23-M2给药组观察到其水平明显下降(表3)。
表3
<刷状缘膜囊泡纯化>
刷状缘膜囊泡纯化是用镁沉淀法进行的。更具体为将冰浴MET缓冲液(60mM甘露醇，1mM EGTA，2.5mM Tris/HCl，pH7.1)加至收集的肾中，用PHYSCOTRON在18,000rpm下均化1分钟后，加入1/10体积的1M MgCl2，搅拌并置于冰上15分钟。通过低速离心(2,000×g，15分钟，4℃)去除未均化成分，高速离心上清(24,000×g，30分钟，4℃)以取得沉淀。将MET缓冲液加到沉淀中，进一步将其用Teflon均浆器(1,000rpm，10击(Strokes))均化。再次加入1/10体积的1M MgCl2，搅拌并置于冰上15分钟，低速离心此混合物(2,000×g，15分钟，4℃)后，高速离心(24,000×g，30分钟，4℃)上清。将Transport缓冲液-K(100mM甘露醇，20mMHEPES/Trs，pH7.4)加至得到的沉淀，用塑料针筒(20G和27G针)反复抽取推放以此得到刷状缘膜囊泡。
<磷转运活性测定>
快速过滤法适用于用刷状缘膜测定磷转运活性。更具体地，20μL刷状缘膜囊泡和80μL反应液(100mM甘露醇，20mM HEPES/Tris，pH7.4，125mMNaCl，125nM32P-KH2PO4)在25℃反应1分钟，再加入1mL淬灭溶液(100mM甘露醇，100mM氯化胆碱，20mM MgSO4，5mM KH2PO4，20mM HEPES/Tris，pH7.4)以终止反应。然后将反应溶液通过硝酸纤维素滤膜(孔径0.45μm，2.5cm直径)抽吸过滤，此硝酸纤维素滤膜先用5mL淬灭溶液清洗。再用液体闪烁计数器TRI-CARB2700TR(Beckman)检测诱捕在滤膜上的放射性作为总体磷转运活性。钠不依赖性磷转运活性通过在反应溶液中用125mM KCl替代125mM NaCl来检测。钠依赖性磷转运活性作为总体磷转运活性和钠不依赖性磷转运活性的差来计算。此两种活性都用每分钟每单位蛋白质吸收的磷量来表示(pmoles/mg蛋白质/分钟)，在刷状缘膜囊泡的蛋白质量用BCA蛋白质检测试剂(PIERCE)来检测。
其结果如图4所示，与模拟给药组相比，FGF23-M2给药组的肾钠依赖性磷转运载体(Na/Pi)活性显著降低。另一方面，钠不依赖性磷转运活性无变化。
实施例8构建C末端缺失型M2FGF23突变体表达载体C末端缺失型M2FGF23突变体表达载体如下所述用PCR法来构建。PCR反应(25循环96℃15秒，55℃15秒，然后72℃2分钟)用TaKaRa ExTaq及其提供的缓冲液来进行。此反应用3ng pCGFM2NF作为模板，100pmol每种特异性正向PCR引物和dC188(GGCTCGAGTCAGTCCCGCTCCGAGTC/SEQ ID NO16)，dC194(GGCTCGAGTCACTTCAGCACGTTCAGGGG/SEQ ID NO17)，dC200(GGCTCGAGTCAGGTCATCCGGGCCCGGGG/SEQ ID NO18)，dC210(GGCTCGAGTCAGAGCTCCTGTGAACAGGA/SEQ ID NO19)，dC217(GGCTCGAGTCAGCTGTTGTCCTCGGCGCT/SEQ ID NO20)，dC223(GGCTCGAGTCAGTCACTGGCCATCGGGCT/SEQ ID NO21)，dC240(GGCTCGAGTCAGCCCGTTCCCCCAGCGTG/SEQ ID NO22)，或dC245(GGCTCGAGTCAGCGGCAGCCTTCCGGGCC/SEQ ID NO23)作为引物组。反应终止后，PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，所得片段用TOPO Cloning Kit(Invitrogen)来克隆。然后测定他们的DNA序列以确认导入的为需要的突变而非不需要的突变。制备有确认序列的质粒，之后用EcoRI切割，收集片段再插入已用EcoRI切割的pCAG GS3。由此获得的表达载体被分别称为pCGdC188(dC188)，pCGdC194(dC194)，pCGdC200(dC200)，pCGdC210(dC210)，pCGdC217(dC217)，pCGdC223(dC233)，pCGdC240(dC240)和pCGdC245(dC245)。
实施例9C末端缺失型M2FGF23突变体蛋白质的表达1×105COS细胞悬浮在1mL DMEM(10％FCS)培养基(GIBCO)中，并铺板于一个6孔平板上。过夜培养后，1μg此种表达载体(实施例8中所示的pCGdC188到pCGdC245)通过3μLFuGene(Boeringer)转染至细胞中并继续过夜培养。第二天，将培养基置换为CHO-S-SFMII，继续培养2天。两天之后，收集培养基，用Western Blotting法用抗FLAG抗体(M2)(SIGMA)来分析培养基中表达的突变体蛋白质，以此确认突变体蛋白质的表达。
实施例10重组FGF-23突变体(M2)在COS细胞中的瞬时表达5×106细胞悬浮在400μLDMEM(10％)FCS培养基(GIBCO)中，加入10μgpCGFM2-F表达载体后移至一0.4cm电穿孔管(BIO-RAD Laboratories)中。用Gene-pulser(BIO-RAD Laboratories)在0.26kV，电阻8，且960mF的条件下进行电穿孔。之后，在30mLDMEM(10％FCS)培养基中悬浮细胞溶液，移至一175cm2的细胞培养瓶(FALCON)中，在CO2孵箱于37℃静置一日夜。第二天，将培养基置换为30mL CHO-S-SFMII培养基(GIBCO)，继续培养细胞3天。收集的培养基在3,000rpm离心15分钟，以去除细胞，再用Western Blotting法用抗FLAG抗体(M2)(SIGMA)来分析培养基以确认重组FGF-23突变体(M2)-F的表达。
实施例11用亲和柱纯化重组FGF-23(M2)-F纯化重组FGF-23(M2)-F是用抗FLAG抗体亲和柱(SIGMA)来进行的。此层析法是用GradiFrac系统(Pharmacia)来执行的。用PBS-T平衡亲和柱后，上样含实施例10制备的表达重组FGF-23突变体(M2)-F的培养基，并用甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)洗脱。然后分级分离主峰并用SDS-PAGE分析对其进行。因为一条位于所需分子量附近的接近单一的条带用考马斯亮蓝(CBB)染色被确认，重组体的制备结束(图5)。
实施例12缺失突变的动物实验给药制剂的制备是根据TransIT In VIvo Gene Delivery System(PanVera)的流程。将10μL TransIT溶液及适量无菌水加入10μg图6所示的不同表达载体中(模拟与实施例7同)，总体积达200μL。混合此溶液并室温下静置5分钟，每200μL添加2.8mL1×Delivery溶液，从而获得每只动物的给药溶液量为3.0mL。当给药6只动物时，需制备量达7只动物即21mL的溶液。给药溶液仅限当天使用。
自Charles River日本购买的8到9周龄的雌性小鼠CD-1(ICR)(35g到40g)在1周顺应期后接受实验。含有表达载体的总量3mL的给药制剂通过尾静脉在8秒内给药。给药4天后，醚麻醉下从腹主动脉收集全血。将收集的血置于Separapid tube mini(Sekisui Chemical)并离心(1,400×g，10分钟，4℃)以分离血清。
血清中无机磷(Pi)，钙(Ca)，尿素氮(UN)，和肌酸酐(CRE)用自动分析仪(Hitachi 7170E型)来检测。
结果如图6所示。
M2FGF23突变体由251个氨基酸构成。当此突变体C末端部分缩短时，含氨基酸至位置200的突变体dC200也具有同样的降低血清磷的作用。然而，当C末端进一步缩短到dC194(含氨基酸至位置194)时，或dC188(含氨基酸至位置188)时，此作用被削弱或丧失。在此推测，在ADHR病人，氨基酸在位置176或位置179的突变使FGF23不易受蛋白质水解的调节作用，其结果为血中过量的FGF23存在导致低磷酸血症。所以，根据本发明结果，我们认为氨基酸位置179到200包括对于血清磷降低作用至关重要的位点。
实施例13FGF23对甲状腺-甲状旁腺切除大鼠的作用一8周龄的雄性大鼠Sprague-Dawley(SD)接受甲状腺-甲状旁腺-切除术(TPTX)。几天后，测定其离子钙以确认手术是否成功。然后，向大鼠股静脉中插入导管，连接尿袋，将其限制在Ballman笼中。
用Harvard灌注泵，将PTH(1-34)(0.3nmol/mL)，具有C-FLAG标记的M2FGF23蛋白质(6μg/mL)，或载体(0.05％Tween80/盐水)以1mL/小时的速度灌注给药6小时。在开始灌注4小时到6小时内收集尿直至给药结束。终止给药后从腹主动脉收集全血。此收集的血液于3,000rpm离心10分钟。将血清和尿的不可溶级分分离并用Hitachi7170型自动分析仪检测无机磷、钙和肌酸酐。结果如图7到图9所示。
根据图7，因TPTX而升高的大鼠血清磷浓度已因给药PTH(1-34)而正常。而且，通过给药M2FGF23也同样获得正常。另一方面，虽然给药PTH(1-34)可纠正因TPTX造成的血清钙浓度下降，但给药M2FGF23对其几乎无作用(图8)。这表明M2FGF23对血清磷水平的作用并非由PTH引起，因此不影响血清钙水平。既然尿中无机磷/肌酸酐比值会随PTH(1-34)给药而升高，因此人们认为血清磷被分泌到尿中。另一方面，无机磷/肌酸酐比值不因给药M2FGF23而变化。因此，血清磷可能已返回骨形成了羟基磷灰石(图9)。
工业实用性本发明提供FGF23蛋白质突变体。既然本发明的FGF23突变体具有降低血磷水平的作用，人们期望它们能用作高磷酸盐血症的治疗和预防制剂。而且，编码本发明FGF23突变体的DNA通过导入体内并在体内表达可降低血磷水平。因此，人们希望这些DNA可应用于抗高磷酸盐血症的基因治疗。
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<150>JP2000-396316<151>2000-12-26<150>JP2001-161370<151>2001-05-29<160>23<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>756<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(753)<400>1atg ttg ggg gcc cgc ctc agg ctc tgg gtc tgt gcc ttg tgc agc gtc 48Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15tgc agc atg agc gtc ctc aga gcc tat ccc aat gcc tcc cca ctg ctc 96Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30ggc tcc agc tgg ggt ggc ctg atc cac ctg tac aca gcc aca gcc agg 144Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45aac agc tac cac ctg cag atc cac aag aat ggc cat gtg gat ggc gca 192
Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala50 55 60ccc cat cag acc atc tac agt gcc ctg atg atc aga tca gag gat gct 240Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala65 70 75 80ggc ttt gtg gtg att aca ggt gtg atg agc aga aga tac ctc tgc atg 288Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met85 90 95gat ttc aga ggc aac att ttt gga tca cac tat ttc gac ccg gag aac 336Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn100 105 110tgc agg ttc caa cac cag acg ctg gaa aac ggg tac gac gtc tac cac 384Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His115 120 125tct cct cag tat cac ttc ctg gtc agt ctg ggc cgg gcg aag aga gcc 432Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala130 135 140ttc ctg cca ggc atg aac cca ccc ccg tac tcc cag ttc ctg tcc cgg 480Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg145 150 155 160agg aac gag atc ccc cta att cac ttc aac acc ccc ata cca cgg cgg 528Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg165 170 175cac acc cgg agc gcc gag gac gac tcg gag cgg gac ccc ctg aac gtg 576His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val180 185190ctg aag ccc cgg gcc cgg atg acc ccg gcc ccg gcc tcc tgt tca cag 624Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln195 200 205gag ctc ccg agc gcc gag gac aac agc ccg atg gcc agt gac cca tta 672Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu210 215 220ggg gtg gtc agg ggc ggt cga gtg aac acg cac gct ggg gga acg ggc 720
Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly225 230 235 240ccg gaa ggc tgc cgc ccc ttc gcc aag ttc atc tag 756Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile245 250<210>2<211>251<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala50 55 60Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala65 70 75 80Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met85 90 95Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn100 105 110Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His115 120 125Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala130 135 140Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg145 150 155 160
Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg165 170 175His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val180 185 190Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln195 200 205Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu210 215 220Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly225 230 235 240Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile245 250<210>3<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3ggaattctcg agccaccatg ttgggggccc gcctcaggct ctg 43<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>对人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12ggatccgaat tcatatgtca cttatcgtcg tcatccttgt aatcgatgaa cttggcgaag 60g 61<210>13<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>对人工序列的描述人工合成的引物序列<400>19
ggctcgagtc agagctcctg tgaacagga 29<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>对人工序列的描述人工合成的引物序列<400>21ggctcgagtc agtcactggc catcgggct 29<210>22<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述人工合成的引物序列<400>22ggctcgagtc agcccgttcc cccagcgtg 29<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述人工合成的引物序列<400>23ggctcgagtc agcggcagcc ttccgggcc 29
权利要求
1.一种DNA，编码含有氨基酸序列为SEQ ID NO2的蛋白质，此氨基酸序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
2.一种编码包含蛋白质的至少1到190位氨基酸序列的片段的DNA，该蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，该序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
3.一种载体，其中插入了根据权利要求1或2的DNA。
4.一种转化细胞，其包含根据权利要求1或2的DNA或根据权利要求3的载体。
5.一种含有氨基酸序列为SEQ ID NO2的蛋白质，该序列含有选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
6.一种含有蛋白质至少其位置1到190的氨基酸序列的片段，该蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2，该序列包含选自如下的突变位置176的精氨酸突变为谷氨酰胺，位置179的精氨酸突变为谷氨酰胺或位置179的精氨酸突变为色氨酸。
7.一种制备根据权利要求5或6的蛋白质的方法，其包括培养根据权利要求4的转化细胞的步骤和从此转化细胞或其培养上清收集表达蛋白质的步骤。
8.一种降低血磷水平的药物组合物，其包含根据权利要求1或2的DNA，根据权利要求3的载体或根据权利要求5或6的蛋白质。
9.权利要求8的药物组合物，其不影响血钙水平。
10.权利要求8或9的药物组合物，用于治疗高磷酸盐血症。
11.一种治疗高磷酸盐血症的方法，包括向患者给药根据权利要求1或2的DNA的步骤。
全文摘要
分离编码人FGF23蛋白质的全长cDNA，在此cDNA上有单个氨基酸替代的突变体，其为诱变法所构建。这些突变体于体内表达时，具有降低血磷水平的作用。人们希望这些突变体及其编码DNA可作为高磷酸盐血症的药物治疗剂，或其基因治疗的药物治疗剂。
文档编号C12N15/12GK1492927SQ0182283
公开日2004年4月28日 申请日期2001年12月26日 优先权日2000年12月26日
发明者伊藤浩孝, 福岛直, 斋藤一史, 草野健一郎, 一郎, 史 申请人:中外制药株式会社