一种检测蛋白质烷基化修饰剂peg修饰能力的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种可用于检测蛋白质烷基化修饰剂PEG修饰能力的试剂盒及其使用方法。本试剂盒内包括有阳性对照谷胱甘肽粉剂、蛋白质与修饰剂反应Buffer缓冲液、NaH2PO4溶液、5,5－二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）显色液。该试剂盒的使用方法是设置蛋白质经修饰剂修饰与蛋白质不经修饰剂修饰两组，分别用5,5－二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）为显色剂，利用分光光度计测定在波长412nm下两组反应体系的吸光值，根据两组吸光值的差异来检测蛋白质烷基化修饰剂PEG的修饰能力。该试剂盒整个检测过程在60min内可完成，快速，简便，并且稳定性好、保存期长，具有重要的推广应用价值。
【专利说明】一种检测蛋白质烷基化修饰剂PEG修饰能力的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测试剂盒及其使用方法。更具体地，涉及ー种可用于检测蛋白质烷基化修饰剂PEG修饰能力的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质化学修饰具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。20世纪50年代末期，用化学修饰的方法研究蛋白质分子的结构与功能的关系成为生物化学和分子生物学领域的热点。蛋白质化学修饰的目的是用于生物医学和生物技术方面。在生物医学方面，化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性、抑制免疫球蛋白E的产生等；在生物【技术领域】，酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用，并表现出新颖的催化性能。
[0003]蛋白质修饰剂与蛋白质发生反应的性质，主要可以分为四种类型:(I)酰化及其相关反应，这类修饰剂可以与蛋白质的侧链基团发生酰基化反应；(2)烷基化反应，这类修饰剂的特点是带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团发生烷基化；(3)氧化和还原反应，这类修饰剂具有氧化性，能将侧链基团氧化；(4)芳香环取代反应，蛋白质氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。有代表性的修饰剂有こ酰咪唑、卤代こ酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺、こ二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、聚 乙二醇(PEG )等。其中，PEG溶解性好，毒性低，无免疫原性，蛋白质经其修饰后不但保持了水溶性而且在有机溶剂中的溶解性也増加了，因此PEG类修饰剂应用最多。
[0004]由于PEG的醇羟基化学性质不活泼，所以必须通过特定的活化剂与其反应使之活化。其中氰尿酰氯法是比较经典的方法。该法具有活化反应操作简单、所活化的PEG修饰能力强、修饰蛋白质稳定性高等优点，是目前最常用的PEG活化方法之一。经氰尿酰氯活化后的PEG带上^!素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团(例如-SH，-NH2等)发生烷基化反应，且巯基基团是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。因此活化的PEG修饰剂很容易与蛋白质中的巯基与氨基发生反应。
[0005]但是氰尿酰氯也存在着易水解的问题，水解后的氰尿酰氯即失去活化PEG的能力，此外活化后修饰剂的放置时间对其修饰能力产生很大影响，通常情况下，随着活化PEG在冰箱中放置时间的延长，其修饰蛋白质的能力会越来越低，并最终失去修饰能力。另外在制备PEG修饰剂的过程中，随着操作及反应条件的变化，PEG修饰能力也会有较大的差异。所以及时了解和掌握PEG修饰剂修饰蛋白质的能力具有重要的意义。
[0006]目前还没有理想有效的測定各种活化PEG修饰蛋白质的能力的方法的相关报道。常远等(1996)以牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白，采用凝胶电泳法来測定各种活化PEG的修饰能力，但该方法操作麻烦、操作时间长、结果不理想，而且不能定量的检测活化PEG修饰蛋白质的能力。
[0007]本试剂盒发明人发现可以利用修饰剂与蛋白质在一定比例和一定的条件下进行反应，反应结束后，用5，5 —二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，利用分光光度计测定反应后反应体系的吸光值，根据蛋白质经PEG修饰与不经修饰两组反应体系吸光值的差异来检测蛋白质烷基化修饰剂PEG的修饰能力。
[0008]该方法利用氰尿酰氯法活化的蛋白质烷基化修饰剂(例如活化的PEG)带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团(例如-NH2, -SH等)发生烷基化反应，因此蛋白质分子的侧链基团氨基、巯基等在一定的条件下可以与活化的PEG反应，生成PEG-蛋白。以GSH为例，GSH与活化的PEG修饰剂的反应式如下:
【权利要求】
1.一种检测蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括有谷胱甘肽粉剂、蛋白质与修饰剂反应Buffer缓冲液、NaH2PO4溶液、5，5 一二硫代对二硝基苯甲酸显色液。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括: 谷胱甘肽粉剂1.536mgX 10支； Buffer 缓冲液0.lmol/L , 16OmL ； NaH2PO4 溶液3.2mol/L, 250mL ； .5,5 —二硫代对二硝基苯甲酸显色液 1.0mmol/L, 25mL。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述的蛋白质烷基化修饰剂为聚乙二醇。
4.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述的反应Buffer缓冲液按如下组分配制得到: .0.04mol/L 巴比妥钠50.0mL ； .0.2mol/L HCl0.825mL ； 蒸馏水定容至IOOmL ； 然后用PH计调节pH值至9.0。
5.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述的5，5一二硫代对二硝基苯甲酸显色液按如下组分配制得到: DTNB20mg ； 柠檬酸三钠500mg ； 双蒸水溶解并稀释定容至50mL，置于棕色瓶避光4°C保存。
6.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述谷胱甘肽粉剂在每次测定前，取I支用buffer缓冲液定容至5mL，得到1.0mmol/L的GSH溶液。
7.权利要求1或2所述试剂盒的使用方法，其特征在于，使用步骤如下: .51.准备活化的待检测修饰剂和待修饰的蛋白质溶液； .52.检测实验分为两组:按照2:1的摩尔比分别准备SI准备好的修饰剂与蛋白质溶液作为测定组，蛋白质溶液作为对照组； .53.分别将S2测定组中加入权利要求3所述Buffer缓冲液，修饰剂与蛋白质溶液进行反应，反应体系的pH值为9.0、，反应温度为35°C~55°C、反应时间为3(T50min ； .54.分别往S3所述反应体系和对照组中加入5，5一二硫代对二硝基苯甲酸显色液，利用分光光度计测定在波长412nm下两组反应体系的吸光值； .55.根据S4测定的两组吸光值的差异来判断和/或计算出待检测修饰剂对待修饰蛋白质的修饰能力；计算公式为:
^ ^o3 = lg,f.g.ZE.l_ZlggMMI_I_IEggWttjx _。 +” 一 '对照管嚷先_'
8.根据权利要求7所述使用方法，其特征在于，SI所述活化的待检测修饰剂优选的活化方法如下: . 511.用无水苯重结晶三聚氰氯； .512.取Sll处理的三聚氰氯溶解于含无水碳酸钠的无水苯中，加入修饰剂，室温下搅拌过夜后过滤； 取滤液在搅拌下加入乙醚，得白色沉淀，继续搅拌后抽滤，所得沉淀用无水苯溶解；上述沉淀、溶解重复操作多次，直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止； S13.将S12处理的修饰剂真空抽干后密封冷藏保存备用。
9.根据权利要求7所述使用方法，其特征在于，S3所述反应温度为45°C、反应时间为40mino
10.根据权利要求7所述使用方法，其特征在于，所述待修饰的蛋白质溶液浓度为。1.0mmol/L，使用Buffer缓冲 液配制；以谷胱甘肽作为待修饰蛋白质的阳性对照。
【文档编号】G01N21/78GK103575730SQ201310494929
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】陈芳艳, 王林川, 冯定远 申请人:华南农业大学