专利名称：一种金属螯合介质辅助peg修饰蛋白质药物的方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种金属螯合介质辅助PEG修饰蛋白质药物的方法。
背景技术：
聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。 自 1977 年 Abuchowski，Davis (J. Biol. Chem. 1977,252 :3578-3581.)等人首次报道用 PEG 修饰蛋白质以来，PEG修饰技术在生物医学和生物技术领域得到了广泛的应用，PEG已经被广泛地应用于蛋白质，多肽类药物的修饰研究。目前蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性，以及改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一，且已通过FDA认证可用于药物、食品和化妆品。PEG修饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰(包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰)、羧基修饰、巯基修饰等。其中一类是定点修饰， 目前主要包括N末端修饰和半胱氨酸残基修饰。N末端修饰通常是通过PEG-醛类修饰剂与一定量的还原剂如氰基硼氢化钠进行的还原烷化过程。这种修饰反应并不完全是特异性的，蛋白质侧链的赖氨酸残基也会与之反应。在单修饰产物中，修饰在N末端的通常占 80%的比例。而半胱氨酸残基修饰是利用修饰剂与蛋白分子的游离巯基发生反应进行，如 MAL-PEG，这种反应的特异性非常好。但是有些蛋白是不含巯基的，这就要通过基因工程的手段对蛋白进行定点突变。另一类修饰反应是在蛋白质赖氨酸的ε氨基上进行的修饰，反应是随机修饰，因为蛋白质通常含有多个赖氨酸残基且通常位于蛋白表面，因此易与PEG修饰剂发生反应， 反应迅速，修饰率高。但是由于是随机修饰，所以修饰产物比较复杂，单修饰产物的位点不均一，这些异构体的生物活性往往各不相同，导致生产时难以实现批次间的稳定，不符合药物生产的要求，并且由于随机修饰可能造成蛋白的活性中心也被修饰而导致蛋白结构的破坏和生物活性的丧失。针对以上存在的缺点，有人提出了一种新的修饰策略即用固相介质来辅助PEG 修饰蛋白质。这种偶联反应模式有望克服液相偶联反应模式中产物复杂的缺点，与液相反应不同，固相辅助修饰模式中蛋白质被吸附于固体表面，使得蛋白质与聚乙二醇修饰剂反应的表面积大大减小，从而可以通过控制介质的配基密度来控制蛋白质的平均修饰度和减少产物复杂性。因此利用固相介质辅助修饰可提高修饰反应的可控性和选择性，即利用介质的吸附特意性和空间位阻来获得修饰度和修饰位点更均一的修饰偶联物。目前已有报道，Α· M. Felix 禾口 E. K. Lee等(Peptides and Polynucleotides,Aachen,Federal Republic of Germany, 2004. October 19-22.)介绍了使用离子交换介质来吸附蛋白质进行干扰素的PEG修饰，结果发现，蛋白质在介质表面的定位仍然是随机的，固相修饰反应相对于传统的液相反应也没有明显的修饰位点选择性。在2007年E. K. Lee等人(Bioconjugate Chem. 2007，18，1728-1734.)使用聚乙二醇醛在离子交换介质上进行干扰素的PEG修饰，最后得到了 N-末端修饰的产物，但是因为它使用的是特异性的聚乙二醇修饰剂，并没有很好的体现出固相介质修饰的优势，也没有解决非特异性修饰剂修饰位点不均一的问题。金属螯合介质是目前应用非常广泛的一种介质，多种金属离子都可以和组氨酸标签(His-tag)发生特殊的吸附作用，包括Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等，其中以镍离子使用最为广泛。因此带有His-tag的蛋白质被介质表面的金属离子的吸附是定点吸附，而不是离子交换介质的多位点吸附，因此，采用金属螯合介质辅助PEG对蛋白进行修饰，可以达到定点修饰的目标，并且，也可以通过蛋白与金属螯合介质吸附位点的选择来保护蛋白的活性位点使其免被随机修饰而丧失活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种金属螯合介质辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，所述方法包括以下步骤1)对要修饰的目标蛋白的活性中心引入组氨酸标签；2)将蛋白质吸附到金属螯合介质上；3)用PEG修饰剂修饰吸附在金属螯合介质上的蛋白质；以及4)对修饰产物进行纯化。所述的金属螯合介质螯合的金属离子为镍离子、铜离子、镁离子、钙离子或钴离子，优选为镍离子。所述的PEG修饰剂是mPEG-SC或Y型mPEG_NHS，其分子量范围是1000-40000。其中，蛋白和聚乙二醇修饰剂摩尔比为1 1-1 8。具体地，本发明的方法包括首先将要修饰的蛋白置换到修饰缓冲液中，并吸附到装有金属螯合介质的层析柱上，然后用修饰缓冲液进行平衡。加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和聚乙二醇修饰剂摩尔比为1 1-1 8，所述缓冲液为0.02-0.2mol/LTriS-HCl或磷酸缓冲液PBS，pH7-9，4°C下进行恒温修饰反应。根据本发明的方法，选择的蛋白可以是活性中心带有组氨酸标签的蛋白，如本发明的实施例选择的蛋白是葡激酶，由于葡激酶的N端带有组氨酸，而且N端也正是葡激酶的活性中心，所以利用其N端的组氨酸吸附到金属螯合介质上后加入修饰剂修饰蛋白，可以避免其活性中心被修饰，从而最大限度的保留葡激酶的生物活性。对于自身没有组氨酸标签的蛋白，或者在需要保护的活性中心等关键位置缺乏组氨酸标签的蛋白，可以通过常规的分子生物学手段在相应位置上引入组氨酸标签，当修饰结束后同样可以用分子生物学方法将引入的组氨酸标签从蛋白上切下，以免其受到组氨酸的影响而导致蛋白活性的损失。目前，Novagen公司的PET载体系列有很多是带有组氨酸标签的，只要按照要求设计好引物后把目标蛋白的碱基序列连接到载体后就可以使表达的蛋白带有组氨基酸标签。不同的载体可以分别满足在目标蛋白的N端，C端以及中间位置添加组氨酸的要求。本发明提供的方法相对于传统的液相修饰方法，金属螯合介质辅助PEG修饰能够达到修饰位点更加均一的目的，同时通过对目标蛋白的活性中心引入组氨酸标签的方法，可以在修饰的时候使蛋白的活性中心被保护而不被PEG修饰，从而能最大程度的保留蛋白的生物活性，这也是液相修饰所不能实现的优点。因此，本发明提供的方法能够在PEG修饰蛋白质药物的制备中发挥更大的应用潜力。
图1-1、图1-2纯化后的金属螯合辅助PEG修饰葡激酶的单修饰产物的凝胶过滤检测谱图。图2葡激酶原蛋白、金属螯合辅助PEG修饰葡激酶的单修饰产物以及液相PEG修饰葡激酶的单修饰产物经胰蛋白酶酶切后的肽图。 图3金属螯合辅助PEG修饰葡激酶的单修饰产物以及液相PEG修饰葡激酶的单修饰产物的生物活性比较。图4金属螯合辅助PEG修饰重组葡激酶、液相PEG修饰重组葡激酶均一性的比较。
具体实施例方式实施例11、金属螯合辅助PEG修饰重组葡激酶将葡激酶置换到0. 05mol/L的磷酸修饰缓冲液中，pH7. 5，然后吸附到装有镍离子螯合介质的层析柱上，用修饰缓冲液进行平衡。加入mPEG-SC20000，葡激酶和 mPEG-SC20000修饰剂的摩尔比为1 8，4°C条件下反应8小时。修饰结束后用洗脱缓冲液 0. 05mol/L磷酸加0. 5mol/L咪唑溶液进行洗脱，得到修饰混合物。2、液相PEG修饰重组葡激酶把葡激酶溶解于50mM/L磷酸，pH7. 5的溶液中，加入mPEG-SC20000，mPEG-SC20000 修饰剂与葡激酶的摩尔比为8 1，迅速溶解修饰剂并充分振荡混合均勻，4°C反应8小时。3、金属螯合辅助PEG修饰的重组葡激酶和液相PEG修饰的重组葡激酶的纯化凝胶排阻色谱法分别纯化修饰后单修饰产物用Hiload Superdex200 16/30 prep grade预装凝胶过滤柱在AKTA purifier蛋白纯化仪上进行单修饰产物纯化，流动相为50mM磷酸加0. IM Na2SO4, pH7. 0，平衡1个柱体积以上，上样lmL，流速lmL/min，紫外检测^Onm，收集洗脱峰，再通过50mMPB，pH7. O溶液透析去除小分子干扰物质。纯化后的金属螯合辅助PEG修饰葡激酶的单修饰产物的凝胶过滤检测谱图如图1 所示，由图可知纯化后的两种单修饰产物的纯度均大于95%。实施例2、金属螯合辅助PEG修饰的重组葡激酶、液相PEG修饰的重组葡激酶以及葡激酶原蛋白的胰蛋白酶酶切后肽图分析比较将葡激酶原蛋白、液相修饰中的单修饰产物以及金属螯合辅助PEG修饰的单修饰产物对含2. OM脲的0. 05M的NH3HCO3 (pH 8. 2)充分透析，然后经超滤浓缩至浓度为1. Omg/ mL。取胰蛋白酶，用超纯水配制浓度为1.0mg/mL的储液。按照蛋白酶和葡激酶的质量比为 1 50加入胰蛋白酶储液，混合物在37°C下孵育11小时，消解产物在Agilent 1100系统， 利用资生堂ftOteonavi柱(4. 6mmX 250mm)进行肽段分离。柱子用95%的溶液(含0. TFA的超纯水)A和5 %的溶液B (含0. 1 % TFA的乙腈)充分平衡，流速为0. 5mL/min。洗脱梯度为在100分钟内溶液B从5% B升至50% B。
结果如图2所示，结果表明金属螯合辅助PEG修饰葡激酶的方法很好的保护了葡激酶的N端，使之没有被PEG修饰，而液相修饰中，部分葡激酶的N端已被PEG修饰。实施例3、金属螯合辅助PEG修饰的重组葡激酶、液相PEG修饰的重组葡激酶、葡激酶原蛋白以及带有组氨酸标签的葡激酶原蛋白的生物活性的比较1)称取IOOmg重组人纤维蛋白原，溶于25mL的Tris-HCl溶液中；2)称取250mg的琼脂糖，加入到25mL的Tris-HCl溶液中，浓度为1 % (W/V)，于 60°C的水浴中加热溶解；3)将溶解的琼脂糖在室温下冷却，至约45°C ；4)取20 μ L的凝血酶溶液，加入到25mL新鲜配置的重组人纤维蛋白原溶液中，迅速混勻；5)将凝血酶/重组人纤维蛋白原溶液迅速加入到琼脂糖溶液中，混勻，倒入2个平板中，室温放置30min，待琼脂糖凝固后，打孔准备加样；6)用Tris-HCl将尿激酶稀释浓度分别为1，5，10，20，40，80IU/mL，每孔加样 15 μ L，作为标准曲线；7)用Bradford法测定样品的蛋白质浓度，作2倍系列稀释，分别加入到琼脂孔中， 每孔加样15yL ；8)将平板于37°C下倒置在培养箱中培养，直至有清晰的溶圈出现，用游标卡尺测定各溶圈直径，根据标准曲线，计算蛋白的活性。测定结果如图3所示，表明液相修饰的单修饰产物和金属螯合辅助PEG修饰的单修饰产物的的生物活性，分别是带组氨酸标签的葡激酶原蛋白的50%和72%。而带组氨酸标签的葡激酶原蛋白的生物活性是不带标签的葡激酶原蛋白活性的90%。这说明金属螯合辅助修饰能够更好的保护葡激酶的活性中心不被修饰，从而能够更好的保留葡激酶的生物活性。实施例4、金属螯合辅助PEG修饰重组葡激酶、液相PEG修饰重组葡激酶均一性的比较实施例1中得到的固相修饰和液相修饰的混合物样品每种取20ul进行常规的 SDS-PAGE蛋白电泳，并通过考马斯亮蓝进行染色。如图4所示，液相修饰混合物中成分相当复杂，单修饰，二修饰，多修饰都有。相比较而言，固相修饰的混合物中，除了未修饰的蛋白， 就只有单修饰产物。这充分显示了固相修饰的均一性。
权利要求
1.一种金属螯合介质辅助PEG修饰蛋白质药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)对要修饰的目标蛋白的活性中心引入组氨酸标签；2)将蛋白质吸附到金属螯合介质上；3)用PEG修饰剂修饰吸附在金属螯合介质上的蛋白质；以及4)对修饰产物进行纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属螯合介质螯合的金属离子为镍离子、铜离子、镁离子、钙离子或钴离子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金属螯合介质螯合的金属离子为镍1 子。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PEG修饰剂是mPEG-SC或Y型 mPEG-NHS，其分子量范围是1000-40000。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，吸附在金属螯合介质上的蛋白质和PEG修饰剂摩尔比为1 1-1 8。
全文摘要
本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种金属螯合介质辅助PEG修饰蛋白质药物的方法。所述方法包括以下步骤1)目标蛋白的活性中心引入组氨酸标签；2)将蛋白质吸附到金属螯合介质上；3)用PEG修饰剂修饰吸附在金属螯合介质上的蛋白质；4)对修饰产物进行纯化。本发明提供的方法相对于传统的液相修饰方法，能够达到修饰位点更加均一的目的，同时通过对目标蛋白的活性中心引入组氨酸标签的方法，可以在修饰的时候使蛋白的活性中心被保护而不被PEG修饰，从而能最大程度的保留蛋白的生物活性，因此，本发明提供的方法能够在PEG修饰蛋白质药物的制备中发挥更大的应用潜力。
文档编号C07K1/107GK102453076SQ201010514558
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者刘永东, 王俊, 胡涛, 苏志国, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所