小泛素样修饰的生物检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种小泛素样修饰的生物检测方法，通过构建小泛素样修饰蛋白与绿色荧光蛋白的基因融合体，将基因融合体与目标蛋白在细胞内的共表达再通过免疫沉降的方法收集目标蛋白，最后对目标蛋白进行单分子检测是否发生小泛素样修饰。该方法在免疫沉降收集到目标蛋白之后即进行洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上100nm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。
【专利说明】小泛素样修饰的生物检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种小泛素样修饰的生物检测方法。
【背景技术】
[0002]小泛素样修饰是一种广泛存在于细胞内的蛋白质翻译后修饰行为。异常小泛素样修饰会导致神经退行性疾病、癌症、心脑血管疾病等多种疾病的发生。虽然小泛素样修饰调控了细胞内一系列关键生物学行为，但是在胞内目标蛋白中仅有一小部分发生小泛素样修饰，通常这一比例小于 5% (参 Creton, S.; Jentsch, S.Cell 2010，143，848_848el)。这种低丰度的现状极大限制了对小泛素样修饰的检测及生物学功能的研究。
[0003]传统的主要是利用蛋白质印迹的方法来进行小泛素样修饰的鉴定。通常利用免疫沉降方法来富集被小泛素样蛋白修饰的靶标，然后再利用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离，接着进行转膜、封闭、抗体孵育、显影等多个步骤进行小泛素样修饰的鉴定(参Sarge，K.D.;Park-Sarge, 0.K.Methods Mol Biol 2009,590,265-77)。然而蛋白质印迹法需要进行一系列实验操作，实验步骤多，实验周期长，且所使用抗体的滴度和特异性对实验结果的影响较大，灵敏度不高，不利于广泛应用。
【发明内容】
[0004]基于此，有必要提供一种快速、灵敏的小泛素样修饰的生物检测方法。
[0005]一种小泛素样修饰的生物检测方法，包括如下步骤:
[0006]扩增小泛素样修饰蛋白基因，在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因；
[0007]将2.5微克所述融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达，得到含有小泛素样修饰蛋白-绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞，其中，所述细胞是人胚肾细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞或人成骨肉瘤细胞；
[0008]将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体-树脂复合物；
[0009]加入裂解液并破碎所述细胞，得到的细胞裂解液离心后取上清液；
[0010]向所述抗体-树脂复合物中加入所述上清液，孵育，使目标蛋白与所述目标蛋白特异性抗体结合，接着清洗所述抗体-树脂复合物，之后使用与抗体-树脂复合物等体积的PH2.6的浓度为0.lmol/L的甘氨酸溶液洗脱所述抗体-树脂复合物，得到洗脱液；
[0011]对所述洗脱液使用Tris缓冲液稀释100至500倍，得到稀释液；
[0012]使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对所述稀释液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。
[0013]在其中一个实施例中，所述将融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞是使用脂质体转染法。
[0014]在其中一个实施例中，所述破碎细胞的步骤是将被裂解液重悬后的细胞置于超声波细胞粉碎机中，在35-40W的功率下，按照5s破碎-1Os休息-5s破碎的进行lmin。
[0015]上述小泛素样修饰的生物检测方法在破碎细胞并免疫沉降收集目标蛋白之后即洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上IOOnm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，因此可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为一实施方式的小泛素样修饰的生物检测方法的流程图；
[0017]图2为小泛素样修饰蛋白-1与绿色荧光蛋白基因融合体酶切鉴定图，其中泳道I是pUC Mix Marker (MBI公司)，泳道2是基因融合体双酶切产物；
[0018]图3为p53蛋白小泛素样修饰单分子检测结果图。
【具体实施方式】
[0019]下面主要结合附图及具体实施例对小泛素样修饰的生物检测方法作进一步详细的说明。
[0020]如图1所示，一实施方式的小泛素样修饰的生物检测方法包括如下步骤:
[0021]步骤S110，构建小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因的融合体基因，具体包括如下步骤:
[0022]首先使用PCR技术扩增小泛素样修饰蛋白基因；然后在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，使得小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合在一起，从而得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因。
[0023]步骤S120，融合体基因与目标蛋白基因在细胞内共表达，具体包括如下步骤:
[0024]利用脂质体转染法将融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达36-48小时后，即可得到含有小泛素样修饰蛋白-绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞。由于小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合在一起，所以可以通过荧光显微镜来检测小泛素样修饰蛋白的表达情况。
[0025]在本实施方式中，转染所用的细胞是人胚肾细胞，此外，在其他实施方式中，还可以为人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞、人成骨肉瘤细胞。
[0026]步骤S130,目标蛋白的免疫沉降,具体包括如下步骤:
[0027]首先，将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体-树脂复合物。
[0028]其次，使用0.5毫升裂解缓冲液重悬细胞，再利用超声波细胞粉碎机在冷水中进行破碎，破碎功率为35-40W，破碎过程中使用5s破碎-1Os休息-5s破碎的循环共破碎Imin ;离心破碎后的细胞裂解液，取上清液。
[0029]最后向抗体-树脂复合物中加入上清液，在4°C孵育1-2小时，接着使用裂解缓冲液清洗抗体-树脂复合物数次，之后使用与抗体-树脂复合物等体积的0.lmol/L的甘氨酸溶液(pH值为2.6)洗脱抗体-树脂复合物两次，每次5分钟，得到洗脱液。
[0030]步骤S140，小泛素样修饰的单分子检测，具体包括如下步骤:
[0031]使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对洗脱液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。
[0032]由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片IOOnm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，所需的样品量极少，若洗脱液中蛋白浓度较高，则在镜检之前需要先将洗脱物用Tris缓冲液稀释100至500倍，再进行观察。
[0033]上述小泛素样修饰的生物检测方法在破碎细胞并免疫沉降得到目标蛋白之后即进行洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上IOOnm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，因此可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。
[0034]以下为具体实施例部分:
[0035]构建小泛素样修饰蛋白-1基因与绿色荧光蛋白基因的融合体基因:利用5’ -gcagatctcgatgtctgaccaggaggcaaa-3’ /5’ _cggtcgacctaaccccccgtttgttcct_3’ 弓丨物对(SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2,宝生物工程(大连)有限公司合成)以及Eppendorf Mastercyclerpro梯度PCR仪扩增人源小泛素样修饰蛋白-1的基因(SEQ ID NO:3)，扩增步骤为:95°C反应3分钟，95°C变性30秒，58 °C反应30秒，72°C延伸30秒，其中变性/延伸循环30次，最后72°C反应2分钟；扩增产物用BglII和SalI限制性内切酶(宝生物工程(大连)有限公司)进行双酶切并用柱式小量胶回收试剂盒(上海华舜生物技术有限公司)回收；同时，用BglII和SalI双酶切包含有绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP-C2 (Clontech公司)并用柱式小量胶回收试剂盒回收，再将两回收产物用T4连接酶(宝生物工程(大连)有限公司)进行连接，连接总体积为10微升，其中无菌去离子水4微升，小泛素样修饰蛋白-1基因酶切片段3微升，pEGFP-C2载体酶切片段I微升，10倍连接酶缓冲液I微升，T4连接酶I微升，在室温连接2小时。连接结束后，将5微升的连接混合物利用热激转化法转入100微升的DH5a感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)中。转化后的细胞涂布到包含10微克/毫升浓度的卡那霉素的溶菌肉汤培养平板上并在37°C培养箱中培养过夜，直至出现单个肉眼可见的克隆。用无菌牙签挑起单个克隆进行菌落聚合酶链式反应，出现300个碱基大小的扩增片段的克隆为阳性克隆，反之则为无效克隆。挑取正确克隆，并在溶菌肉汤培养基(补充10微克/毫升浓度的卡那霉素)中扩大培养，并用无内毒素中量提取试剂盒(Qiagen公司)制备高纯度的小泛素样修饰蛋白-1与绿色荧光蛋白的基因融合体，提取的基因融合体用BglII和SalI双酶切，酶切产物用2%浓度琼脂糖凝胶进行电泳，结果见图2。
[0036]融合体基因与p53基因在细胞内的共表达:转染前将人胚肾细胞均匀平铺到直径为60毫米的细胞培养皿(Corning公司)中，待细胞密度达到60%左右时即进行转染。转染前吸去旧的培养液，并加入无血清的培养液。利用脂质体(Irwitix)gen公司)转染法将2.5微克的P53蛋白基因和2.5微克融合体基因转入细胞中。转染4小时后，更换成完全培养基。转染16小时之后，将细胞在荧光显微镜下进行观察，如果能观察绿色荧光则表明融合体在细胞内表达，反之则没有；转染24小时之后，再次更换培养液，并继续培养12小时。
[0037]p53蛋白的免疫沉降:将I微克p53蛋白特异性抗体D0_1 (Santa Cruz公司)与20微升50%浓度的蛋白A/G偶联的树脂在4°C孵育2小时，再以1000转每分离心去除未结合的抗体，沉淀下来的抗体-树脂复合物用于后续的免疫沉降实验。同时，将转染的人胚肾细胞从培养皿中吹落下来，再以1000转每分的转速离心5分钟进行收集，并用冷的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲盐液(以下简称Tris-HCl)清洗两次。将细胞进行收集并用I毫升添加了蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl, 150mM氯化钠，20mM_N-乙基马来酰亚胺，0.5%的吐温20，pH值为7.5)进行重悬，再利用scientz-1ID超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)进行破碎，破碎时功率设置为35W，破碎过程中使用5s破碎-1Os休息-5s破碎的循环处理lmin，破碎在冰水浴中进行。破碎后的细胞用12000转每分离心10分钟除去细胞碎片，获得的上清液与抗体-树脂复合物再在4°C孵育I个小时。孵育完毕，用冷的裂解缓冲液清洗树脂三次，最后用与抗体-树脂复合物等体积的浓度为0.1摩尔每升的甘氨酸溶液(pH值为2.6)洗脱树脂两次，每次5分钟，洗脱下来的产物立即用
0.1倍体积的中和缓冲液进行中和。
[0038]p53蛋白小泛素样修饰的单分子检测:中和后的洗脱物不可直接用全内反射荧光显微镜(Andor公司)进行观察，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片100纳米范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，所需的样品量极少。因此，要在单分子水平上观察P53蛋白的小泛素样修饰，需要将洗脱物进行稀释。在观察前，用Tris缓冲盐溶液(25mMTris, 140mM氯化钠，3mM氯化钾，pH值为7.4)稀释洗脱物200倍，再将10微升稀释后的洗脱液滴到玻片(Fisher公司生产，厚度在0.13毫米到0.16毫米之间)上，静置10至20分钟，然后用激发波长为488纳米的激光器(Coherent公司)激发，并用Micro-manager 1.4软件(Andor公司)进行成像。看见荧光分子则表明p53蛋白发生小泛素样修饰，见图3，其中图片I是阴性对照，图片中只有背景信号，图片2中p53蛋白被小泛素样修饰蛋白-1修饰，可见明显的单个荧光点。
[0039]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种小泛素样修饰的生物检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 扩增小泛素样修饰蛋白基因，在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因； 将2.5微克所述融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达，得到含有小泛素样修饰蛋白-绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞，其中，所述细胞是人胚肾细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞或人成骨肉瘤细胞；将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体-树脂复合物； 加入裂解液并破碎所述细胞，得到的细胞裂解液离心后取上清液； 向所述抗体-树脂复合物中加入所述上清液，孵育，使目标蛋白与所述目标蛋白特异性抗体结合，接着清洗所述抗体-树脂复合物，之后使用与抗体-树脂复合物等体积的PH2.6、浓度为0.lmol/L的甘氨酸溶液洗脱所述抗体-树脂复合物，得到洗脱液； 对所述洗脱液使用Tris缓冲液稀释100至500倍，得到稀释液； 使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对所述稀释液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。
2.如权利要求1所述的小泛素样修饰的生物检测方法，其特征在于，所述将融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞是使用脂质体转染法。
3.如权利要求1所述的小泛素样修饰的生物检测方法，其特征在于，所述破碎细胞的步骤是将被裂解液重悬后的细胞置于超声波细胞粉碎机中，在35-40W的功率下，按照5s破碎-1Os休息-5s破碎的循环进行Imin。
【文档编号】G01N33/68GK103630691SQ201210305464
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月24日 优先权日:2012年8月24日
【发明者】张春阳, 杨用 申请人:中国科学院深圳先进技术研究院