c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选系统及筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选系统，包括c-Cbl蛋白、荧光分子标记的ZAP-70蛋白、荧光分子标记泛素-UbCH7蛋白，三者的摩尔比为(0.4μM～2μM)：(0.4μM～2μM)：(20nM～40μM)。本发明还公开了一种c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选方法。本发明c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选方法可以准确、有效地筛选c-Cbl蛋白泛素化抑制剂，为筛选代谢性相关疾病的药物打下良好的基础，具有良好的工业应用前景。
【专利说明】
c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选系统及筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及C-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选系统和筛选方法。
【背景技术】
[0002]Cbl (Casitas B-1ineage lymphoma)蛋白是一类在生物体内广泛分布的细胞内蛋白，属于泛素连接酶E3系。c-Cbl在细胞内广泛表达，但主要存在于细胞质中。c-Cbl由N-端高度保守的酪氨酸激酶结合功能域(Tyrosine kinase binding domain,TKB)、环状功能域(RING)、富含脯氨酸功能域、C-端与泛素结合(Ubiquitin_associated,UBA)的功能域及与之重叠的亮氨酸拉链功能域组成。c-Cbl分子中的TKB及其他功能域可以识别并结合靶蛋白，RING功能域负责募集泛素结合酶E2，从而启动泛素化降解途径。c-Cbl通过调控信号蛋白参与细胞内信号转导的负向调控，这对于维持细胞的内稳态具有重要作用。
[0003]2型糖尿病(旧称非胰岛素依赖型糖尿病或成人糖尿病)，是一种严重的代谢性疾病，患者的主要特征为胰岛素抵抗、相对胰岛素缺乏和高血糖，常需要给予药物或胰岛素治疗，但也可通过增加体育运动和膳食控制病情。在发达国家，近年来2型糖尿病患者数迅速增加，美国疾病控制和预防中心已将2型糖尿病归入流行病之一。2型糖尿病过去在40岁以上的成年人中发病，而今越来越多的未成年人也身患此病，其原因可能是由于该年龄段的高肥胖率所致，2型糖尿病常与肥胖、高血压、高胆固醇(混合型高血脂症)以及“代谢综合征”(又称X综合症、Reavan’ s综合征、CHAOS综合症)相关，同时也与肢端肥大、柯兴氏综合征以及许多其他内分泌疾病相关。2型糖尿病复杂且多因素的代谢改变常导致多个器官的损伤和功能损害，其中最重要的累及部位即是心血管系统，导致患者心血管疾病发病率和死亡率显著上升，因此2型糖尿病已成为当前严重的世界性问题并引起了众多医生以及科研人员的关注，特别是对胰岛素的敏感度降低以及糖脂代谢的研究更是目前国际关注的热点之一。在过去的几十年里，一系列调控食欲、食物吸收以及增加肌肉组织或脂肪组织能量消耗的基因陆续被发现，其中c-Cbl基因就参与了全身能量消耗的调控。2004年CooneyGJ研究发现，c-Cbl在调控全身能量平衡中起着重要的作用。2006年，该组进一步发现证明c-Cbl通过调节胰岛素敏感度参与了全身能量平衡的调控以及c-Cbl泛素连接酶E3功能域参与了身体能量平衡的调控。
[0004]综上，c-Cbl蛋白功能域参与了机体能量平衡的调控，是潜在的治疗代谢性相关疾病的药物靶点，然而目前对c-Cbl蛋白抑制剂的研究尚为空白。如果我们能成功筛选出抑制c-Cbl蛋白的抑制剂，那么通过抑制c-Cbl蛋白对身体能量平衡的调控，将可以增加机体氧气消耗量，胰岛素敏感度以及能量消耗量，从而有效降低体重以及调控其机体能量平衡，同时本研究将有助于鉴定和确证c-Cbl蛋白作为新的药物靶点的可能性，有助于阐明c-Cbl的某些病理生理学意义，对于治疗糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的新型药物研发以及为靶向c-Cbl蛋白的药物研发提供科学依据和实践指导。
[0005]基于荧光共振能量转移的检测技术是近年来被应用于药物高通量筛选(HTS)的重要方法之一。荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移，FRET)。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光(敏化荧光)，也可以不发荧光(荧光猝灭)，同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明提供了一种c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选系统和筛选方法。
[0007]本发明c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选系统，包括c-Cbl蛋白、荧光分子标记的ZAP-70蛋白、荧光分子标记泛素-UbCH7蛋白，三者的摩尔比为(0.4μΜ?2μΜ):(0.4 μ M ?2 μ Μ): (20ηΜ ?40 μ Μ)。
[0008]ΖΑΡ-70 蛋白:ξ 链连接蛋白(Zap-70)。
[0009]UbCH7蛋白:泛素连接酶蛋白。
[0010]所述荧光分子标记的ZAP-70蛋白为铕荧光标记的ZAP-70蛋白。
[0011]所述铕荧光标记的ZAP-70蛋白按照如下方法制备:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白在室温下孵育10?30分钟，即可。
[0012]所述抗-651^113+-抗体与651'-2六卩70蛋白摩尔比为2?6:1，优选4:1。
[0013]所述荧光分子标记的泛素_UbCH7蛋白为別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素-UbCH7蛋白。
[0014]所述別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白按照如下方法制备:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub-UbCH7蛋白在室温下孵育10?30分钟。
[0015]所述抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白的摩尔比为10?30:1，优选20:1。
[0016]本发明c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选方法，包括如下步骤:
[0017](I)取ZAP-70蛋白和泛素-UbCH7蛋白，分别用荧光标记，得荧光分子标记的ZAP-70蛋白、荧光分子标记泛素_UbCH7蛋白，混合，得混合溶液；
[0018](2)取待测样品，加入c-Cbl蛋白溶液，再加入步骤(I)所得混合溶液混合，测定荧光值；
[0019](3)根据荧光值，判断待测化合物是否为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂。
[0020]所述荧光分子标记的ZAP-70蛋白为铕荧光标记的ZAP-70蛋白。
[0021]将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白在室温下孵育10?30分钟，即可。
[0022]所述抗-651^113+-抗体与651'-2六?70蛋白摩尔比为2?6:1，优选4:1。
[0023]所述荧光分子标记的泛素_UbCH7蛋白为別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素-UbCH7蛋白。
[0024]所述別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白按照如下方法制备:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub-UbCH7蛋白在室温下孵育10?30分钟。
[0025]所述抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白的摩尔比为10?30:1，优选20:1。
[0026]步骤(I)中，所述混合溶液中，荧光分子标记泛素_UbCH7蛋白的浓度为I?5 μ M，终浓度为0.4μΜ?2μΜ ;荧光分子标记的ΖΑΡ-70蛋白的浓度为20ηΜ?40ηΜ。
[0027]步骤⑵中，所述待测样品的浓度为5μΜ?15μΜ。优选地，所述待测样品的浓度为 10 μ Μ。
[0028]步骤⑵中，所述待测样品的浓度为0.4 μ M?2 μ Μ。
[0029]步骤⑵中，所述待测样品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的体积比为(0.5?1.5): (1.5?2.5): (1.5?2.5)。优选地，所述待测样品、c_Cbl蛋白溶液和混合溶液的体积比为1:2:2。
[0030]本发明根据c-Cbl蛋白(E3)与泛素化_UbCH7蛋白(E2)结合进而将泛素蛋白转移给其底物ZAP70蛋白这一泛素化过程，用荧光(铕和別藻蓝蛋白)标记泛素化_UbCH7蛋白以及ZAP70蛋白，以荧光共振能量转移技术对待测化合物进行高通量筛选以确证待测化合物对c-Cbl泛素化的抑制作用。
[0031]本发明高通量筛选方法，利用荧光共振能量转移技术筛选c-Cbl蛋白泛素化抑制齐U，Z因子达到0.62，可信度高，稳定性好，准确度高，操作简便，成本低廉，应用前景良好。
[0032]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0033]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1荧光共振能量转移实验示意图；
[0035]图2荧光共振能量转移实验温度稳定性测定；
[0036]图3荧光共振能量转移实验DMSO稳定性测定；
[0037]图4荧光共振能量转移实验时间稳定性测定；
[0038]图5荧光共振能量转移实验质量评估。
【具体实施方式】
[0039]缩略语:生物素-泛素-标记的UbCH7蛋白:B1tin-Ub-UbCH7 ;铕荧光标记ZAP-70:Eu-ZAP70 ;別藻蓝荧光蛋白:APC。
[0040]抗-GST-Eu3+-抗体、GST-ZAP70蛋白、抗-B1tin-APC 抗体、B1tin-Ub_UbCH7 蛋白，均为市售品。
[0041]实施例1c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选
[0042]1、实验材料
[0043]铕荧光标记ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得EU-ZAP70。
[0044]別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得APC-Ub-UbCH7。
[0045]2、筛选方法
[0046]用10% DMSO制备终浓度为10 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为0.4μ M的C-Cbl蛋白的溶液。将20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的终浓度为20nM。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0047]若待测化合物抑制50%的荧光信号，则为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0048]突光共振能量转移实验示意图如图1所示。
[0049]实施例2c_Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选
[0050]1、实验材料
[0051]铕荧光标记ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得EU-ZAP70。
[0052]別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得APC-Ub-UbCH7。
[0053]2、筛选方法
[0054]用10% DMSO制备终浓度为10 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为0.4μΜ的C-Cbl蛋白的溶液。将20μ1 C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的终浓度为40nM。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0055]若待测化合物抑制50%的荧光信号，则为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0056]实施例3c_Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选
[0057]1、实验材料
[0058]铕荧光标记ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比2:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得EU-ZAP70。
[0059]別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得APC-Ub-UbCH7。
[0060]2、筛选方法
[0061]用10% DMSO制备终浓度为15 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为2 μ M的C-Cbl蛋白的溶液。将20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的终浓度为2 μ M，EU-ZAP70蛋白的终浓度为20ηΜ。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0062]若待测化合物抑制50%的荧光信号，则为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0063]实施例4c_Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选
[0064]1、实验材料
[0065]铕荧光标记ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得EU-ZAP70。
[0066]別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得APC-Ub-UbCH7。
[0067]2、筛选方法
[0068]用10% DMSO制备终浓度为10 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为2 μ M的C-Cbl蛋白的溶液。将20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的终浓度为2 μ M，EU-ZAP70蛋白的终浓度为40ηΜ。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0069]若待测化合物抑制50%的突光信号,则为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0070]实施例5c_Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选
[0071]1、实验材料
[0072]铕荧光标记ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得EU-ZAP70。
[0073]別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟，即得APC-Ub-UbCH7。
[0074]2、筛选方法
[0075]用10% DMSO制备终浓度为10 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为0.6μ M的C-Cbl蛋白的溶液。将20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的终浓度为I μ M，Eu_ZAP70蛋白的终浓度为30nM。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0076]若待测化合物抑制50%的突光信号,则为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0077]实施例6c_Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选
[0078]1、实验材料
[0079]铕荧光标记ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比2:1进行混合，在室温下孵育10分钟，即得EU-ZAP70。
[0080]別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比10:1进行混合，在室温下孵育10分钟，即得APC-Ub-UbCH7。
[0081]2、筛选方法
[0082]用10% DMSO制备终浓度为5 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为0.4 μ M的C-Cbl蛋白的溶液。将20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的终浓度为20ηΜ (。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0083]若待测化合物抑制50%的荧光信号，则为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0084]实施例7c_Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选
[0085]1、实验材料
[0086]铕荧光标记ZAP-70蛋白生成EU-ZAP70:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比6:1进行混合，在室温下孵育30分钟，即得EU-ZAP70。
[0087]別藻蓝荧光蛋白(APC)标记生物素-泛素_UbCH7蛋白(B1tin-Ub_UbCH7)生成APC-Ub-UbCH7:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比30:1进行混合，在室温下孵育30分钟，即得APC-Ub-UbCH7。
[0088]2、筛选方法
[0089]用10% DMSO制备终浓度为15 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为0.4μ M的C-Cbl蛋白的溶液。将20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的终浓度为40nM。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0090]实验例8本发明方法的参数优选实验
[0091]1、实验方法
[0092](I)将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0093](2)将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0094](3)配置终浓度为0.4 μ M的c-Cbl的溶液。将20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC-Ub-UbCH7蛋白Eu_ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC-Ub-UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，Eu_ZAP70蛋白的终浓度为40nM。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在20，25，30，40以及50°C下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液，于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0095]2、实验结果
[0096]实验结果如图2所示，实验所测的荧光值随温度的改变而改变，当温度达到30°C时，所测的荧光值下降到20°C时的80%左右；当温度达到40°C时，所测的荧光值下降到20°C时的70%左右；当温度达到50°C时，所测的荧光值下降到20°C时的50%左右。
[0097]因此，本发明高通量筛选的温度应当不高于40°C，优选为室温(20±5°C )。
[0098]实验例9本发明方法的参数优选实验
[0099]1、实验方法
[0100](I)将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0101](2)将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub-UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0102](3)将10 μ I终浓度为0，2，5，10以及30%的DMSO (ν/ν)加入96孔板。配置终浓度为0.4 μ M的C-Cbl的溶液。将20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC_Ub_UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的终浓度为40ηΜ。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合,使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0103]2、实验结果
[0104]实验结果如图3所示，实验所测的荧光值随DMSO浓度的增加而增加，当DMSO浓度到达10%时，所测的荧光值被抑制20%左右；当DMSO浓度到达30%时，所测的荧光值被抑制50%左右。
[0105]DMSO用于溶解不易溶解在水中的化合物，因此本发明高通量筛选方法中，DMSO浓度可以为2?10%，定优选为2%。
[0106]实验例10本发明方法的参数优选实验
[0107]1、实验方法
[0108](I)将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0109](2)将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0110](3)将10μ1终浓度为2%的DMS0(v/v)加入96孔板。配置终浓度为0.4μΜ的c-Cbl的溶液。将20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC_Ub_UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的终浓度为40ηΜ。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育O?30分钟(每分钟测定一次样品)，加入200 μ I反应终止液，于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。
[0111]2、实验结果
[0112]实验结果如图4所示，实验所测的荧光值随时间的增加而上升，当实验到达15分钟时，荧光度趋近饱和，此后荧光值一直保持饱和。
[0113]本发明高通量筛选方法中，反应时间不高于15min,优选为10分钟。
[0114]以下用实验例的方式说明本发明的有益效果:
[0115]实验例I本发明方法的可信度
[0116]1、实验方法
[0117](I)将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0118](2)将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub-UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0119](3)将10μ1终浓度为2%的DMS0(v/v)加入96孔板。配置终浓度为0.4μΜ的c-Cbl的溶液。将20 μ I c-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ I APC_Ub_UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的终浓度为40ηΜ。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合,使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。重复上述实验，将不同批次的实验结果进行比较，计算Z因子的数值。
[0120]Z因子=1_3(σρ+ση)/| μρ-μη|)进行计算，其中σ =标准差，ρ =信号，η =背景)，得到该极化荧光实验的Z因子数值。
[0121]2、实验结果
[0122]实验结果如图5所示，FRET实验的有效剂量窗口为?12000RFu，信噪比高，重复性好，可用于高通量筛选。
[0123]同时，Z因子达到0.62，说明本发明方法可信度高，稳定性好，准确度高。
[0124]实验例2采用本发明方法筛选化合物
[0125]1、实验方法
[0126](I)将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比4:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0127](2)将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub_UbCH7蛋白以摩尔比20:1进行混合，在室温下孵育20分钟。
[0128](3)用10% DMSO制备终浓度为10 μ M待测化合物。将10 μ I待测化合物加入96孔板。配置终浓度为0.4 μ M的C-Cbl的溶液。将20 μ I C-Cbl蛋白溶液加入96孔板。将20 μ IAPC-Ub-UbCH7蛋白EU-ZAP70蛋白的混合溶液加入96孔板中，混合溶液中，APC_Ub_UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M，EU-ZAP70蛋白的终浓度为40ηΜ。震动96孔板30秒充分混匀反应液后在室温下孵育10分钟，加入200 μ I反应终止液,于测试前震动96孔板30秒使溶液充分混合，使用ZS-2读板器对样品荧光值进行读取。若待测化合物抑制50%的荧光信号，则为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0129]2、实验结果
[0130]利用荧光共振能量转移通过对10，000中药化合物进行c-Cbl泛素化抑制的高通量筛选，得到28个c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的备选药物。
[0131]综上，c-Cbl蛋白参与了机体能量平衡的调控，是潜在的治疗代谢性相关疾病的药物靶点，本发明c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的筛选方法可以准确、有效地筛选c-Cbl蛋白泛素化抑制剂，为筛选代谢性相关疾病的药物打下良好的基础，具有良好的工业应用前景。
【权利要求】
1.一种C-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选系统，其特征在于:包括C-Cbl蛋白、荧光分子标记的ZAP-70蛋白、荧光分子标记的泛素_UbCH7蛋白，三者的摩尔比为(0.4 μ M?2 μ Μ): (0.4 μ M ?2 μ Μ): (20ηΜ ?40 μ Μ)。
2.根据权利要求1所述的筛选系统，其特征在于:所述荧光分子标记的ΖΑΡ-70蛋白为铕荧光标记的ΖΑΡ-70蛋白； 优选地，所述铕荧光标记的ΖΑΡ-70蛋白按照如下方法制备:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比为(2?6):1的比例混合，在室温下孵育10?30分钟，即可；进一步优选地，所述摩尔比为4:1，孵育时间为20min。
3.根据权利要求1所述的筛选系统，其特征在于:所述荧光分子标记的泛素_UbCH7蛋白为別藻蓝荧光蛋白(APC)标记的生物素-泛素_UbCH7蛋白； 优选地，所述別藻蓝荧光蛋白标记的生物素-泛素-UbCH7蛋白按照如下方法制备:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub-UbCH7蛋白，以摩尔比为(10?30):1的比例混合，在室温下孵育10?30分钟；进一步优选地所述摩尔比为20:1，孵育时间为20min。
4.一种c-Cbl蛋白泛素化抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)取ZAP-70蛋白和泛素-UbCH7蛋白，分别用荧光标记，得荧光分子标记的ZAP-70蛋白、荧光分子标记的泛素_UbCH7蛋白，混合，得混合溶液； (2)取待测样品，加入c-Cbl蛋白溶液，再加入步骤(I)所得混合溶液混合，测定荧光值； (3)根据荧光值，判断待测化合物是否为c-Cbl蛋白泛素化抑制剂。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于:步骤(I)中，所述荧光分子标记的ZAP-70蛋白为铕荧光标记的ZAP-70蛋白； 优选地，所述铕荧光标记的ZAP-70蛋白按照如下方法制备:将抗-GST-Eu3+-抗体与GST-ZAP70蛋白以摩尔比为(2?6):1的比例混合，在室温下孵育10?30分钟，即可；进一步优选地，所述摩尔比为4:1，孵育时间为20min。
6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于:步骤(I)中，所述荧光分子标记的泛素-UbCH7蛋白为別藻蓝荧光蛋白(APC)标记的生物素-泛素_UbCH7蛋白； 优选地，所述別藻蓝荧光蛋白(APC)标记的生物素-泛素_UbCH7蛋白按照如下方法制备:将抗-B1tin-APC抗体与B1tin-Ub-UbCH7蛋白，以摩尔比为(10?30):1的比例混合，在室温下孵育10?30分钟；进一步优选地，所述摩尔比为20:1，孵育时间为20min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述混合溶液中，荧光分子标记泛素_UbCH7蛋白的终浓度为0.4 μ M?2 μ M ;荧光分子标记的ΖΑΡ-70蛋白的浓度为20ηΜ ?40ηΜ。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述待测样品的浓度为5 μ M ?15 μ M ； 优选地，所述待测样品的浓度为ΙΟμΜ。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述c-Cbl蛋白的浓度为0.4 μ M ?2 μ Μ。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述待测样品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的体积比为(0.5?1.5): (1.5?2.5): (1.5?2.5)；
优选地，所述待测样品、c-Cbl蛋白溶液和混合溶液的体积比为1:2:2。
【文档编号】G01N21/64GK104458681SQ201410491980
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】孙毅毅, 谢兴亮, 钟玲, 林东 申请人:成都医学院