NCoR/SMRT蛋白复合体在调节细胞命运转变中的应用
【技术领域】
[0001] 本技术设及生物技术领域，尤其设及一种通过干扰NCoR/SMRT蛋白复合体的功能 而实现细胞重编程的方法。
【背景技术】
[0002] NcoR/SMRT是属于同一家族的一对具有高度同源性的蛋白因子，在进化上非常保 守，存在于从低等生物到人类的所有物种。他们最早是作为激素受体的共抑制因子而被发 现，可W结合甲状腺激素受体和视黄酸受体，在没有配体的情况下，由受体带到它们的祀基 因上，抑制运些基因的表达。而当激素受体与激素配体相结合，NcoR/SMRT将从受体上解离 下来，激素受体与转录共激活因子如P300相结合，行使转录激活功能。除了激素受体，很多 其他的转录因子也可W和NcoR/SMRT相结合并发挥调节作用。NcoR/SMRT的生理功能非常广 泛。在小鼠胚胎中对化oR/SMRT进行敲除，绝大多数胚胎分别在胚胎第15.5天和第16.5天死 亡，前者死于神经系统，红细胞和胸腺发育障碍;后者则出现了前脑发育不正常，最终致死 原因为屯、力衰竭。敲除实验显示了NcoR/SMRT在神经、造血、屯、脏的发育和功能中起到重要 作用。
[0003] 除了发育中的功能，NcoR/SMRT在表观遗传调控上也起到关键作用。NcoR/SMRT可 W和包括HDAC3在内的几乎所有组蛋白去乙酷化酶化istone deacetylase，皿AC)家族成员 相互作用，调节组蛋白的乙酷化修饰，决定染色质的开放程度。NcoR/SMRT总是W转录抑制 复合体的形式存在并发挥作用，其核屯、成分包括NcoR或SMRT、组蛋白去乙酷酶HDAC3,运两 个组分总是存在于复合体中。其他成分如TBLl ,TOLEl，GPS2，ZBTB3等则根据不同的细胞环 境而选择性存在。作为核屯、成分的HDAC3可W去掉组蛋白的乙酷化修饰，使染色质结构变得 更紧凑，抑制基因的表达。
[0004] 人们长期认为，随着分化过程的进行，动物细胞的多向分化潜能会消失，逐渐限定 为某种特异的功能，运种变化是不可逆的。然而最近的研究表明，体细胞核移植、细胞融合、 过表达胚胎干细胞化mbryonic Stem〔6113)中的^个核屯、转录因子5〇义2,0(：14,1(^4都可 W把体细胞重编程为诱导多潜能干细胞(Pluripotent Stem Cells)。运些发现使人们认识 到细胞内存在一些因子可W决定细胞的命运，通过对运些因子进行调控，就可W控制细胞 的命运，得到人类想要的细胞类型。运种细胞命运的转化为未来更广泛的进行临床上的细 胞替代治疗奠定了基础。人们将来可W通过重编程将体细胞诱导为多能干细胞，进一步分 化为自己想要的细胞类型;也可W通过转分化，使一种细胞直接转变为另一种细胞类型，W 此来获得数量上足够，质量上安全的临床级细胞制品。
[0005] 转分化是人为的对不同细胞命运转变进行调控的一大成功。不同于重编程，转分 化是通过体外操作，直接将一种细胞类型诱导为其他细胞类型，运种转换既可W是同一胚 层细胞间的转换，也可W是跨胚层的细胞命运转变。目前已经有包括=个胚层在内的很多 细胞类型实现了转分化。运些转分化的实现多依赖于不同转录因子的组合，尤其是与目的 细胞命运相关的关键转录因子。当运些关键转录因子被过表达之后，细胞从基因表达到形 态变化都会经历一个转变的过程，最终成为另一种细胞类型。转录因子具有位点识别功能， 它们能特异性的祀定到基因组的某些区域，并招募一系列共同作用因子来实现调控功能。 运些共同作用因子经常形成大的复合物，并可W调控重要的表观遗传修饰，如组蛋白甲基 化或乙酷化，DNA甲基化等等，它们在转分化中的重要性还没有得到很好的研究。
[0006] 除了正常的细胞命运转变过程，癌症的发生可W看做是一种非正常的细胞命运转 变。一种说法认为，癌细胞由正常细胞获得基因变异，变异积累后成为恶性的癌细胞。另一 种说法认为体内存在癌症干细胞，该细胞在正常情况下处于静息状态，不会恶性爆发。而当 环境发生变化后，受到细胞内外综合因素的影响，会无限制的增值，形成肿瘤。运两种说法， 均为从正常状态，向非正常状态转变，而内在的转变因素，是什么原理触发了该种转变，尚 不清楚。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种实现细胞重编程的方法。
[0008] 本发明的内容包括NColVSMRT蛋白复合体在调节哺乳动物细胞命运转变中的应 用，所述哺乳动物细胞尤其是小鼠细胞或人类细胞。
[0009] 进一步地，该应用是通过调节所述NCoR/SMRT蛋白复合体中NCoR/SMRT蛋白或其他 部分，主要是HDAC3的活性或表达水平实现的。
[0010] 进一步地，所述细胞命运转变是a)体细胞到诱导多功能干细胞的退分化过程或b) 从体细胞到其他细胞类型特别是神经细胞、血液细胞、肝脏细胞的转分化过程或C)细胞癌 变等非正常的细胞命运转变过程。
[0011] 另一方面，本发明的内容还包括NCoR/SMRT蛋白复合体在促进成体细胞体外成熟 中的应用。
[0012] 另一方面，本发明的内容还包括一种实现细胞命运转变的方法，，通过干扰NCoR/ SMRT蛋白复合体的功能而实现。
[0013] 进一步地，所述细胞命运转变为细胞重编程。
[0014] 进一步地，所述干扰NCoR/SMRT蛋白复合体的功能的方法包括但不限于基因敲除、 降低其表达水平、添加化学小分子或过表达显性负突变体。
[0015] 进一步地，所述显性负突变体为HDAC3蛋白的显性负抑制突变体。
[0016] 进一步地，所述化学小分子包括但不限于降低NColVSMRT的活性的小分子，调节 HDAC3活性的小分子，和阻断NCoR/SMRT与HDAC3相互作用的小分子。
[0017] 另一方面，本发明的内容还包括调节NCoR/SMRT蛋白复合体的活性或表达水平在 癌症相关药物筛选和癌症治疗中的应用。
[0018] 进一步地，该应用是通过调节NCoR/SMRT蛋白复合体被癌基因 C-Myc招募的过程实 现的。
[0019] 本发明创造通过对一种蛋白复合体的调节，实现了更快更高效的细胞重编程。具 体包括通过降低表达水平、添加化学小分子或过表达显性负抑制蛋白突变体来干扰NCoR/ SMRT共抑制复合体的功能，从而加速体细胞(somatic cel Is)到诱导多功能干细胞(iPSCs) 的重编程过程，并极大的提高重编程的效率。运种重编程包括小鼠细胞、人类细胞、其他物 种细胞。我们预期从体细胞到其他细胞类型如神经细胞，血液细胞，肝脏细胞的转分化过程 中，NCoR/SMRT复合体也将发挥重要功能，通过对其调节，可W达到更快更高效的细胞命运 转变，同时提高目的细胞的质量，如肝脏细胞的解毒功能的成熟。
[0020] 同时，因为NCoR/SMRT与癌基因 C-Myc有密切的相互作用，他们在正常细胞向癌细 胞的非正常转变中也将发挥重要的作用。通过筛选得到的，能调节NCoR/SMRT与C-Myc的相 互作用或调节NCoR/SMRT的活性的小分子，有可能会在未来的癌症治疗中发挥作用。我们也 希望对运一方面进行保护。
[0021] 本发明为再生医学获得高效、优质、快捷的细胞源提供了保障，对于转分化细胞的 移植应用也有重要的帮助。
[0022] 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【附图说明】
[0023] 图1.降低NCoR和SMRT的表达水平可W极大地促进重编程。（A)NCoR和SMRT的ShRNA 引起的重编程效率变化，统计时间为重编程第9天和第16天；（B-C)NCoR和SMRT的ShRNA在血 清加 Vc的条件下对重编程效率的影响；（D)NCoR和SMRT的ShRNA对细胞增殖的影响。
[0024] 图2.敲减HDAC3对重编程效率的影响。（A)筛选另外两个HDAC3的有效shRNA;(B)敲 减皿AC3在一般重编程条件下的作用；（C)敲减HDAC3在添加 Vc重编程条件下的作用；（D)敲 减HDAC3在添加 VPA重编程条件下的作用。
[0025] 图3.HDAC3及突变体在重编程中的作用。（A)皿AC3及突变体的结构示意图；（B) HDAC3及突变体在重编程引起的细胞形态变化；（C)HDAC3及突变体对重编程效率的影响(D) HDAC3突变体对细胞增殖的影响；化)皿AC3突变体在各种条件下对重编程效率的影响； control或者Ctrl为空载体，W下若非说明，均为空载体。
[0026] 图4.皿AC3双突变体在重编程中的作用。左图为突变位点示意图，右图为重编程效 率统计图。Mock为空载体。
[0027] 图5.shNCoR和shSMRT形成的克隆鉴定。（A)shNCoR和shSMRT的iPSCs的细胞形态和 免疫巧光分析；（B)外源重编程因子在iPSCs克隆株的沉默检测；（C)内源多能性基因在 iPSCs克隆株的表达检测；（D)外源因子在iPSCs克隆株基因组上的整合检测；化)iPSCs克隆 株的核型分析;（巧iPSCs克隆株形成的嵌合小鼠。
[002引图6.NCoR/SMRT在重编程过程中于基因组上的结合位点，图上显示了多能性基因