重组笼状蛋白质、其制造方法、贵金属－重组笼状蛋白质复合体、其制造方法、以及重组dna的制作方法

专利名称：重组笼状蛋白质、其制造方法、贵金属－重组笼状蛋白质复合体、其制造方法、以及重组dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用基因重组技术制造的贵金属-重组去铁铁蛋白及其制造方法、以及它的相关技术。
作为把这样的生物技术应用于其它领域的尝试的一种，有在具有保持金属化合物的功能的蛋白质即去铁铁蛋白中加入由金属或金属化合物构成的微粒，制造nm量级的均匀尺寸的微粒的研究。按微粒的用途，把各种金属或金属化合物等导入去铁铁蛋白中的研究在进行着。
这里，就去铁铁蛋白加以说明。去铁铁蛋白是生物界中广泛存在的蛋白质，担负着在生物体内调节必需微量元素即铁的量的任务。铁或铁化合物和去铁铁蛋白的复合体被称作铁蛋白。因为，如果在体内存在必要以上的铁，对生物体就有害，所以用该铁蛋白的形式在体内贮藏过剩的铁分。然后，铁蛋白按需要释放出铁离子，还原为去铁铁蛋白。


图1是表示铁蛋白(铁-去铁铁蛋白复合体)的结构的模式图。如同一图所示，铁蛋白是通过非共价键把24个由一条多肽链形成的单体亚单元集合在一起，形成分子量约46万的球状蛋白质，其直径约为12nm，与通常的蛋白质相比，表现出高的热稳定性和高的pH稳定性。在该球状蛋白质(外壳2)的中心有直径约为6nm的空洞状保持部4，外部和保持部4通过通道3连在一起。例如，当在铁蛋白中加入二价的铁离子时，铁离子从通道3进入，在一部分的亚单元内具有的被称作ferrooxidasecenter(铁氧化活性中心)的场所被氧化后，到达保持部4，在保持部4的内表面的负电荷领域被浓缩。然后，铁原子3000～4000个集合在一起，以铁氢化物(5Fe2O3·9H2O)结晶的形式保持在保持部4内。
另外，在本说明书中，把保持在保持部的含有金属原子的微粒称作“核”。这里，如图1所示的核1的直径与保持部4几乎相等，约为6nm。
另外，把用比较简单的化学操作去掉该核1，把去掉了核1后只剩下外壳2的粒子称作去铁铁蛋白。使用该去铁铁蛋白能制作保持着铁以外的金属或金属化合物的去铁铁蛋白微粒复合体。
到现在为止，有报告显示已经进行了把锰(P.Mackle，1993，J.Amer.Chem.Soc.115，8471-8472；F.C.Meldrum，1995，J.Inorg.Biochem.58，59-68)、铀(J.F.Hainfeld，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，11064-11068)、铍(D.J.Price，1983，J.Biol.Chem.258，10873-10880)、铝(J.Fleming，1987，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，84，7866-7870)、锌(D.Price andJ.G.Joshii，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1982，79，3116-3119)、钴(T.Douglas and V.T.Stark，Inorg.Chem.，39，2000，1828-1830)等金属或金属化合物导入到去铁铁蛋白。由这些金属或金属化合物构成的核1的直径也与去铁铁蛋白的保持部4几乎相等，约为6nm。
在自然界中，含有铁原子的核1在铁蛋白内的形成过程大致如下。
在连接了铁蛋白粒子的外部和内部的通道3(参照图1)的表面上，在pH7-8的条件下，露出带负电荷的氨基酸，带正电荷的Fe2+离子由于静电的相互作用被吸入通道3。在一个去铁铁蛋白中存在八个该通道3。
在去铁铁蛋白的保持部4的内表面上，与通道3的内表面同样，以pH7-8，露出很多带负电荷的氨基酸即谷氨酸残基，从通道3吸入的Fe2+离子在铁氧化活性中心被氧化，再被导入到内部的保持部4。然后，由于静电的相互作用，铁离子被浓缩，形成铁氢化物(5Fe2O3·9H2O)结晶的核。
然后，依次吸入的铁离子附着在该结晶的核上，由氧化铁构成的核成长，在保持部4内形成直径6nm的核1。以上是铁离子的吸入和由氧化铁构成的核的形成的大致过程。
下面，就用于把铁导入到去铁铁蛋白的操作加以说明。
首先，按HEPES缓冲液、去铁铁蛋白溶液、硫酸铵铁(Fe(NH4)2(SO4)2)溶液的顺序，混合各溶液，制作铁蛋白溶液。在该铁蛋白溶液中，各最终浓度为HEPES缓冲液100mmol/L(pH7.0)，去铁铁蛋白0.5mg/mL，硫酸铵铁5mmol/L。另外，用于制作铁蛋白的操作都在室温下进行，用搅拌器进行搅拌。
接着，为了使把铁离子导入去铁铁蛋白内部的反应以及导入的铁的氧化反应结束，把铁蛋白溶液不动地放置一晚。通过该操作，均匀大小的氧化铁被导入去铁铁蛋白的保持部，生成了铁蛋白(去铁铁蛋白和微粒的复合体)。
接着，把铁蛋白溶液放入容器中，用离心分离机，在每分钟3000转、15-30分钟的条件下，进行离心分离，除去沉淀。接着，把除去了沉淀的上清液体以每分钟10000转、30分钟的条件下，进而进行离心分离，使铁蛋白凝聚的不要的集合体沉淀后，除去。这时，铁蛋白以分散的状态存在于上清液体中。
接着，通过透析把该上清液体的溶剂从pH7.0、100mmol/L的HEPES缓冲液置换为150mmol/L的NaCl溶液，制作新的铁蛋白溶液。也可以不进行这里的pH调整。
接着，把该铁蛋白溶液浓缩为1-10mg/mL中的任意浓度后，在该溶液中加入CdSO4，使最终浓度变为10mmol/L，凝集铁蛋白。
接着，在每分钟3000转、20分钟的条件下，对铁蛋白进行离心分离，使溶液中的铁蛋白凝集体沉淀。然后，通过透析，把溶液的缓冲成分置换为加入了150mmol/L的NaCl溶液的pH8.0、10-50mmol/L的Tris缓冲液。
接着，把铁蛋白溶液浓缩后，通过用凝胶过滤柱过滤铁蛋白溶液，除去铁蛋白粒子的凝集体，得到内包了氧化铁的单体铁蛋白。
另外，到此描述了把铁离子导入到铁蛋白的机构以及内包氧化铁的铁蛋白的制作方法，但是，因为到现在为止在报告中提到的其它被导入的金属离子都是正离子，所以可以认为可用与铁离子几乎相同的结构把这些金属离子导入去铁铁蛋白中。因此，能通过基本上与铁离子同样的操作，把其它的金属离子导入去铁铁蛋白中。
可是，去铁铁蛋白，根据其来自的生物种类，能保持的粒子尺寸也有所不同。另外，也存在与去铁铁蛋白具有类似的结构，并在内部能够保持无机物微粒的球壳状蛋白质。其中有来自李氏杆菌的焦磷酸铁铁蛋白和Dps蛋白等。另外，还有不是球状，而是CCMV等病毒的外壳蛋白质等，与铁蛋白同样能够在内部保持无机物粒子的蛋白质。
在本说明书中，将这样的球壳状蛋白质或病毒的外壳蛋白质等，在内部能够保持无机物微粒的蛋白质总称为“笼状蛋白质”。
在这些笼状蛋白质中，也能使之保持含铁的无机物粒子。
虽然，用上述的方法能制作保持了铁等金属离子的铁蛋白，但是，因为去铁铁蛋白以及铁蛋白的通道3的内表面作为整体带负电，所以很难把同样带负电的离子导入去铁铁蛋白内。
而金和白金无法单独在水溶液中离子化，在水溶液中只能作为配位化合物离子而存在，所以，通常使用氯化金酸离子(AuCl4)-和(PtCl4)2-等负离子为多。因此，用以往的技术，很难把金和白金等贵金属导入去铁铁蛋白内。
本发明的目的在于通过改变去铁铁蛋白的内部结构，把金等贵金属原子导入去铁铁蛋白内，进而形成能适用于各种微细结构的贵金属微粒。
由此，能在重组笼状蛋白质的保持部形成尺寸均匀并且是纳米级的贵金属微粒，所以通过例如在衬底上配置贵金属-重组笼状蛋白质复合体，进行除去蛋白质部分等的操作，在衬底上就能形成化学稳定性好的由贵金属构成的微细的粒体。该粒体例如能应用于半导体的制造过程等。
由于所述重组笼状蛋白质是去铁铁蛋白，所以能高效地制作纳米级大小的贵金属微粒。
由于所述贵金属微粒是金或白金，所以能容易地形成粒体。能把制作的微粒应用于单电子晶体管。
通过在所述通道的内表面中应该存在第一谷氨酸(Glu)以及第一天冬氨酸的位置具有分子大小比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸，能防止带负电荷的贵金属的配位化合物离子和通道间产生基于静电的相互作用的斥力。结果，能把贵金属的配位化合物离子导入通道。
通过从丝氨酸、丙胺酸、氨基乙酸中选择所述第一中性氨基酸，能在不破坏重组笼状蛋白质的立体结构的基础上，把贵金属的配位化合物离子导入通道。
通过在所述保持部的内表面中应该存在第二谷氨酸的位置进而具有碱性氨基酸或第二中性氨基酸，能防止带负电荷的贵金属的配位化合物离子和保持部间产生基于静电的相互作用的斥力。特别是当在应存在第二谷氨酸的位置具有碱性氨基酸时，由于该碱性氨基酸所带正电荷，带负电荷的贵金属的配位化合物离子被导入，结果能以高浓度把贵金属的配位化合物离子导入保持部。
通过从精氨酸、赖氨酸、丙胺酸中选择所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸，能在不破坏重组笼状蛋白质的立体结构的基础上，把贵金属的配位化合物离子导入保持部。
通过在所述保持部的内表面存在一个以上与氨基酸取代的半胱氨酸，能有效地还原导入保持部的贵金属的配位化合物离子，能析出贵金属微粒。
通过在所述重组笼状蛋白质的外表面上应该存在半胱氨酸的位置具有比该半胱氨酸的还原功能还小的物质，能防止在重组笼状蛋白质的外表面上，贵金属的配位化合物离子被还原。结果，抑制了在所述重组笼状蛋白质的外表面上析出贵金属微粒，在贵金属-重组笼状蛋白质复合体中，能提高在保持部保持贵金属微粒的收获率。
本发明的贵金属-重组笼状蛋白质复合体具有能保持贵金属微粒的保持部；以及连接了所述保持部和所述重组笼状蛋白质的外部的隧道状通道。
由此，例如通过在衬底上配置贵金属-重组笼状蛋白质复合体，进行除去蛋白质部分等的操作，在衬底上就能形成由贵金属构成的微细的粒体。该粒体例如能应用于半导体的制造过程等。
所述笼状蛋白质可以是去铁铁蛋白。
在外表面上可以保持金或白金粒子。
通过在所述通道的内表面中应该存在第一谷氨酸以及第一天冬氨酸的位置具有分子大小比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸，能防止带负电荷的贵金属的配位化合物离子和通道间产生基于静电的相互作用的斥力，所以能高效地制作贵金属-重组笼状蛋白质复合体。
通过从丝氨酸、丙胺酸、氨基乙酸中选择所述第一中性氨基酸，能在不破坏立体结构的基础上，形成贵金属-重组笼状蛋白质复合体。
通过在所述保持部的内表面中应该存在第二谷氨酸的位置进而具有碱性氨基酸或第二中性氨基酸，能防止带负电荷的贵金属的配位化合物离子和保持部间产生基于静电的相互作用的斥力，所以能高效地制作本发明的贵金属-重组笼状蛋白质复合体。
通过从精氨酸、赖氨酸、丙胺酸中选择所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸，能在不破坏立体结构的基础上，保持贵金属微粒。
通过在所述保持部的内表面存在一个以上与氨基酸置换的半胱氨酸，在含有贵金属离子的溶液中，能容易地形成本发明的贵金属-重组笼状蛋白质复合体。
本发明的重组DNA把具有能保持贵金属的保持部、和连接了所述保持部和所述重组笼状蛋白质的外部的隧道状通道的重组笼状蛋白质的氨基酸的序列编码。
通过该重组DNA，能用蛋白质工程学的办法，大量生产重组笼状蛋白质。
所述重组笼状蛋白质可以是去铁铁蛋白。
所述贵金属微粒可以是金或白金。
通过在所述通道的内表面中应该存在第一谷氨酸以及第一天冬氨酸的位置具有分子大小比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸，能容易地得到该重组蛋白质。
通过从丝氨酸、丙胺酸、氨基乙酸中选择所述第一中性氨基酸，能得到大量用于在保持部上高效地形成贵金属微粒的重组笼状蛋白质。
通过在所述保持部的内表面中应该存在第二谷氨酸的位置进而具有碱性氨基酸或第二中性氨基酸，能得到大量用于在保持部上高效地形成贵金属微粒的均质重组笼状蛋白质。
通过从精氨酸、赖氨酸、丙胺酸中选择所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸，能容易地制作能高效地保持贵金属微粒的重组笼状蛋白质。
通过在所述保持部的内表面存在一个以上与氨基酸取代的半胱氨酸，能容易地制作能更高效地保持贵金属微粒的重组笼状蛋白质。
本发明的重组笼状蛋白质的制作方法包含把位于通道的内表面的第一谷氨酸以及第一天冬氨酸取代为分子大小比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸的过程(a)。
通过该方法，能容易地制作能把贵金属微粒高效地导入通道的重组笼状蛋白质。
所述笼状蛋白质可以是去铁铁蛋白。
在所述过程(a)中，通过从丝氨酸、丙胺酸、氨基乙酸中选择所述第一中性氨基酸，能制作在不破坏重组笼状蛋白质的立体结构的前提下，能把贵金属的配位化合物离子导入通道的重组笼状蛋白质。
通过还含有把所述重组笼状蛋白质内部的保持部内表面上存在的第二谷氨酸取代为碱性氨基酸或第二中性氨基酸的过程(b)，能容易地制作能把贵金属微粒高效地导入保持部的重组笼状蛋白质。
在所述过程(b)中，通过从精氨酸、赖氨酸、丙胺酸中选择所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸，能制作在不破坏重组笼状蛋白质的立体结构的前提下，能把贵金属的配位化合物离子导入保持部的重组笼状蛋白质。
通过进而含有把位于所述保持部的内表面的一个以上的氨基酸取代为半胱氨酸的过程(c)，能有效地还原导入保持部的贵金属的配位化合物离子，能制作使贵金属微粒析出的重组笼状蛋白质。因为，如果贵金属的配位化合物离子被还原，分子大小就减小了，所以能促进把贵金属的配位化合物离子导入保持部。
通过进而含有位于所述重组笼状蛋白质的外表面的一个以上的半胱氨酸替换为比该半胱氨酸还原功能还小的物质的过程(d)，能制作抑制了在外表面上的贵金属的配位化合物离子的还原的重组笼状蛋白质。
本发明的贵金属-重组笼状蛋白质复合体的制造方法包括通过把贵金属的配位化合物离子溶液与重组笼状蛋白质溶液混合，形成贵金属-重组笼状蛋白质复合体的过程(a)；通过使含有在所述过程(a)中制作的含有贵金属-重组笼状蛋白质复合体的溶液通过凝胶过滤柱，从而精制贵金属-重组笼状蛋白质复合体的过程(b)。
通过该方法，通过尺寸能把在外表面上保持了贵金属的重组笼状蛋白质、内包贵金属的重组笼状蛋白质和副反应物分开，所以能选取精制的所希望的贵金属-重组笼状蛋白质复合体。
如上所述，所述过程(a)中的所述贵金属是金或白金，例如能形成在半导体装置的制造过程等中使用的由金或白金构成的粒体，这时，不再需要以往必需的粒体还原过程。
图1模式地表示铁蛋白的结构的图。
图2(a)～(c)是模式地表示本发明的实施例1中的重组去铁铁蛋白的剖面图。
图3是模式地表示在衬底上配置的内包金的去铁铁蛋白的图。
图4是表示在衬底上配置的内包了金的去铁铁蛋白的电子显微镜照片的图。
图5是概要地表示本发明的实施例2中的核苷酸检测装置的图。
图6是表示本发明的实施例3中的由金粒子构成的粒体作为浮动栅极的不挥发性存储器单元的结构的剖面图。
图7(a)～(c)是表示本发明的实施例4的微小结构体的形成过程的剖面图。
图8与本发明的实施例5有关，是使用实施例4中形成的微小结构体的光半导体装置的剖面图。
图9是模式地表示由本发明形成的在外表面和保持部上都保持了贵金属微粒的金-去铁铁蛋白复合体的图。
下面简要说明附图符号。
1—核；2—外壳；3—通道；4—保持部；7—氯化金酸离子(AuCl4)-；7’—金原子；10—核苷酸检测装置；11—衬底；12—金粒子；13—硫醇DNA；15—内包了金的去铁铁蛋白；21-p型Si衬底；22—元件分离氧化膜；23—栅极氧化膜；24—粒体；25—硅氧化膜；26—多晶硅电极；27a—第一n型扩散层；27b—第二n型扩散层；28—层间绝缘膜；29—接触孔；30—钨插头；31a—第一铝布线；31b—第二铝布线；33—金粒子；34—硅衬底；41—硅衬底；42—半导体微细柱；43—绝缘层；44—透明电极；49—绝缘分离层；50—侧方电极；51—p型井；Rqa—量子化领域；61—第一金粒子；62—第二金粒子；63—外壳。
—再结合(重组)去铁铁蛋白的制作—本发明者们认为在把金(Au)原子导入去铁铁蛋白内上主要有以下两个因素成为障碍。
一个因素是氯化金酸离子(AuCl4)-和去铁铁蛋白之间的静电相互作用。在图1所示的铁蛋白(去铁铁蛋白-铁复合体)的通道3的内表面和保持部4的内表面上露出各谷氨酸和天冬胺酸等带负电荷的氨基酸。当把负离子即(AuCl4)-导入去铁铁蛋白内时，由于和这些带负电荷的氨基酸之间的静电相互作用，而被阻碍。
另一个因素是(AuCl4)-的尺寸比铁离子的大。因此，如果不扩大去铁铁蛋白的通道3的尺寸，在物理上就很难把(AuCl4)-导入通道3。
为了解决这些问题，发明者们用基因重组的方法如下地进行了对去铁铁蛋白的改质。以下，在本说明书中，当使用了词汇“重组去铁铁蛋白”时，是指通过基因重组技术导入了变异的去铁铁蛋白。另外，当在本说明书中表示氨基酸残基的部位时，只要不特别指定，就表示来自马的肝脏的去铁铁蛋白的部位。另外，因为去铁铁蛋白由24个单体亚单元构成，所以当在本说明书中写做“去铁铁蛋白的氨基酸序列”时，表示单体亚单元的氨基酸序列。
把来自马的肝脏的去铁铁蛋白编码的基因序列和去铁铁蛋白的氨基酸序列是已知的，并且也已经了解了立体结构。去铁铁蛋白的单体由175残基的氨基酸残基构成，其中第128的天冬胺酸(Asp)和第131的谷氨酸(Glu)都位于通道3的内表面，第58、61、64的各谷氨酸都位于保持部4的内表面。另外，去铁铁蛋白的第1～8的氨基酸残基，在生物体内接受加工而去掉。
下面，就去铁铁蛋白中的静电相互作用加以说明。
如上所述，因为在中性的溶液中，在去铁铁蛋白的保持部4以及通道3的内表面上配置了带负电荷的天冬胺酸和谷氨酸，所以去铁铁蛋白的内表面全体的电位Vin比去铁铁蛋白的外部的电位Vout低。即用ΔV＝Vin-Vout定义的去铁铁蛋白的内外电位差ΔV变为ΔV＜0(mV)。
这里，因为(AuCl4)-带负电荷，所以，如果去铁铁蛋白内部的(AuCl4)-浓度为Cin，溶液中的(AuCl4)-的浓度为Cout时，Cin、Cout以及ΔV的关系可用以下的表达式(1)表示。
Cout/Cin＝e-ΔV/kT(1)在表达式(1)中，e为自然对数，k为玻耳兹曼常数，T是绝对温度。从该表达式中知道，通过增大ΔV，当温度一定时，去铁铁蛋白内部的(AuCl4)-浓度以指数函数递增。例如，当ΔV为正值时，ΔV如果变为4倍，Cout/Cin约变为80。
而如果去铁铁蛋白内部的浓度增加，去铁铁蛋白的内表面的(AuCl4)-→Au的还原反应被加速。
本申请的发明者们考虑到以上的条件，得出以下结论为了在溶液中，在去铁铁蛋白的保持部4上高效地生成金粒子，至少Cin应该是Cout的三倍以上。在室温下，满足该条件的ΔV约为25(mV)以上。特别是为了以足够的速度在保持部4上生成金粒子，ΔV最好在100(mV)以上。
这里，通过对去铁铁蛋白的内表面上存在的碱的电荷，考虑其位置求出总和，得到ΔV。例如，去铁铁蛋白单体中，通过把位于保持部4的谷氨酸的三个取代为赖氨酸(Lys)，能推算出去铁铁蛋白中的ΔV约为200(mV)。可以认为，这对于在去铁铁蛋白的保持部4生成金粒子是足够的电位差。
本申请的发明者们根据以上的计算，制作了能保持以下的金粒子的重组去铁铁蛋白。
图2(a)～(c)是模式地表示根据上述见解制作的重组去铁铁蛋白的结构的图。
首先，如图2(a)所示的是在来自马的肝脏的去铁铁蛋白(以下简称为去铁铁蛋白)中，把第128的天冬胺酸和第131的谷氨酸等两个氨基酸取代为丝氨酸。这里，技术把天冬胺酸或谷氨酸置换为丝氨酸，也能保持去铁铁蛋白的立体结构。另外，去铁铁蛋白的第1～8的氨基酸从去铁铁蛋白的外表面上露出，有可能对二维结晶化等高次结构的制作造成障碍，所以去掉。以下，把该重组去铁铁蛋白表示为fer-8-ser。
这里，通过把存在于通道3的内表面的带负电荷的天冬胺酸以及谷氨酸取代为不带负电荷的丝氨酸，去掉静电斥力，能容易地把带负电荷的(AuCl4)-(图2(a)中的7)导入通道3内。另外，因为丝氨酸残基比天冬胺酸以及谷氨酸两残基的尺寸小，所以不会成为把(AuCl4)-导入时的物理上的障碍。
下面，在图2(b)中表示的是把fer-8-ser的氨基酸序列的第58、61、64的谷氨酸分别取代为(Arg)的重组去铁铁蛋白。以下把该重组去铁铁蛋白表示为fer-8-ser-Arg。
这里，通过把存在于去铁铁蛋白的保持部4的内表面上的第58、61、64的谷氨酸取代为带正电荷的精氨酸，能把导入通道3的(AuCl4)-导入去铁铁蛋白的保持部4。这时，即使把谷氨酸取代为精氨酸，也能保持去铁铁蛋白的立体结构。这里，导入保持部4的(AuCl4)-7依次被还原，成为金(Au)7’。另外，作为与第58、61、64的谷氨酸取代的氨基酸只要不带负电荷就可以，除了碱性氨基酸Lys，也可以是Ala等非极性氨基酸和中性氨基酸。
下面，在图2(c)中表示的是fer-8-ser-Arg的氨基酸序列的第54的谷氨酸和第65的精氨酸取代为半胱氨酸的重组去铁铁蛋白。以下，把该重组去铁铁蛋白表示为fer-8-ser-Arg-Cys。
这里，因为fer-8-ser-Arg的氨基酸的第54的谷氨酸和第65的精氨酸存在于去铁铁蛋白的保持部4的内表面上，所以通过把这些氨基酸取代为具有还原作用的半胱氨酸，把导入保持部4的(AuCl4)-还原，能使保持部4内析出金的微粒。由此，通过后述的操作，能在保持部4内形成由金构成的核1。
另外，在上述的重组去铁铁蛋白的制作中，如以下所述，采用众所周知的基因重组技术以及蛋白质的发现方法。
首先，从武田(Takeda)等制作的来自马的肝脏的去铁铁蛋白的DNA被重组的质粒Takeda 99224(参照S.Takeda等Biochim.Biophys.Acta.，1174，218-220，1993)，使用适当的限制性内切酶，切出把去铁铁蛋白的氨基酸序列编码的DNA断片。
接着，把该DNA断片插入去铁铁蛋白发现用矢量质粒即Pmk-2中，制作去铁铁蛋白发现用质粒。
接着，把该去铁铁蛋白发现用质粒作为模板，把导入了所希望的变异的单链DNA的断片作为引物，进行PCR(聚合酶链反应)，在把去铁铁蛋白的氨基酸序列编码的DNA的目的位置部位特异地导入所希望的变异。这样，就制作了含有失去把去铁铁蛋白的1～8的氨基酸编码的部分的DNA的变异去铁铁蛋白基因的DNA断片的质粒。在必要的时候，把该去铁铁蛋白基因的DNA断片切出，导入其它的矢量质粒中。
接着，把制作的质粒导入市售的大肠杆菌(E.coli的一种，NovaBlue)中，进行转化后，使用罐发酵槽(大量培养装置)，在37℃下，大量培养该大肠杆菌。另外，因为转化的大肠杆菌对氨苄青霉素有抗性，所以以此为指标，能与未被转化的大肠杆菌区别开。
在该大肠杆菌内，发现导入质粒中的重组去铁铁蛋白的DNA，大量生产失去第1～8的氨基酸残基的去铁铁蛋白(以下标记为fer-8)。通过后述的步骤，从大肠杆菌内抽出、精制Fer-8。
接着，为了制作fer-8-ser，导入了把通过刚才的操作得到的fer-8的氨基酸序列编码的DNA的质粒作为模板，把去铁铁蛋白的第128的天冬胺酸和第131的谷氨酸取代为丝氨酸的氨基酸序列编码的单链DNA断片作为引物，进行PCR。
接着，通过与fer-8的制作同样的操作，制作插入了把fer-8-ser的氨基酸序列编码的DNA的质粒，把它导入大肠杆菌(Nova Blue)中，进行转化。大量培养了转化的大肠杆菌后，通过后述的步骤，从大肠杆菌的体内抽出、精制fer-8-ser。
以下，通过同样的步骤，得到插入把fer-8-ser-Arg的氨基酸序列为编码的DNA的质粒和fer-8-ser-Arg，接着，得到插入了把fer-8-ser-Arg-Cys的氨基酸序列为编码的DNA的质粒和fer-8-ser-Arg-Cys。
另外，上述的操作中变异去铁铁蛋白的抽出、精制步骤如下所述。
首先，把培养结束后的大肠杆菌的培养液移到离心试管中，安放到离心分离器内，在4℃、10000转/分、25分钟的条件下，使大肠杆菌的菌体沉淀。
接着，收集沉淀的大肠杆菌后，在液体中使用超声波破碎机，使菌体破碎，使去铁铁蛋白溶入液体中。接着，把破碎菌体的液体移到离心试管中，安放到离心分离器内，在4℃、10000转/分、25分钟的条件下，在不破碎的前提下，使剩下的菌体沉淀。
接着，从离心试管采集溶液上清的部分(上清液)，把该液体在60℃，进行15分钟的热处理后，移到离心试管中，在4℃、10000转/分、25分钟的条件下，进行离心分离。通过该操作，把不要的蛋白质改性，沉淀到试管的底部。
接着，从离心试管采集了上清液后，在4℃下，进行使用Q-SepharoseHP(凝胶过滤柱)的柱层析，采集上清液中包含的重组去铁铁蛋白部分。把该去铁铁蛋白部分进而在25℃下流过Sephacryl S-300(凝胶过滤柱)，通过进行柱层析，进行精制。通过该操作，去除杂质，得到精制的重组去铁铁蛋白。
—保持金粒子的去铁铁蛋白的制作—首先，把重组去铁铁蛋白溶液和KAuCl4溶液(或HAuCl4)混合，调制溶液后，使各自的最终浓度为重组去铁铁蛋白为0.5mg/ml，KAuCl4为3mmol/L，pH为7-9，把其放置24小时以上，把金粒子导入去铁铁蛋白内部，形成金-去铁铁蛋白复合体。这里，作为缓冲剂，如果pH为7-8，使用100mM的磷酸，如果pH为8-9，使用100mM的三氯酸(Tris-Hcl)为好。
这时，通过在溶液中加入NaBH4，使其浓度变为1mM以下，或加入乙醇等的酒精，使浓度变为10％以下(v/v)，或照射光或紫外线中的一种，也可以加速(AuCl4)-的还原反应，缩短反应时间。可是，当NaBH4的浓度超过1mM时，或乙醇的浓度超过10％(v/v)时，在把(AuCl4)-导入去铁铁蛋白内部之前，就将其还原掉，有可能在去铁铁蛋白的外表面上析出金粒子。在去铁铁蛋白的外表面上析出的金粒子的尺寸与在去铁铁蛋白的保持部4形成的金粒子的尺寸相比，偏移变大。
另外，在去铁铁蛋白内部，析出的金粒子的表自身催化(AuCl4)-的还原反应(自身催化作用)。由此，(AuCl4)-的还原反应持续到去铁铁蛋白的保持部4被充满。
另外，这里，之所以溶液的pH为7-9，是因为如果溶液的pH为6以下，非常难发生(AuCl4)-的还原，而当pH为10以上，反而无法控制(AuCl4)-的还原的进行。
然后，用与精制包含铁的铁蛋白同样的步骤，除去未保持副反应物和金粒子的去铁铁蛋白，把得到的溶液通过凝胶色谱法分化，采集包含金粒子的去铁铁蛋白的溶液。这时，不是保持部4，而在外表面上形成金粒子的去铁铁蛋白或许是少量的，但是在保持部4和外表面上同时分别得到形成金粒子的去铁铁蛋白。
通过把金粒子导入去铁铁蛋白的反应，当作为重组去铁铁蛋白而使用fer-8-ser以及fer-8-ser-Arg时，与在内部包含金粒子的去铁铁蛋白同样，生成在外表面上形成金粒子的去铁铁蛋白。这是因为去铁铁蛋白的外表面上金析出的反应速度比去铁铁蛋白的保持部4中形成金粒子的反应快。
对此，通过使用fer-8-ser-Arg-Cys作为重组去铁铁蛋白，能大幅度提高在内部包含金粒子的去铁铁蛋白的收获率。这是因为通过被导入保持部4的半胱氨酸(Cys)的还原作用，加速了在去铁铁蛋白的保持部4的(AuCl4)-的还原反应。另外，去铁铁蛋白内包含的金粒子的直径是均匀的，约为6nm。总之，通过使用在本实施例中制作的重组去铁铁蛋白fer-8-ser-Arg-Cys，能高效地形成纳米级的尺寸均匀的金粒子。微细的金粒子在应用于后述的DNA传感器等时，具有其它金属所没有的用途和优点。
在本实施例中，虽然使用的去铁铁蛋白是来自马的肝脏，但是也能使用来自其它的脏器，或来自其它生物的去铁铁蛋白，即由单体亚单元的聚合体构成，并且在内部具有保持部的蛋白质等。因为来自李氏杆菌的焦磷酸铁去铁铁蛋白等来自其它生物的去铁也与来自马的具有同样的立体结构，所以通过同样的操作，能得到重组去铁铁蛋白。因为金属-去铁铁蛋白复合体的核的直径因种类而稍有不同，由此，能使金粒子的直径有变化。
而且，如果是在内部能保持金属等的笼状蛋白质，如本实施例中所进行的，通过改变通道和内部的电荷，能使其保持金粒子。
另外，当是由12个单体亚单元构成，并且具有在内部保持无机物的保持部的Dps蛋白质等其它的铁蛋白家族的蛋白质时，也使用与去铁铁蛋白同样的基因重组技术，能使其保持贵金属微粒。
另外，在本实施例中，把去铁铁蛋白的通道3的内表面上存在的第128的天冬胺酸和第131的谷氨酸取代成丝氨酸，但是，也可以取代为比丝氨酸分子量更小的中性氨基酸即氨基乙酸或丙氨酸取代。
另外，在本实施例中，作为重组去铁铁蛋白列举了fer-8-ser-Arg，但是，取代了去铁铁蛋白的氨基酸序列的第58、61、64的各谷氨酸的氨基酸也可以是赖氨酸或丙氨酸等不带负电荷的碱性或非极性或中性氨基酸。以下，把用赖氨酸取代了氨基酸序列的第58、61、64的各谷氨酸的重组去铁铁蛋白表示为fer-8-Ser-Lys。
另外，把用丙氨酸取代氨基酸序列的第58、61、64的各谷氨酸的重组去铁铁蛋白表示为fer-8-Ser-Ala。
另外，把用半胱氨酸取代fer-8-Ser-Lys的第54的谷氨酸和第65的精氨酸的重组去铁铁蛋白表示为fer-8-Ser-Lys-Cys。另外，把用半胱氨酸取代fer-8-Ser-Ala的第54的谷氨酸和第65的精氨酸的重组去铁铁蛋白表示为fer-8-Ser-Ala-Cys。
其中，分别用序列号码1记载把fer-8-Ser-Lys-Cys的氨基酸序列编码的DNA序列，用序列号码2记载fer-8-Ser-Ala-Cys fer-8-Ser-Lys-Cys的氨基酸序列。另外，序列号码2的氨基酸序列从第9的酪氨酸开始。
另外，在本实施例中制作的fer-8-Ser-Lys-Cys中，把第58、61、64(序列号码2中，第50、52、56)的Lys编码的DNA序列都是“aag”，但是，把Lys编码的DNA序列也可以是“aaa”。关于第128、131(序列号码2中，第120、123)的Ser，第54、65(序列号码2中，第46、57)的Cys，把这些氨基酸编码的DNA序列可以与序列号码1所示的序列不同。这对于其它的重组去铁铁蛋白也是同样的。
另外，推定在本实施例中制作的fer-8-Ser-Arg-Cys、fer-8-Ser-Lys-Cys以及fer-8-Ser-Ala-Cys等重组去铁铁蛋白的第127的半胱氨酸位于去铁铁蛋白外表面上，该半胱氨酸使去铁铁蛋白的外表面上析出金粒子。因此，通过将fer-8-Ser-Arg-Cys、fer-8-Ser-Lys-Cys以及fer-8-Ser-Ala-Cys的第127的半胱氨酸取代成比该半胱氨酸的还原功能小的物质，抑制了金粒子在去铁铁蛋白的外表面上的析出，能进一步提高内包金粒子的去铁铁蛋白的收获率。作为该方法，也可以用例如丙氨酸等氨基酸取代第127的半胱氨酸，也可以与半胱氨酸残基反应，与抑制还原功能的化学物质等反应。
另外，虽然在本实施例中制作了金-去铁铁蛋白复合体，但是也可以不把(AuCl4)-导入去铁铁蛋白中，而是通过把氯化铂酸(PtCl4)2-导入重组去铁铁蛋白，能制作保持白金粒子的去铁铁蛋白。可是，因为(PtCl4)2-在pH7-9的溶液中容易被还原，在溶液中析出白金，所以溶液的pH有必要低于7。这时，作为缓冲液，当在pH为4附近时使用100mM的醋酸，当在pH为3附近时，使用100mM的β-丙氨酸。
下面，用以下的实施例说明本实施例中制作的保持贵金属微粒的重组去铁铁蛋白在产业上的利用例。
实施例2首先，就本实施例中的核苷酸检测装置的结构加以说明。图5是表示本实施例的核苷酸检测装置的结构的剖面图。
如同一图所示，本实施例的核苷酸检测装置10是DNA传感器，如图5所示，由以下部分构成衬底11；在衬底11的表面上以高密度并且高精度(相邻的粒子彼此间隔12nm)配置的纳米级尺寸(直径6nm左右)的金粒子12；在端部具有硫磺原子的单链DNA(硫醇DNA)13，并使硫醇DNA13结合在金粒子12上。
下面，就本实施例的核苷酸检测装置10的制作方法加以说明。为了制作本实施例的核苷酸检测装置10，有必要把6nm左右的金粒子12以高密度并且高精度二维地序列并固定在衬底11的表面上。
首先，通过后述的方法，在衬底11的表面上配置保持实施例1的金粒子12的重组去铁铁蛋白(fer8-ser-Arg-Cys和金粒子的复合体；以下，称作内包金的去铁铁蛋白15)。
图3是模式地表示在衬底11上配置的内包金的去铁铁蛋白15的图，图4表示了在衬底11上配置的内包金的去铁铁蛋白15的电子显微镜照片。
在拍摄图4时，在染色中使用无法导入去铁铁蛋白中的尺寸的金葡萄糖。这里，之所以使用金葡萄糖染色，是因为如果用通常的色素染色，色素进入去铁铁蛋白的内部，从而无法确认金粒子的存在。
通过该操作，如图3及图4所示，在衬底11上形成以高密度且高精度配置的内包金的去铁铁蛋白15的膜。从图4可知，这时的去铁铁蛋白的外径大约为12nm。
接着，除去由内包金的去铁铁蛋白15中的蛋白质构成的外壳2，只留下金粒子12。接着，使硫醇DNA13结合在金粒子12上。这里使用的DNA是单链DNA。
在本实施例中，为了把内包金的去铁铁蛋白15以高密度并且高精度，二维地序列并固定在衬底11的表面上，可以使用已知的方法。
例如，可以使用基于以下说明的吉村等开发的复制法的方法(Adv.Biophys.，Vol.34，p99-107，(1997))。
在该方法中，首先，使用注射器在浓度为2％的蔗糖溶液中注入分散了内包金的去铁铁蛋白15的液体。液体向着蔗糖溶液的液面上浮。
接着，最初到达气液界面的液体形成由变性的去铁铁蛋白构成的无定形膜，而后到达的液体附着在无定形膜的下面。
接着，在无定形膜之下形成内包金的去铁铁蛋白15的二维结晶。接着，在由无定形膜和内包金的去铁铁蛋白15的二维结晶构成的膜上放置衬底11(硅片、碳栅格、玻璃衬底等)，由该内包金的去铁铁蛋白15构成的膜被复制到衬底11的表面上。
如图3所示，通过该方法能在衬底11上以高密度且高精度配置内包金的去铁铁蛋白15。
这时，通过预先对衬底11的表面进行疏水处理，能更简单地把膜复制到衬底11的表面上。
然后，除去由蛋白质构成的外壳2。因为，一般蛋白质分子热弱，所以能通过以下所示的热处理除去外壳2。
例如，如果在氮等惰性气体中，在400～500℃下，约静置1小时，就烧掉了外壳2和由蛋白质构成的无定形膜，在衬底11上，金粒子12以高密度且高精度，有规律地、二维地序列，以粒体状残留。
如上所述，能使保持在内包了金的去铁铁蛋白15中的金粒子12二维地出现在衬底11上，以高密度且高精度序列。
下面，就本实施例的核苷酸检测装置10的形成加以说明。
本实施例的核苷酸检测装置10是使衬底11上配置的金粒子12与硫醇DNA13结合的。
把金粒子12与硫醇DNA13结合的方法为使配置金粒子12的衬底11与硫醇DNA13的水溶液接触，只需放置所定的时间就可以。这是因为，硫磺容易与金反应，所以在该硫醇DNA13或硫醇RNA的端部容易与金粒子12形成共轭键。
具体而言，如果使水溶液中的硫醇DNA13和衬底11上的金粒子12接触，硫醇DNA13的硫磺原子S和金粒子12一对一地以共价键结合，把硫醇DNA13以极高的密度、精度配置在衬底11上。衬底11上的金粒子12以高密度、高精度，二维地序列，所以与金粒子12结合的硫醇DNA13也以高密度、高精度，二维地序列，得到按照粒子的大小，均匀配置单位面积中的粒子数的核苷酸检测装置10。
另外，在该过程中，可以不用硫醇DNA13，而是可以用硫醇RNA，使用把其端部硫醇化的PCR引物等的核苷酸。
在所述过程中，在理论上，硫醇DNA13在水溶液中的浓度应为只要衬底11上的金粒子12的数量与硫醇DNA13的数量一致就可以。可是，实际上，硫醇DNA13的数量最好比金粒子12的数量多。因此，在本实施例中，使用高浓度的硫醇DNA13的水溶液，使在液体中，在分散的状态下，包含内包金的去铁铁蛋白15的分子数以上的硫醇DNA13。
另外，硫醇DNA13的水溶液的温度越高，越能促进硫醇DNA13的硫磺原子S和金粒子12的结合。可是，如果温度过高，对流就变得激烈，从而很难处理硫醇DNA13的水溶液。另外，从能耗方面也十分不利，所以一般把硫醇DNA13的水溶液加热到20～60℃左右为好。
如上所述，就得到能简便检测要检测的DNA或RNA的本实施例的核苷酸检测装置10。
下面，说明当把核苷酸检测装置10作为DNA传感器时的DNA检测方法。
首先，准备含有成为检测对象的DNA群(被检测DNA群)的溶液，预先对被检测DNA群进行荧光标签处理。
使进行荧光标签处理的被检测DNA群与配置硫醇DNA13的核苷酸检测装置10接触后，放置。
经过一定时间后，当在被检测DNA群中存在与核苷酸检测装置10的硫醇DNA13杂交的DNA时，核苷酸检测装置10的硫醇DNA13与被检测DNA群中的DNA构成双螺旋，完成稳定的结合。
接着，如果用水等不含荧光物质的溶液洗净核苷酸检测装置10，就除去被检测DNA群中与核苷酸检测装置10的硫醇DNA13未结合的DNA、和在核苷酸检测装置10上残留的微量荧光物质。
然后，在核苷酸检测装置10的表面，照射激光等的光源，观察荧光。这时，如果在所述被检测DNA群中存在具有与核苷酸检测装置10的硫醇DNA13杂交的序列的DNA，就发出荧光。
如上所述，通过是否发出荧光，就能检测在被检测DNA群中是否存在具有所定的序列的DNA。
特别是在本实施例的核苷酸检测装置10中，硫醇DNA13以高密度、高精度，均匀地配置在整个衬底上。因此，能作为荧光强度高、高精度、均匀，并且SN比非常高的高性能DNA传感器利用。因此，当把本实施例的核苷酸检测装置10作为DNA传感器利用时，如果能得到高于所定值的荧光强度，就能断定在被检测DNA群中，存在具有所定序列的DNA。总之，几乎没有误判断是否存在具有所定序列的DNA的可能性。
本实施例的核苷酸检测装置10，不但硫醇DNA13以高密度、高精度，均匀地配置在整个衬底上，而且具有所定序列的DNA的杂交后的荧光强度几乎不会因衬底不同而不同。因此，为了判断是否有杂交了的DNA，没有必要对每块衬底改变荧光强度的阈值，因此能大幅度削减调整荧光检测器的工夫。
另外，在本实施例中，说明了把核苷酸检测装置10作为DNA传感器的情形，但是，通过用RNA群代替DNA群作为检测对象，就能把核苷酸检测装置10作为RNA传感器。
另外，以往，DNA芯片等核苷酸检测装置是一次性的，但是本实施例的核苷酸检测装置10中，因为衬底和DNA(或RNA)是通过硫磺原子和金粒子，牢固地固定在一起，所以在100℃的温度下也能维持该固定。因此，通过把杂交的DNA从硫醇DNA分离、清洗，就能反复使用。
另外，也可以使用实施例1中得到的在外表面上生长了金粒子的金-去铁铁蛋白复合体以代替在本实施例中使用的内包金的去铁铁蛋白15。在去铁铁蛋白的外表面上成长的金粒子虽然尺寸不均匀，但与本实施例中得到的金粒子12同样，能以高密度、高精度在衬底上配置金粒子。在实施例1中，如果使用fer-8-ser-Arg，就能以非常高的收获率，得到在外表面上生长金粒子的fer-8-ser-Arg，所以与使用内包金的去铁铁蛋白15时相比，能降低核苷酸检测装置10的制造成本。
实施例3在本实施例中，说明把在实施例1中制造的利用内包金的去铁铁蛋白而形成的粒体作为浮动栅极的不挥发性存储器单元。另外，特开平11-233752公报中记载了本实施例的不挥发性存储器单元及其制造方法。
图6是表示把粒体作为浮动栅极的不挥发性存储器单元的结构的剖面图。如同一图所示，在p型Si衬底21上，具有作为控制栅极而起作用的多晶硅电极26；由具有约6nm的粒径的金的微粒构成的作为浮动栅极而起作用的粒体24；存在于p型Si衬底21和浮动栅极之间，作为通道绝缘膜而起作用的栅极氧化膜23；在控制栅和浮动栅极之间，作为把控制栅极的电压传递给浮动栅极的电极间绝缘膜而起作用的氧化硅膜25。而在p型Si衬底21内，形成作为源极或漏极而起作用的第一、第二n型扩散层27a以及27b，p型Si衬底21内的第一、第二n型扩散层27a、27b之间的领域是作为通道而起作用。另外，在与图示的存储器单元相邻的存储器单元之间，为了电气上的分离，形成了用选择氧化法形成的元件分离氧化膜22。第一、第二n型扩散层27a、27b通过各钨插头30与第2铝布线31a，31b分别相连。在图6中虽然未显示，但是因为多晶硅电极26和p型Si衬底21都与铝布线相连，使用该铝布线，能控制存储器单元的各部分的电压。
能按以下方法容易地形成该存储器单元。
首先，通过LOCOS法，形成包围工作区的元件分离氧化膜22后，在衬底上形成栅极氧化膜23。然后，使用在实施例1中制作的内包金的去铁铁蛋白，在整个衬底上形成粒体24。这时，通过使用内包了金粒子的去铁铁蛋白，能省略在使用以往的内包金属氧化物的去铁铁蛋白时所必要的粒体的还原过程。
接着，在衬底上，通过CVD法沉积覆盖粒体24的氧化硅膜以及多晶硅膜。
接着，对氧化硅膜以及多晶硅膜进行刻膜，形成成为电极间绝缘膜的氧化硅膜25以及成为控制栅电极的多晶硅电极26。然后，把光刻胶掩模以及多晶硅电极26作为掩模，进行杂质的注入，形成第一、第二n型扩散层27a、27b。
然后，通过众所周知的方法，形成层间绝缘膜28，形成通向层间绝缘膜28的接触孔29的开口，通过在接触孔29内嵌入钨形成钨插头30，形成第一、第二铝布线31a。
本实施例的存储器单元具有由作为控制栅极而起作用的多晶硅电极26和作为源极或漏极而起作用的第一、第二n型扩散层27a以及27b构成的MOS晶体管(存储器晶体管)，是利用通过作为浮动栅极而起作用的粒体24中积蓄的电荷量而使所述存储器晶体管的阈值电压发生的变化的不挥发性存储器单元。该不挥发性存储器单元取得作为记忆二值的存储器的功能，但是不只通过粒体24上积蓄的电荷的有无，而且通过控制电荷的蓄积量，能实现三值以上的多值存储器。
当消去数据时，使用通过氧化膜的FN(Fowler-Nordheim)电流和直接隧道电流。
另外，当写入数据时，使用通过氧化膜的FN电流或直接隧道电流或通道热电子流(CHE)的注入。
根据本实施例的不挥发性存储器单元，因为浮动栅极是由小的金微粒构成，使其能作为量子粒而起作用，所以电荷的积蓄量是微量的。因此，能使写入、消去时电流量很小，从而能构成低耗电的不挥发性存储器单元。
另外，在本实施例的不挥发性存储器单元中，因为构成浮动栅极的金微粒的尺寸均匀，所以电荷的注入、放出时的特性在各金微粒间是一致的，所以能容易地控制这些操作。
另外，所述粒体24可以是相互接触，连续地即作为整体以构成膜的状态形成，也可以相互分开，分散地形成。在本实施例中，因为使用了包含金微粒的去铁铁蛋白，所以通过对衬底上所希望的部分进行疏水处理后，配置去铁铁蛋白等的方法，能容易地形成这样的微细粒体结构。
另外，在本实施例中，使用金作为粒体的构成材料，但是也可以用白金代替金。通过用实施例1中制作的内包白金的去铁铁蛋白代替内包金的去铁铁蛋白，能形成由直径约为6nm的均匀尺寸的白金构成的粒体。这时，与使用内包金的去铁铁蛋白时同样，具有不需粒体的还原过程的优点。
实施例4在本实施例说明，利用实施例1的内包金的去铁铁蛋白，把金粒子配置在衬底上，把该金粒子作为蚀刻掩模而使用的方法。
图7(a)-(c)是表示把金粒子作为掩模，形成微小结构体的方法的剖面图。
首先，在图7(a)所示的过程中，通过与实施例2同样的方法，在硅衬底34上，在所希望的位置配置内包金的去铁铁蛋白后，通过热处理，除去由蛋白质构成的外壳。由此，直径约为6nm的金粒子残留在衬底34上。
这里，通过使用内包金的去铁铁蛋白，不再需要使用内包金属氧化物的去铁铁蛋白时所进行的还原过程。
接着，在图7(b)所示的过程中，通过使用SF6气体，对于硅衬底34进行5分钟的离子反应性蚀刻(RIE)，有选择地蚀刻衬底34。这是因为金粒子33比硅衬底34更难被蚀刻。
接着，在图7(c)所示的过程中，继续进行蚀刻，最终金粒子33也被去掉，留下进行的所希望的刻膜的硅衬底34。通过本实施例的方法，能在衬底上正确地形成上表面的直径约为6nm、均匀的微细柱状图形(以下，把“微细柱状图形”称作“微细柱”)。总之，通过本实施例的方法能形成以往很难形成的尺寸均匀的微细结构体(即微小结构体的精密加工)。
通过本实施例的方法形成的微小结构体能在后述的利用量子效果的发光元件等中使用。
另外，在本实施例中，把金粒子作为蚀刻掩模，但是，也可以用白金粒子代替它。为此，在过程(a)中，可以用实施例1的内包白金的去铁铁蛋白代替内包金的去铁铁蛋白。
另外，虽然根据状况，即使使用内包Fe的铁蛋白和内包Ni、Co的去铁铁蛋白，也可以不要还原过程，但是，通过使用本实施例的内包贵金属的去铁铁蛋白，在任意的状况下，都能省略还原过程。
另外，在本实施例的过程(a)中，为了除去内包金的去铁铁蛋白的外壳，使用热处理，但是，也可以用臭氧分解或基于溴化氰(CNBr)的化学分解代替。
实施例5下面，作为实施例5，说明使用通过实施例4的加工方法形成的微细柱，制造江利口等报告的特开平-08083940号公报中记载的光半导体装置的方法。
图8是使用通过实施例4形成的上表面的直径为6nm的半导体微细柱的半导体装置的剖面图。
首先，在实施例4中使用，在n型硅的一部分上形成p型井51作为衬底，再在p型井51上使用形成n型井的。通过实施例4的方法加工该衬底，以高密度形成有n型硅构成的半导体微细柱42。
接着，通过热氧化法，用由硅氧化膜构成的绝缘层43覆盖半导体微细柱的侧面后，用绝缘层43填充半导体微细柱42间的空隙，使其顶端面变平坦。
进而，除去绝缘层43中被平坦化的半导体微细柱42顶端部的表面的绝缘层，在其上形成透明电极44。
另外，硅衬底41上的量子化领域Rqa的侧方由预先形成的绝缘分离层49与其他的领域区分开。另外，也预先形成贯通绝缘分离层49的侧方电极50，并对于各半导体微细柱42的上部电极即透明电极44，与作为下部电极的硅衬底41相连。
由此，形成光半导体装置，如果在透明电极44和侧方电极50之间外加正向电压，在室温下就发生场致发光。进而通过使载流子注入电压变化，就产生与红、兰、黄等各发光对应的可见光场致发光。
根据本实施例，能实现迄今为止都很困难的具有高的发光效率的光半导体装置。
其它实施例在实施例1的金-去铁铁蛋白复合体的制作过程中，得到少量在外表面上和保持部都保持金粒子的金-去铁铁蛋白复合体。
图9是表示在外表面上和保持部都保持了金粒子的金-去铁铁蛋白复合体的图。在同一图中，保持部中保持的第一金粒子61的直径约为6nm，在去铁铁蛋白的外表面上形成的第二金粒子62的尺寸有偏移，但是，至少比去铁铁蛋白内包的第一金粒子61的尺寸大。另外，保持部中保持的第一金粒子61被去铁铁蛋白的外壳63包围着。
把该金-去铁铁蛋白复合体在硅衬底等之上配置为膜状，使第二金粒子62在上面。
再进一步加工该衬底，能制作把第一金粒子61和第二金粒子62作为浮动栅极的双点型不挥发性存储器单元。该不挥发性存储器单元具有数据的保持时间长的特征，这是因为尺寸不同的粒子中，电荷注入的难易程度和放出的难易程度彼此不同，把输入的信息保持在难于放出电荷一方的金粒子中。这里，通过使用金-重组去铁铁蛋白复合体，能容易地制造保持时间长的不挥发性存储器单元。
另外，通过使用去铁铁蛋白，能把纳米级尺寸的金粒子作为浮动栅极使用，因此，能使存储单元微细化。
另外，虽然在本实施例中，只使用了金-重组去铁铁蛋白复合体，但是，通过把其它金属和去铁铁蛋白的复合体与金-重组去铁铁蛋白复合体组合使用，能制作电平不同的点，从而能容易地生成保持时间长的不挥发性存储器单元。
另外，在本实施例中，可以用在外表面上和保持部保持白金的去铁铁蛋白代替在外表面上和保持部保持金的去铁铁蛋白，也可以把它与保持金的去铁铁蛋白组合使用。
本发明的去铁铁蛋白及其制作方法，如果根据贵金属-重组去铁铁蛋白复合体及其制作方法，通过使用基因重组技术，改造内部结构，能把贵金属原子导入去铁铁蛋白内，从而能形成能适用于各种微细结构的贵金属微粒。另外，通过使用本发明的大肠杆菌和重组基因，能高效地的得到所述重组去铁铁蛋白。
序列表<110>松下电器产业株式会社<120>重组笼状蛋白质、其制造方法、贵金属-重组笼状蛋白质复合体、其制造方法、以及重组DNA<130>去铁铁蛋白DNA PRT<150>JP P2001-142983<151>2001-05-14<160>2<170>Patent In Ver.2.1<210>1<211>504<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列说明Equus cebellus的肝脏去铁铁蛋白的重组DNA<400>1tattctactg aagtggaggc cgccgtcaac cgcctggtca acctgtacct gcgggcctcc 60tacacctacc tctctctggg cttctatttc gaccgcgacg atgtggctct ggagggcgta 120tgccacttct tccgctgctt ggcggagaag aagcgcaagg gtgccaagtg cctcttgaag 180atgcaaaacc agcgcggcgg ccgcgccctc ttccagagct tgtccaagcc gtcccaggat 240gaatggggta caaccccgga tgccatgaaa gccgccattg tcctggagaa gagcctgaac 300caggcccttt tggatctgca tgccctgggt tctgcccagg cagaccccca tctctgtagc 360ttcttgtcta gccacttcct agacgaggag gtgaaactca tcaagaagat gggcgaccat 420ctgaccaaca tccagaggct cgttggctcc caagctgggc tgggcgagta tctctttgaa 480aggctcactc tcaagcacga ctaa504<210>2<211>167<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列种类<220><221>MUTAGEN<222>(46)<220><221>MUTAGEN<222>(50)<220><221>MUTAGEN<222>(53)<220><221>MUTAGEN<222>(56)<220><221>MUTAGEN<222>(57)<220><221>MUTAGEN<222>(120)<220><221>MUTAGEN<222>(123)<400>2Tyr Ser Thr Glu Val Glu Ala Ala Val Asn Arg Leu Val Asn Leu Tyr1 5 10 15Leu Arg Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg20 25 30Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Cys Hi sPhe Phe Arg Cys Leu Ala35 40 45Glu Lys Lys Arg Lys Gly Ala Lys Cys Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln50 55 60Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Leu Gln Lys Pro Ser Gln Asp65 70 75 80Glu Trp Gly Thr Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu85 90 95Lys Ser Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala100 105 110Gln Ala Asp Pro His Leu Cys Ser Phe Leu Ser Ser His Phe Leu Asp115 120 125Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Ile130 135 140Gln Arg Leu Val Gly Ser Gln Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu145 150 155 160Arg Leu Thr Leu Lys His Asp16权利要求
1.一种重组笼状蛋白质是用基因重组技术制作的；具有位于所述重组笼状蛋白质的内部，并且能保持贵金属微粒的保持部；和连接所述保持部和所述重组笼状蛋白质的外部的隧道状的通道。
2.根据权利要求1所述重组笼状蛋白质，其特征在于所述重组笼状蛋白质是去铁铁蛋白。
3.根据权利要求1所述重组笼状蛋白质，其特征在于所述贵金属微粒是金或白金。
4.根据权利要求1所述重组笼状蛋白质，其特征在于在所述通道的内表面中应该存在第一谷氨酸(Glu)以及第一天冬氨酸(Asp)的位置上具有分子大小比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸。
5.根据权利要求4所述重组笼状蛋白质，其特征在于所述第一中性氨基酸是从丝氨酸(Ser)、丙胺酸(Ala)、氨基乙酸(Gly)之中选择。
6.根据权利要求1所述重组笼状蛋白质，其特征在于在所述保持部的内表面中应该存在第二谷氨酸的位置上还具有碱性氨基酸或第二中性氨基酸。
7.根据权利要求6所述重组笼状蛋白质，其特征在于所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸是从精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、丙胺酸(Ala)中选择。
8.根据权利要求1所述重组笼状蛋白质，其特征在于在所述保持部的内表面存在一个以上与氨基酸取代的半胱氨酸。
9.根据权利要求1所述重组笼状蛋白质，其特征在于在所述重组笼状蛋白质的外表面上应该存在半胱氨酸的位置具有比该半胱氨酸的还原功能还小的物质。
10.一种贵金属-重组笼状蛋白质复合体由贵金属微粒和重组笼状蛋白质构成；具有能保持贵金属微粒的保持部；和连接所述保持部和所述重组笼状蛋白质的外部的隧道状通道。
11.根据权利要求10所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体，其特征在于所述笼状蛋白质是去铁铁蛋白。
12.根据权利要求10所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体，其特征在于在外表面上保持金或白金粒子。
13.根据权利要求10所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体，其特征在于在所述通道的内表面中应该存在第一谷氨酸以及第一天冬氨酸的位置具有分子大小比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸。
14.根据权利要求13所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体，其特征在于所述第一中性氨基酸是从丝氨酸、丙胺酸、氨基乙酸中选择。
15.根据权利要求10所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体，其特征在于在所述保持部的内表面中应该存在第二谷氨酸的位置还具有碱性氨基酸或第二中性氨基酸。
16.根据权利要求15所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体，其特征在于所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸是从精氨酸、赖氨酸、丙胺酸中选择。
17.根据权利要求10所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体，其特征在于在所述保持部的内表面存在一个以上与氨基酸取代的半胱氨酸。
18.一种把具有能保持贵金属的保持部、连接所述保持部和所述重组笼状蛋白质的外部的隧道状通道的重组笼状蛋白质的氨基酸的序列编码的重组DNA。
19.根据权利要求18所述重组DNA，其特征在于所述重组笼状蛋白质是去铁铁蛋白。
20.根据权利要求18所述重组DNA，其特征在于所述贵金属微粒是金或白金。
21.根据权利要求18所述重组DNA，其特征在于在所述通道的内表面中应该存在第一谷氨酸以及第一天冬氨酸的位置具有分子大小比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸。
22.根据权利要求21所述重组DNA，其特征在于所述第一中性氨基酸是从丝氨酸、丙胺酸、氨基乙酸中选择。
23.根据权利要求18所述重组DNA，其特征在于在所述保持部的内表面中应该存在第二谷氨酸的位置还具有碱性氨基酸或第二中性氨基酸。
24.根据权利要求23所述重组DNA，其特征在于所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸是从精氨酸、赖氨酸、丙胺酸中选择。
25.根据权利要求18所述重组DNA，其特征在于在所述保持部的内表面存在一个以上与氨基酸置换的半胱氨酸。
26.一种重组笼状蛋白质的制作方法，包含把位于通道的内表面的第一谷氨酸以及第一天冬氨酸取代为分子尺寸比谷氨酸以及天冬氨酸小的第一中性氨基酸的过程(a)。
27.根据权利要求26所述重组笼状蛋白质的制作方法，其特征在于所述笼状蛋白质是去铁铁蛋白。
28.根据权利要求26所述重组笼状蛋白质的制作方法，其特征在于所述第一中性氨基酸是从丝氨酸、丙胺酸、氨基乙酸中选择。
29.根据权利要求26所述重组笼状蛋白质的制作方法，其特征在于还含有把所述重组笼状蛋白质内部的保持部内表面上存在的第二谷氨酸取代为碱性氨基酸或第二中性氨基酸的过程(b)。
30.根据权利要求26所述重组笼状蛋白质的制作方法，其特征在于在所述过程(b)中，所述碱性氨基酸或所述第二中性氨基酸是从精氨酸、赖氨酸、丙胺酸中选择。
31.根据权利要求26所述重组笼状蛋白质的制作方法，其特征在于还含有把位于所述保持部的内表面的一个以上的氨基酸置换为半胱氨酸的过程(c)。
32.根据权利要求26所述重组笼状蛋白质的制作方法，其特征在于还含有位于所述重组笼状蛋白质的外表面的一个以上的半胱氨酸替换为比该半胱氨酸还原功能还小的物质的过程(d)。
33.一种贵金属-重组笼状蛋白质复合体的制造方法，包括通过把贵金属的配位化合物离子溶液与重组笼状蛋白质溶液混合，形成贵金属-重组笼状蛋白质复合体的过程(a)；通过使含有在所述过程(a)中制作的含有贵金属-重组笼状蛋白质复合体的溶液通过凝胶过滤筒，从而精制贵金属-重组笼状蛋白质复合体的过程(b)。
34.根据权利要求33所述贵金属-重组笼状蛋白质复合体的制造方法，其特征在于所述过程(a)中的所述贵金属是金或白金。
全文摘要
使用基因重组技术,用不带电荷并且尺寸小的丝氨酸取代位于去铁铁蛋白的通道3的谷氨酸以及天冬酰酸。接着,用赖氨酸的碱性氨基酸或中性氨基酸取代位于保持部4的谷氨酸。再在保持部导入一个以上的半胱氨酸。由此,能防止带负电荷的(AuCl
文档编号H01L29/40GK1388134SQ0211973
公开日2003年1月1日 申请日期2002年5月14日 优先权日2001年5月14日
发明者山下一郎 申请人:松下电器产业株式会社