药物递送蛋白质的增强运输的突变体的分离的制作方法
【专利说明】药物递送蛋白质的増强运输的突变体的分离
[0001]政府权利
[0002]本发明在国立卫生研宄院(Nat1nal Institutes of Health)颁发的资助编号CA129822和CA140995的政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
[0003]本发明提供了用于细胞渗透功能以改善药物向特定细胞器的递送的方法和组合物。
【背景技术】
[0004]定向进化已经被用于产生具有新趋性、减少的非特异性递送以及免疫逃逸的假型腺联病毒(AAV)衣壳(Kwon和Schaffer，2008 ；Maheshri等，2006)。不同选择压力下的体外和体内的噬菌体展示和全病毒文库的生物淘选产生了具有期望特性的蛋白，比如具有增强的配体结合和摄入、免疫相互作用或酶活性(Yuan等，2005)。因此，对于用于产生具有改善特征的新蛋白质变体的合理突变来说，该方法可能是有力的和更有效的替代方案。该方法的最新开发的方式采用易错PCR和交错延伸来产生变体文库，该变体文库可针对不同的细胞类型进行筛选，以挑选出细胞特异性靶向的载体(Zhao等，1998)。迄今为止，尚未开发出分离具有增强的细胞内运输功能的蛋白质变体的方法。本发明提出了一种新程序，以及从该程序产生的具有增强的用于药物递送的细胞渗透功能的新蛋白质分子。
【发明内容】
[0005]各种实施方式包括一种增强运输至细胞的方法，包括:提供组合物，该组合物包括具有增强进入至细胞的一个或多个突变的五邻体基质(PB)蛋白；以及将有效剂量的组合物施用至细胞。在一种实施方式中，一个或多个突变是IllC和/或333F。在另一实施方式中，组合物靶向至细胞的细胞质和/或细胞核。在另一实施方式中，组合物进一步包括治疗性药物。在另一实施方式中，细胞是肿瘤细胞。在另一实施方式中，一个或多个突变是SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12, SEQ IDNO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18, SEQID NO: 19 和 / 或 SEQ ID NO:20。
[0006]其他实施方式包括生产靶向至细胞器的药物递送分子的方法。该方法包括下述步骤:a)获得编码五邻体基质(PB)基因的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；b)将突变的多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；c)用噬菌体文库转化细胞；d)分级分离前述转化的细胞，并从转化的细胞收获细胞器；e)扩增来自前述收获的细胞器的噬菌体；f)用扩增后的来自前述收获的细胞器的噬菌体转化细胞；g)重复步骤(d)、(e)、⑴和(g) ;h)滴定来自每轮的前述收获的细胞器的噬菌体；i)选择具有最高滴度的噬菌体，并从噬菌体获得突变的多核苷酸的序列；以及j)产生由前述序列编码的多肽，其中该多肽是靶向至细胞器的药物递送分子。在另一实施方式中，细胞器选自由线粒体、高尔基体、内质网、细胞核、核糖体、质膜和胞质溶胶所组合的组。在另一实施方式中，细胞是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。在另一实施方式中，使用下述的任何一种或多种产生突变体:基于PCR的方法、化学诱变、紫外线诱导的诱变或其组合。在另一实施方式中，药物递送分子包括靶向结构域、核内体裂解配体结构域和带正电荷的结构域。
[0007]其他实施方式包括一种用于将治疗剂递送至细胞器的载体，所述载体包括由增强进入至细胞的一个或多个五邻体基质(PB)突变编码的多肽。在另一实施方式中，一个或多个五邻体基质(PB)突变包括IllC和/或333F。在另一实施方式中，载体进一步包括聚赖氨酸模体。在另一实施方式中，载体进一步包括调蛋白的靶向结构域。在另一实施方式中，一个或多个PB突变包括C-末端缺失。
[0008]其他实施方式包括一种治疗剂，该治疗剂包括载体和治疗性药物，所述载体用于将治疗剂递送至细胞器，所述载体包括由增强进入至细胞的一个或多个五邻体基质(PB)突变编码的多肽。在另一实施方式中，治疗性药物是化学治疗剂。
[0009]各种其他实施方式包括生产不具有增殖活性的载体的方法，包括:a)获得编码调蛋白(Her)受体结合结构域的多核苷酸，并在该多核苷酸中产生突变体；b)将突变的Her多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；c)在存在有丝分裂抑制剂的情况下，用噬菌体文库转化MDA-MB-435细胞；d)分级分离前述转化的细胞，并提取MDA-MB-435细胞的膜级分；e)从膜级分收获膜噬菌体；f)在存在有丝分裂抑制剂的情况下，将膜噬菌体转化为MDA-MB-435细胞；g)重复步骤(d)、(e)和(f) ；h)监测每轮的MDA-MB-435细胞增殖，并选择具有最低MDA-MB-435细胞增殖的膜噬菌体；i)在所选择的膜噬菌体中获得Her多核苷酸的突变体的序列；以及j)产生由Her序列和五邻体基质基因编码的多肽，其中该多肽是不具有增殖活性的载体。
[0010]其他实施方式包括用于将治疗剂递送至细胞核的载体，其包括由突变的Her序列编码的多肽。在另一实施方式中，该载体进一步包括编码五邻体基质(PB)蛋白的多肽，以及聚赖氨酸模体。在另一实施方式中，PB蛋白是突变体五邻体基质蛋白。
[0011]其他实施方式包括一种治疗剂，其包括载体和治疗性药物。
【附图说明】
[0012]图1表示根据本文的实施方式的生物淘选策略；
[0013]图2表示根据本文的实施方式的五邻体基质基因基于PCR的随机诱变。基于密度测定法分析，PCR产物(刚好在1600bp条带之上)包含10ng DNA，得到约4800ng的总产量。因为初始革G DNA是97ng，因此产量/初始量之比是约50并且复制数(duplicat1nnumber)是约 5.6，用制造商的规程(Genemorph II，Strategene, La Jolla, CA，USA)中提供的标准曲线外推时，对应的突变率为?8/kb ；
[0014]图3表示根据本文的实施方式的表达五邻体基质变体的噬菌体的分离，所述五邻体基质变体向细胞核区室的划分被增强。按照细胞结合和摄入部分描述的条件，以lxl0~8pfu将表达随机诱变的PB的T7噬菌体文库添加至1χ10~6的HeLa细胞。通过胰酶消化去除任何表面结合的噬菌体来收获细胞，然后使用市售分级分离试剂盒(QproteomeCell Compartment Kit (细胞区室试剂盒)；Qiagen Inc.，Valencia, CA, USA)进行分级分离。按照标准程序进行PEG-沉淀过夜从而从每个级分使噬菌体沉淀，然后再悬浮于TB细菌培养基中，并且添加至BLT5403细菌中以扩增分离的噬菌体。通过噬菌斑测定法来滴定扩增的噬菌体，然后在HeLa上使用如之前描述的相同滴定和条件进行再淘选。对于从细胞溶质级分获得的噬菌体，进行3轮的细胞溶质生物淘选，而对于从细胞核级分获得的进行2轮；
[0015]图4表示根据本文的实施方式的由生物淘选分离的运输变体的比对；
[0016]图5表示根据本文的实施方式的全长突变体IllC展示出增强的向细胞质和细胞核的运输。图5(A)通过丙酮沉淀法从每个级分使蛋白质沉淀，并且将小球再悬浮在40uL脱盐缓冲液中，随后通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和蛋白质印记法分析。图5(B)表示使用Image J进行的条带密度分析，显示出与野生型蛋白质相比，IllC在细胞溶质和细胞核级分中都增加。运输和细胞分级分离试验:将在烧瓶中生长的粘附HeLa细胞通过用5mLlXPBS+2mM EDTA在37°C搅拌孵育50min解粘附，并且转移至15mL圆锥形管。测量细胞的密度，并且将细胞以每管5xl06个细胞分散至分开的管。用IX PBS+Ca2++Mg2+洗涤细胞三次以去除EDTA，并且将细胞小球再悬浮于0.7ml缓冲液A(20mM HEPES，pH 7.4 ；2mM MgCl2;DMEM中的3%BSA)中。将野生型(WT)或突变体(111C，333F)五邻体基质蛋白(450ug)添加至分开的细胞等份中，并且将混合物在4°C搅拌孵育2hrs，以促进受体结合，随后在37摄氏度搅拌孵育2h，以促进结合受体的蛋白质的内化。对照处理没有接收蛋白质(NP)。然后收集并且处理细胞，以用于使用Qproteome Cel