经修饰的腺伴随病毒载体组合物的制作方法
【专利说明】经修饰的腺伴随病毒载体组合物
[0001] 相关申请 本专利申请要求享有于2012年7月6日提交的美国申请系列号61/668, 839的优先权 权益，所述申请通过引用并入本文。
[0002] 序列表 本申请包含序列表，所述序列表已通过EFS-Web以ASCII格式递交，并且以其整体通过 引用并入本文。所述ASCII副本，于2013年3月14日生成，命名为17023. 126W01_SL.txt， 并且大小为39, 125字节。
[0003] 背景 腺伴随病毒（AAV)是细小病毒科(parvoviridae family)的小的非致病病毒。AAV通 过其依靠辅助病毒进行复制而与该科其他成员区别。AAV的约5kb基因组由一段正或负极 性的单链DNA组成。基因组的末端是短的反向末端重复，其可以折叠为发夹结构并且作为 病毒DNA复制起点。在物质上（Physically)，细小病毒病毒体是无包膜的并且其二十面的 衣壳直径约20nm。
[0004] 迄今为止，已经鉴定很多种血清学上不同的AAV，并且已经从人或灵长类 中分离。Govindasamy 等，"Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4，，' J 80 (23):11556-11570 (2006)。例如， AAV2的基因组长度为4680个核苷酸并且包含两个可读框（ORF)。左侧的ORF编码非结构性 的R印蛋白，R印40、R印52、R印68和R印78,它们除了涉及单链的后代基因组的产生， 还涉及复制和转录的调节。R印68/78同样显示出具有NTP结合活性和DNA和RNA解旋酶活 性。Rep蛋白具有核定位信号和几个潜在的磷酸化位点。这些激酶位点之一的突变，导致复 制活性的丢失。
[0005] 基因组的末端是短的反向末端重复（ITR)，所述反向末端重复具有潜力以折叠为 作为病毒DNA复制起点的T形发夹结构。在ITR区中已描述对于ITR功能重要的两个元件， GAGC重复基序和末端解离位点（trs)。重复基序已显示出当ITR为线性或发夹构象时均结 合R印。该结合作用于位置R印68/78用于在trs切割，其以位点和链特异性的方式发生。
[0006] AAV的以下特征使得其成为用于基因转移的有吸引力的载体。AAV载体具有广 泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂的和不分裂的细胞，并且维持转导基因高水平的表 达。病毒颗粒是热稳定的、耐溶剂的、耐去污剂的、耐PH变化的、耐温度变化的，并且可以在 CsCl梯度中浓缩。AAV不与任何致病事件有关，并且使用AAV载体转导没有发现对细胞生 长或分化诱导任何持续的负面影响。ITR已显示为是允许完全去除病毒基因以产生载体系 统的包装所需的唯一顺式（cis)元件。
[0007] 目前需要具有改进的包装特征的AAV载体。
[0008] 概沭 在某些实施方案中，本发明提供腺伴随病毒（AAV)填充物（filler)组分(也称为"填充 片段（stuffer)序列")，其包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的长 度为3300-4200个核苷酸的核酸。
[0009] 在某些实施方案中，本发明提供腺伴随病毒（AAV)填充物组分，其由与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的长度为3300-4200个核苷酸的核酸组成。
[0010] 在某些实施方案中，本发明提供AAV载体，其包含上述填充物组分。
[0011] 附图和表格简述 图1是5pFBAAVmU6miHDSl填充片段（9110bp)的质粒图谱。
[0012] 图2是5pFBAAVmU6miHDSl填充片段(填充片段#1) (SEQ ID N0:3)的序列。
[0013] 图3提供5pFBAAVmU6miHDSl填充片段（SEQ ID NO: 1，4-11)的各种单独组分的 序列。
[0014] 图4是显不相对Htt表达的图。
[0015] 图5是5pFBAAVmU6miHDSl-填充片段的质粒图谱。
[0016] 图 6 是 5pFBAAVmU6miHDSl-填充片段（SEQ ID NO: 12)的质粒序列。
[0017] 图7提供填充片段序列(填充片段#2) (SEQ ID NO: 2)。
[0018] 图8.完整病毒体相对于空病毒体的EM评估。两个空病毒体的实例通过箭头突出 显示。该制备物只具有~4%的空病毒体，这是非常低的。
[0019] 图9.银染色以检测纯化的病毒体的衣壳完整性。几种不同的miRNA-表达构建体 与内含子Ι/Π 填充片段一同工程化入穿梭载体以生成接近野生型基因组大小。纯化的病 毒显示出最佳的VPI、VP2和VP3蛋白比例。
[0020] 表I. miR-内含子1/II病毒体的包装效率％和污染物％。
[0021] 详沭 AAV载体和表汰盒 本发明的病毒载体利用AAV载体。"AAV"载体指腺伴随病毒，并且可以用来指天然存在 的野生型病毒本身或其衍生物。除非另有要求，该术语涵盖全部亚型、血清型和假型，以及 天然存在和重组形式。如本文使用的，术语"血清型"指这样的AAV，所述AAV通过基于衣壳 蛋白与确定的抗血清(例如，存在8种已知的灵长类AAV血清型，AAV-I至AAV-8)的反应性 进行鉴定并区别于其他AAV。例如，血清型AAV-2用于指这样的AAV，所述AAV包含从AAV-2 的cap基因编码的衣壳蛋白和含有来自相同AAV-2血清型的5'和3' ITR序列的基因组。
[0022] 假型AAV指包含来自一种血清型的衣壳蛋白和包括第二种血清型的5'-3' ITR的 病毒基因组的AAV。假型rAAV期望具有衣壳血清型的细胞表面结合特性和与ITR血清型一 致的遗传特性。假型rAAV使用本领域描述的标准技术生产。如本文所用的，例如，rAAVl可 以用于指具来自相同血清型的衣壳蛋白和5' -3' ITR的AAV，或其可以指具有来自血清型1 的衣壳蛋白和来自不同AAV血清型(例如AAV血清型2)的5' -3' ITR的AAV。
[0023] 缩写"rAAV"指重组腺伴随病毒，同样指重组AAV载体(或"rAAV载体")。在一个 实施方案中，AAV表达载体使用已知技术构建，以至少提供在转录方向上的可操作地连接的 组分，包括转录起始区、目标DNA和转录终止区的控制元件。选择在哺乳动物细胞中有功能 的控制元件。产生的包含可操作地连接的组分的构建体侧接（5'和3'）有功能的AAV ITR 序列。
[0024] "腺伴随病毒反向末端重复"或"AAV ITR"意指在AAV基因组每一端发现的本领域 公知的区域，其以顺式一同作为DNA复制起点并且作为病毒的包装信号。
[0025] 已知AAV ITR区的核苷酸序列。如本文使用的，"AAV ITR"不需要具有描述的野 生型核苷酸序列，但是可以被改变，例如，通过核苷酸的插入、删除或取代。此外，AAV ITR 可以来自几种AAV血清型中的任一种，包括但不限于，AAV-I、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、 AAV7等。此外，在AAV载体中侧接所选择的核苷酸序列的5'和3' ITR不需要一定相同或 源自相同的AAV血清型或分离物，只要它们的功能如预期的，S卩，允许删除和拯救来自宿主 细胞基因组或载体的目的序列。
[0026] AAV ITR可以从包含其的AAV载体质粒中切除，并使用标准连接技术融合存在 于另一个载体中的所选核酸构建体的5'和3' ，例如Sambrook和Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY (2001)中描述的那些。例如，连接可以在20 mM Tris-Cl pH 7. 5、10 mM MgC12、 10 mM DTT、33 Pg/ml BSA、10 mM-50 mM NaCl 中与 40 μΜ ΑΤΡ、0·01-0·02 (Weiss)单位 T4 DNA连接酶在(TC (用于"粘性末端"连接）或与I mM ΑΤΡ、0·3-0·6 (Weiss)单位T4 DNA连接酶在14°C (用于"平末端"连接）完成。分子间的"粘性末端"连接通常在总DNA 浓度30-100 Pg/ml (总终浓度5-100 nM)实施。包含ITR的AAV载体在例如美国专利号 5, 139, 941中描述。特别地，在其中描述了几种可从美国典型培养物保藏中心("ATCC"）在 检索号 53222、53223、53224、53225 和 53226 下得到的 AAV 载体。
[0027] 腺伴随病毒优选地包装全长基因组，即近似天然基因组相同大小并且不太大或太 小的基因组。很多靶核酸序列或编码靶核酸序列的表达盒非常小。为避免包装片段化的基 因组，本发明人设计并测试了当连接至表达盒时在ITR之间产生长度上大小接近于正常的 基因组的核酸序列。起始序列是哺乳动物起点，但是显著地修饰以确保该"填充物组分"(也 称为"填充片段序列"）除其他之外缺乏增强子、启动子、剪接调节子、非编码RNAs或反义序 列。也就是说，填充片段序列是"沉默的"并且对表达盒不赋予活性。
[0028] 在本发明中，用于AAV载体的合适的DNA分子将包括，例如，填充片段序列和编 码本发明siRNA分子的表达盒。很多表达盒非常小，例如那些表达抑制RNAs (siRNAs和 shRNAs)的表达盒。因此，有必要添加序列至盒，从而构成全长或接近全长的AAV基因组。 如果只有小基因组用于AAV生产，则重组病毒体会是异质的并且包含各种大小基因组。这 是因为病毒喜欢包装全长基因组，所以它会挑取其他DNA片段以填充空间。填充片段不能 太大，因为高于野生型基因组大小的105%的AAV基因组将通常不能包装。
[0029] 在某些实施方案中，本发明提供腺伴随病毒（AAV)填充物组分(也称为"填充片段 序列")，其包含与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2具有至少90%同一性的长度为3300-4200 个核苷酸的核酸。 {SEQ10 ΝΟ?) GAAlirriGGCTAirCCAGGlTOCCIlWirrCATCGCAAATGGGACGTIAAGAGeCiCAGACiAGAAl' Λ??1ΛΛ〔ΑαΑΛΑΟ?ΤΤ€ΤΑΑ;ΓΑΠ?01Χ、Α.Τ-Π-ΑΛ?ΟΤ?ΤΑΜ:; 丁 AntiWCTTTBT AAACtCTCC ATWTTTrfCCAGGAATTGCTGCiACM^riTGGCTTCX)TG 丁 GTCnrTGAGGACf'GTAGGCCATG CTAG〇nOTG〇TTiTAGGT€icAciGTGCirrrrcTriC)(nTiiT：iccrrric：Trc^rrrcc:CA'rc,TCCTCTT CTTlXJTITCCAGCCATrrCIXrCrTATGClTAAGTTrOGTGCAGCACiCIGTTTGGCIOCTCTC^AGATT CCTOCTTCCTCAOATGCTOTArilTClTrAGGCCCAGCCiGGCTGGCAGCOGGA