专利名称：生产rna病毒和基于rna病毒的载体颗粒的组合物及方法
技术领域：
本发明总地涉及病毒学、医药学和基因治疗领域。具体地说，本发明涉及使用非感染性辅助痘病毒生产重组丙型肝炎病毒(HCV)、鼻病毒、流感病毒及衍生于慢病毒属的载体颗粒的方法。本发明的组合物和方法被用于生产实质上没有有复制能力的辅助病毒的复制缺陷型基因治疗载体制备物。
丙型肝炎病毒(HCV)、逆转录病毒、鼻病毒、流感病毒和慢病毒等病毒均为含有由RNA组成的基因组的病毒，并且都是疫苗和基因治疗载体的潜在来源。减毒的病毒不会致病，但因为缺乏培养受损伤之突变体的系统，因而使减毒病毒的筛选和生产遇到很大困难。如其他的基因治疗载体一样，从RNA病毒衍生的载体包含有外源基因的表达盒。这些载体可被包装到病毒颗粒中，并通过感染被送入靶细胞。因为在细胞培养系统中的包装效率很差，从而使RNA病毒作为基因治疗载体的应用受到限制。
本发明提供使用无活力、有复制缺陷的辅助痘病毒重组体，在细胞培养系统中或于体外生产RNA病毒基因组序列和重组RNA病毒以及RNA病毒衍生的载体的方法。这些方法可以在细胞培养系统内和体外产生RNA病毒基因组和病毒颗粒，而不依赖于他们的天然复制途径，从而避开任何细胞屏障的限制。本发明还提供按这些方法生产的新的病毒序列。
本发明提供生产包壳RNA病毒的方法，其包括以下步骤a)提供多肽编码序列，其中所说的多肽能够形成衣壳，并在真核细胞中包装RNA病毒基因组序列；b)提供包含RNA病毒基因组序列的构建体，其中所说的基因组序列被正确地连接到噬菌体启动子和噬菌体转录终止子序列之间，并且所说的噬菌体启动子和噬菌体转录终止序列是可操作地匹配的；c)提供噬菌体RNA聚合酶的编码序列，该编码序列与步骤b)的噬菌体启动子可操作地匹配，并可操作地连接到痘病毒启动子上；d)在允许序列表达并组装含有RNA病毒基因组序列的衣壳的条件下，在真核细胞胞质中共同表达步骤a)的多肽编码序列、步骤b)的RNA病毒基因组序列和步骤c)的噬菌体RNA聚合酶编码序列，从而制得包壳的RNA病毒。
根据本方法的一个可选择的方面，如果步骤b)的构建体(即含有可操作地连接到噬菌体启动子和噬菌体转录终止序列上的RNA病毒基因组序列的构建体)没有功能性内部核糖体进入位点(IRES)，则将编码衣壳形成多肽的基因克隆到质粒或病毒载体中。步骤a)的编码序列被可操作地连接到在动物细胞胞质中有活性的启动子上。
一个方面，将噬菌体聚合酶的编码序列克隆到复制缺陷型痘病毒中；可将该编码序列可操作地连接到步骤b)的与之相匹配的噬菌体启动子上。
根据本发明方法的一个方面，含有RNA基因组序列的构建体可包括质粒或病毒载体。
根据本发明方法的一个方面，噬菌体可选自T3、T7和SP6噬菌体。T3噬菌体RNA聚合酶与T3噬菌体启动子相配合；T7噬菌体RNA聚合酶与T7噬菌体启动子相配合；SP6噬菌体RNA聚合酶与SP6噬菌体启动子相配合。构建体可包含T3噬菌体转录终止序列和T3噬菌体启动子，或T7噬菌体转录终止序列和T7噬菌体启动子，或SP6噬菌体转录终止序列和SP6噬菌体启动子。
根据本发明方法的一个方面，在真核细胞胞质中有活性的启动子可以是衍生于痘病毒家族病毒成员的启动子。痘病毒家族的病毒可以是正痘病毒属的病毒。正痘病毒属的病毒可以是痘病毒。痘苗病毒启动子可以是晚期、中期或早期痘苗病毒启动子。痘病毒可以是正痘病毒属的病毒，如痘苗病毒。或者，痘病毒可以是选自下列一组病毒属的病毒副痘病毒，禽痘病毒，山羊痘病毒，亚塔痘病毒，野兔痘病毒，猪痘病毒和软疣痘病毒。
根据本发明方法的一个可选择的方面，真核细胞胞质包括真核细胞，或者，真核细胞胞质包括体外制备物。
根据本发明方法的一个方面，所说的RNA病毒是肝炎病毒，如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或者在其核心内含有RNA前体的未成熟乙型肝炎病毒。或者，RNA病毒可以是慢病毒、鼻病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)如HIV-1(在一个实施方案中，所说的人类免疫缺陷病毒缺少Rev反应元件或被膜序列)、沙砾病毒、LCMV、副流感病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、星状病毒、丝状病毒、冠状病毒(详见下文讨论，因为本发明包含所有RNA病毒)。
根据本发明方法的一个可选择的方面，有复制缺陷的、包壳的RNA病毒是感染性的或非感染性的。
根据本发明方法的一个可选择的方面，该方法生产的制备物实质上不含有复制能力的痘病毒，例如，该方法生产的制备物99％是没有复制能力的痘病毒，或99.5％是没有复制能力的痘病毒，或100％是没有复制能力的痘病毒(参见下文所述的“实质上没有”的定义)。
一个方面，复制缺陷型痘病毒缺乏病毒复制所需的多肽。病毒复制所需的多肽可以是病毒衣壳多肽。复制缺陷型痘病毒之所以是有缺陷的，是因为其存在转录激活或转录调节缺陷。
另一个方面，步骤a)的一个，几个或全部多肽编码序列被掺入步骤b)的RNA病毒基因组序列中，并且该构建体进一步包含一个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES可以从任何来源获得(详见下文讨论)。
本发明提供一个生产包壳RNA病毒的系统，其包括以下成分a)多肽编码序列，其中所说的多肽能够包装RNA基因组序列，并且各编码序列均被克隆到构建体中，从而使之可操作地连接到启动子上；b)包含被可操作地的连接到噬菌体启动子和噬菌体转录终止序列上的RNA病毒基因组的构建体，其中所说的RNA病毒基因组序列可被步骤a)的多肽包装到衣壳中；c)与步骤b)的噬菌体启动子可操作地配合的噬菌体RNA聚合酶的编码序列，其中所说的编码序列被克隆到复制缺陷型痘病毒中，从而被可操作地连接到一个痘病毒启动子上；并且，其中在允许该编码序列表达并组装包含有RNA基因组序列的衣壳的条件下，在真核细胞胞质中共同表达步骤a)的多肽，步骤b)的RNA基因组序列及步骤c)的噬菌体聚合酶编码序列，从而产生包壳的RNA病毒。
根据该系统的一个方面，步骤a)的一个，几个或全部多肽编码序列被掺入步骤b)的RNA病毒基因组序列中，并且所获得的构建体进一步包含一个内部核糖体进入位点(IRES)。
本发明提供包含有RNA基因组序列并在其3’末端带有2’，3’-环磷酸的重组病毒基因组序列。本发明提供包含RNA基因组序列并在其3’末端带有2’，3’-环磷酸的重组病毒颗粒。如下文所述，RNA基因组序列可衍生于任何RNA病毒。
本发明提供一种包含有RNA基因组序列和噬菌体RNA聚合酶转录终止子序列及其3’末端polyA序列的重组病毒基因组序列。本发明提供一种包含RNA基因组序列和噬菌体RNA聚合酶转录终止子序列及其3’末端polyA序列的重组病毒颗粒。如下文中详细讨论的，RNA基因组序列可衍生于任何RNA病毒。
本发明提供缺少Rev反应元件(RRE)或被膜序列，并包括噬菌体RNA聚合酶终止子序列的重组慢病毒基因组序列。本发明提供包含RNA基因组序列的重组慢病毒颗粒，所说的序列缺少Rev反应元件或被膜序列，并包含噬菌体RNA聚合酶终止子序列。
本文中引用的所有的出版物、专利和专利申请均全文列为本文参考文献。
本发明的一个或多个实施方案将在附图和详细描述中给出。借助这些附图和详细描述，将会更为清楚地理解本发明的其他特征、目的及优点。
图2是图解描述如实施例1中详细说明的包含有HCV多聚蛋白编码区的pVHCV质粒。
图3是图解描述如实施例1中详细说明的pVAC质粒。
图4是图解描述如实施例1中详细说明的pT7HCV-RIB质粒；该质粒包含位于噬菌体T7启动子(PT7)与噬菌体T7终止子(TT7)之间的HCV基因组RNA的DNA拷贝和发夹结构-核酶(Rz)序列。
图5是图解描述如实施例2中详细说明的pRHIN质粒；在该质粒中，鼻病毒的多聚蛋白开放读码框(ORF)位于痘苗病毒晚期启动子与痘苗病毒终止子之间。图中细线代表PUC19质粒的主链序列。
图6是图解描述如实施例2中详细说明的pT7RHIN质粒；该质粒中，T7启动子和T7终止子之间依次插入了鼻病毒基因组RNA的DNA拷贝，该拷贝包括5’UTR、多聚蛋白编码区、带有poly(A)的3’UTR，和发夹结构-核酶(Rz)的cDNA。图中细线代表pUC19质粒的主链序列。
图7是图解描述如实施例3中详细说明的质粒pINF 1-8；该质粒中，流感病毒ANS和PB2的ORF与两个分立的痘苗病毒晚期启动子相连接。图中箭头代表转录的方向，细线代表pUC19质粒的主链序列。
图8是图解描述如实施例3中详细说明的pT7INF1质粒；该质粒中，A型流感病毒之RNA片段1的cDNA与发夹结构-核酶编码序列相连接。整个编码区域位于T7启动子和T7终止子之间。
图9是图解描述如实施例4中详细说明的pGAG-POL质粒；该质粒中，HIV-1 HXB2 gag/pol多聚蛋白编码区位于痘苗病毒早/晚期启动子(pvacE/L)和痘苗病毒终止子(Tvac)之间。图中细线代表PUC19质粒的主链序列。
图10是图解描述如实施例4中详细说明的pVSVG；在此质粒中，水疱性口腔炎病毒G(VSV-G)蛋白编码区位于噬菌体T7启动子(PT7)和噬菌体T7终止子(PT7)之间。图中细线代表PT7的主链序列。
图11是图解描述如实施例4中详细说明的pT7EGFP质粒；在此质粒中基因排列次序如下噬菌体T7启动子(PT7)，三联鸟苷酸、HIV-1 HXB2 5’LTR、HIV-1 HXB2包装信号、巨细胞病毒(CMV)启动子、增强型绿色荧光蛋白编码区、HIV-1 HXB2多聚嘌呤段(PPT)、HIV-1 HXB2 3’U3、三联鸟苷酸、HIV-1HXB2 3’R、噬菌体T7终止子(TT7)。图中细线代表pBR322质粒的主链序列。
在各附图中，同样的符号代表同样的元件。
本发明的一个目的是提供一种使用无复制能力的复制缺陷型重组痘病毒生产包壳的RNA基因组序列，RNA病毒载体和RNA病毒颗粒的高滴度制备物的方法。所说的RNA病毒和基因组序列可以是任何RNA病毒，例如包括肝炎病毒(如甲型肝炎病毒(HAV)，HCV)、鼻病毒、流感病毒和慢病毒。使用本发明方法生产的RNA病毒载体和包壳产物基本上或完全没有感染性痘病毒。本发明提供的方法还可用于生产任何其他RNA病毒。
根据本发明的一个方面，生产HCV、鼻病毒，和流感病毒等RNA病毒的方法包括以下步骤a)用包含位于噬菌体启动子和噬菌体转录终止子之间的病毒基因组RNA编码区的质粒和包含病毒蛋白转录单元的质粒共转染细胞；b)用包含噬菌体RNA聚合酶基因但无增殖能力的痘病毒重组体感染所说的细胞；c)收获RNA病毒颗粒。
根据本发明的一个方面，生产慢病毒载体颗粒的方法包含如下步骤a)用包含位于噬菌体启动子和噬菌体转录终止子之间的慢病毒衍生之载体编码区的质粒和包含病毒蛋白转录单元的质粒共转染细胞；b)用含有噬菌体RNA聚合酶基因但无增殖能力的痘病毒重组体感染所说的细胞；c)收获RNA病毒颗粒。
本发明还提供没有感染性痘病毒的RNA病毒(如HCV、鼻病毒、流感病毒)的制备物，所说的RNA病毒包括带有噬菌体RNA聚合酶的终止子序列或其3’末端有2’，3’-环磷酸的病毒体RNA。
本发明还提供没有感染性痘病毒的慢病毒载体颗粒的制备物，所说的载体颗粒包括带有噬菌体RNA聚合酶终止子序列，但没有Rev反应元件或任何其他被膜序列的载体。HCV、鼻病毒、流感病毒和慢病毒载体的生产用于生产本发明的RNA病毒(如HCV、鼻病毒，流感病毒，和慢病毒衍生的载体)的复制缺陷型辅助痘病毒可以是重组体痘苗病毒。复制缺陷型痘病毒具有一个插入在其基因组的胸腺嘧啶核苷酸激酶区的噬菌体RNA聚合酶基因。该RNA聚合酶的表达是由痘病毒如痘苗病毒启动子驱动的。例如，Fuerst等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986 838122-26)描述了生产包含噬菌体RNA聚合酶基因的痘苗病毒重组体的方法。
在一个方面，除含有噬菌体RNA聚合酶基因外，复制缺陷型辅助痘病毒(如辅助痘苗病毒重组体)还具有复制缺陷，如必要基因的缺陷，例如缺少必要基因，或具有可诱导的必要基因，或具有处于非痘病毒来源之RNA聚合酶启动子控制下的必要基因。例如，可使用D13L缺陷型痘苗病毒重组体VT7ΔD13L生产RNA病毒，如HCV、鼻病毒、流感病毒和慢病毒衍生的载体。D13L基因是必要基因，其表达产物是病毒颗粒组装所必须的，其表达的限制或阻抑对于病毒转录和DNA复制没有影响(如参见Zhang(1992)Virol.187643-653)，但能够阻碍痘苗病毒颗粒的形成。因此使用D13L阴性痘苗病毒重组体生产如HCV、鼻病毒、流感病毒和慢病毒载体等RNA病毒颗粒，可得到几乎没有辅助牛痘病毒污染的制备物。
在下文描述的举例方法中，D13L阴性痘苗病毒重组体的构建和增殖是按照Falkner等人的美国专利5,770,212(1998)中描述的改良方法完成的。在D13L阴性痘苗病毒重组体中，D13L的ORF通过同源重组被细菌鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因和LacZ基因所取代。gpt和LacZ基因的表达受痘苗病毒早/晚期启动子的控制。缺陷型痘苗病毒是在HeLa细胞中筛选和增殖的。所说的HeLa细胞被编码处于痘苗病毒晚期启动子控制下的D13L基因的质粒瞬时转染。
除了具有必要基因缺陷的缺陷型痘苗病毒重组体之外，本发明的方法中还可使用条件致病性的、诱导子依赖性的或RNA聚合酶(如噬菌体RNA聚合酶)依赖性的痘苗病毒重组体生产RNA病毒。这类重组体中的一种包括有IPTG可诱导的D13L基因(参见Zhang(1992)Virol.187643-53)。如果没有IPTG，痘苗病毒重组体的复制便会被到抑制。或者，D13L基因的痘苗病毒启动子也可被噬菌体启动子取代。如果D13L基因的启动子是噬菌体启动子，而又没有噬菌体RNA聚合酶，则D13L基因产物便不能产生。
根据本发明的一个方面，为了由克隆的cDNA产生HCV，须使用两个质粒一个质粒包含被克隆在噬菌体启动子(如T7，SP6或T3启动子)和噬菌体转录终止子之间的全长HCV基因组RNA的cDNA拷贝。这样一个转录单元的转录是借助识别启动子和终止子的噬菌体RNA聚合酶完成的，这种转录将产生特定大小的RNA分子。另一个质粒则包含直接连接到上游痘苗病毒晚期启动子上的病毒多聚蛋白的编码序列。使用这些质粒共转染对痘苗病毒敏感的适当的宿主细胞。然后再用含有处于痘苗病毒启动子(如痘苗病毒晚期或早/晚期启动子)控制下的噬菌体RNA聚合酶基因的辅助痘苗病毒重组体感染之。
一个方面，辅助痘苗病毒重组体还包括复制或包壳所必需的基因的缺陷，或者有一个可诱导的必要基因。例如，30℃保温72-96小时后，收集细胞培养物并通过0.2μm滤膜过滤以除去残存的牛痘病毒颗粒。滤液中即含有HCV病毒体。使用本发明所提供的方法生产的HCV病毒颗粒与天然病毒颗粒相似，但它们的病毒体RNA分子是和天然的RNA分子不同的。它们在3’末端包含一个噬菌体RNA聚合酶的终止子序列，而且大约有一半的RNA分子在此终止子序列后带有poly(A)尾部。在其5’末端，病毒体RNA可以有3个额外的核苷酸，而且5-10％的RNA带有帽结构。该HCV制备物能够感染MT-2和Huh-7细胞，从而产生负链RNA。
为了得到其中病毒体RNA不含有噬菌体转录终止序列(如T7终止子序列)的RNA基因组序列(如HCV病毒体)，可使用含有发夹结构-核酶盒(参见Altschuler(1992)，Gene 12285-90)的质粒进行体内RNA病毒颗粒(如HVC)的合成。在此质粒中，编码病毒体RNA的cDNA的3’末端与发夹结构-核酶cDNA相连接(见图4)。然后将病毒RNA-核酶编码序列置于噬菌体启动子和噬菌体终止子之间。转录之后，由发夹结构-核酶引发的顺式切割反应将自动切割所得到的转录产物，以产生3’末端不带有噬菌体终止子序列的病毒体RNA。所得到的病毒体RNA因其3’末端带有2’，3’-环磷酸，故在结构上有别于原来的RNA。当使用该构建体表达HCV病毒体RNA时，所产生的病毒颗粒的滴度将得以提高。
例如，在生产慢病毒RNA的方法中，需要使用两个质粒。其中一个含有由病毒体RNA的cDNA组成的DNA片段，该片段后面带有70个核苷酸的Poly(A)尾部，再后面是发夹结构-核酶的cDNA。该DNA片段侧翼接有噬菌体启动子和噬菌体终止子。另一个质粒含有位于痘苗病毒晚期启动子下游的RNA病毒(如鼻病毒)多聚蛋白编码区。用这两个质粒共转染对痘苗病毒和鼻病毒均敏感的细胞。然后再用含有处于痘苗病毒晚期或早/晚期启动子控制下的噬菌体RNA聚合酶基因的辅助痘苗病毒重组体感染被转染的细胞。30℃下保温72-96小时后，收集细胞培养物上清并通过0.2μm滤膜过滤，滤液中即含有感染性RNA病毒。所产生的病毒颗粒含有其3’末端带2’，3’-环磷酸的RNA分子。
例如，在生产流感病毒的方法中，须使用两种类型的质粒。一种类型的质粒包含病毒体RNA的cDNA拷贝，其后是发夹结构-核酶的cDNA(如参见Chowrira(1994)J.Biol.Chem.26925856-64)。整段cDNA被置于噬菌体启动子和噬菌体终止子之间。A型和B型流感病毒有8个单链片段和负链RNA，而C型流感病毒则有7个。为了表达整套片段，须构建8个质粒，从而使每个质粒编码一个RNA片段。另一种类型的质粒包含位于痘苗病毒晚期启动子下游的病毒蛋白(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS)编码区序列。每种质粒编码两种病毒蛋白。用十二个质粒(8个用于RNA基因组片段，4个用于病毒蛋白)共传染对痘病毒和流感病毒均敏感的细胞，之后再用含有噬菌体RNA聚合酶基因的辅助痘苗病毒重组体感染之。30℃下保温72-96小时后，收集培养物上清并用滤膜过滤。滤液中即含有流感病毒颗粒。所产生的病毒颗粒包含在其3’末端带有2’，3’-环磷酸的RNA分子。
例如，在生产慢病毒衍生的载体颗粒的方法中，需要使用三个质粒。其中一个质粒包含编码位于噬菌体启动子和相应的转录终止子信号之间的载体RNA的cDNA。该eDNA片段包含有5’长未端重复系列(5’LTR)、包装信号、连接在适当启动子(如CMV、SV40启动子及其他组织特异性启动子)上的所需蛋白的ORF、多聚嘌呤段，以及3’LTR。另外一个质粒包含了编码包装所需之Gag-Pol蛋白的cDNA。第三个质粒包含编码导向和进入细胞所需之病毒被膜蛋白的cDNA。该cDNA被连接到痘病毒启动子(如痘苗病毒晚期启动子)上。用这些质粒共转染对痘苗病毒敏感的细胞，然后再用含有处于痘苗病毒启动子(如晚期或早/晚期启动子)控制下的噬菌体RNA聚合酶基因的复制缺陷型辅助痘苗病毒重组体感染之。30℃保温72-96小时后，从培养物上清收集载体颗粒并通过0.2μm滤膜过滤。被包装在颗粒中的载体含有噬菌体终止子序列，而且大约有一半的载体在噬菌体终止子序列后带有poly(A)尾部。在一个方面，载体并不包含其他方法中所需要的细胞转运元件(如Rev反应元件)。该方法可用于大规模生产载体颗粒制备物。制备物的滴度可高达108cfu/ml。
如果转录是以两个或三个鸟苷酸(G)开始的，则借助噬菌体RNA聚合酶完成的RNA合成将更为有效。因此，根据本发明的一个方面，设计所得到的转录产物使之在其5’末端含有双或三联鸟苷酸标志。就某些慢病毒载体而言，为了使反转录能够顺利进行，可对RNA载体进行必要的修饰。例如，从借助T7 RNA聚合酶合成的载体RNA反转录得到的强终止DNA将在其3’末端含有两个或三个鸟苷酸。为了使强终止DNA与3’末端LTR进行碱基配对，可将一定数量的(1，2，或3个)鸟苷酸插入到3’LTR的U3和R之间(如参见Coffin，Fields Virology，3d.，phi ladelphia，New YorkLippincott-RavenPublisher，1996，pp.1767-1847)。
辅助痘苗病毒感染后的培养温度对于生产高产率病毒和载体颗粒是非常重要的。虽然痘苗病毒复制的最适温度约为37℃，但生产RNA病毒和载体颗粒的最适温度却是29±2℃。例如，在30℃生产的HCV病毒颗粒的产率比在37℃下生产的HCV病毒颗粒的产率要高500-1000倍。在30℃下生产的HIV衍生的载体颗粒的滴度为108cfu/ml培养物，比在37℃下生产的载体颗粒的产率大约高1000倍。定义除特别定义者外，本文中所使用的所有科技术语均具有本发明所属领域专业人员所熟知的通用的含义。除特别指出者外，本文使用的下列术语具有如下所述的含义。
术语“RNA病毒”指的是其基因组为RNA的病毒。RNA病毒的具体例子包括HAV、未成熟的HBV、HCV、LCMV、鼻病毒、流感病毒、沙砾病毒、副流感病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、星状病毒、丝状病毒、冠状病毒。术语“RNA病毒”还包括逆转录病毒家族的病毒，如慢病毒属或泡沫病毒属，全病毒科、烟草脆裂病毒属的病毒、丁型病毒、昆虫病毒如Nyamanini virus。RNA病毒还包括植物病毒，如那些见于真菌传杆状病毒属的病毒，伞形植物病毒属的病毒，欧防风黄点病毒科的病毒，玉米退绿斑驳病毒属的病毒，Iaedovirus属和Viroids属的病毒。
术语“痘病毒”指的是痘病毒科的所有病毒，包括脊椎动物病毒亚科的所有病毒，例如正痘病毒属的病毒(例如痘苗病毒)、付痘病毒属的病毒、禽痘病毒属的病毒、山羊痘病毒属的病毒、野兔痘病毒属的病毒、软疣痘病毒属的病毒、猪痘病毒属的病毒、亚塔痘病毒属的病毒、昆虫痘病毒亚科的病毒，以用其他在分类学上尚未确定的病毒，如加州港海豹痘病毒、cotia病毒、软疣样痘病毒、黑尾鹿痘病毒等。
术语“痘病毒启动子”包括任何一种痘病毒启动子，其中有许多都是本领域已知的。痘病毒如痘苗病毒，是在真核细胞的胞质内复制的。痘病毒启动子的类别包括牛痘病毒早期、中期、和晚期启动子(如参见Broyles(1997)J.Biol.Chem.27335662-35667；Zhu(1998)J.Virol.723893-3899；Holzer(1999)Virology 253107-114；Carroll(1997)Curr.Opin.Biotechnol 8573-577；Sutter(1995)FEBS Lett.3719-12)。术语“启动子”是指一批指导核酸转录的核酸控制序列。仅就在本文中的应用来说，启动子包括在转录起始位点附近的必不可少的核酸序列，如II型聚合酶启动子中的TATA元件。启动子还可以选择性地包括距离转录起始位点约几千个碱基对的远端增强子或阻抑元件。“组成型”启动子是指在大多数分环境和发育条件下有活性的启动子。“可诱导型”启动子是指处于环境或发育调节下的启动子。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子，或是转录因子结合位点序列)与第二个核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导相当于第二个序列的核酸的转录。
术语“缺陷型痘病毒”是指其亲代痘病毒的必要基因(复制或包壳所需的任何基因)有缺陷、突变或经受重组操作的痘病毒。例如，可工程化改造的必要基因是处于可诱导性启动子或只被来源于痘病毒以外种属的RNA聚合酶使用的启动子的控制下的。术语“无活力的痘病毒”指的是有致死性的或条件致死性突变或缺陷的痘病毒。术语“诱导子依赖性，条件致死性病毒”是指在其基因组中含有的可诱导的必要基因的病毒突变体。“可诱导的必要基因”是指至关重要的，并只在特异性启动子存在下才得以表达的基因。“复制缺陷的”是指不含有对在生理(如体内)条件下复制和形成含基因组的衣壳所必需之遗传信息的病毒基因组。
术语“突变的RNA病毒”指的是其基因组RNA所包含的核苷酸序列与相应的野生型RNA病毒不同的RNA病毒。术语“重组RNA病毒”指的是基因组中包含有外源序列的RNA病毒，这些外源序列可以是从其他种属获得的，或者是体外合成的，或者是已经过人工操作的，例如已重排的。
术语“RNA病毒衍生的载体”是指包含有外源基因表达盒，并且能被包装成病毒颗粒的RNA。术语“载体RNA”是指包含有外源基因表达盒，并且能被包装成病毒颗粒的RNA。“病毒颗粒”是指其中全部或部分病毒基因组核酸被包装的病毒体。“载体颗粒”是指其中编码表达盒的核酸被包装的病毒颗粒。
本文中使用的术语“表达盒”是指能够影响在与相应序列相配合的宿主细胞中表达的核苷酸序列。表达盒至少包括与多肽编码序列可操作地连接的启动子；并且还可以与其他序列，如转录终止信号可操作地连接。还可能使用在表达中起辅助作用的或必不可少的附加因子，如增强子。“可操作地的连接”是指连接到DNA序列上游的启动子上，从而使该启动子可以介导DNA序列的转录。因此，表达盒也包括质粒、表达载体、重组体病毒、重组“裸DNA”载体等存在形式。“载体”包含可以感染、转染、瞬时性或永久性转导细胞的核酸。如人们所知道的，载体可以是裸核酸或与蛋白或脂质相复合的核酸。载体可以选择性的包含病毒或细菌核酸，和/或蛋白质，和/或膜成分(如细胞膜、病毒脂质被膜等)。载体包括DNA片段可以与之连接并在其上面复制的RNA复制子。因此载体包括但并不仅限于RNA、自身复制的环状或线性DNA或RNA(如质粒、病毒、和其类似物，参见美国专利5,217,879)，并包括表达或不表达的质粒。当重组微生物或细胞培养物被描述成携带表达载体时，即意味着该载体包括有染色体外线状或环状DNA以及被掺入到宿主染色体中的DNA。当载体被保留在宿主细胞内时，该载体或者可在细胞有丝分裂期间作为自主结构被稳定地复制，或者被整合到宿主细胞基因组内。
术语“噬菌体启动子”和“噬菌体转录终止序列”分别是指任何一种噬菌体启动子和噬菌体转录终止序列，其中有很多是本领域已知的。例如包括来源于T3、T7和SP6噬菌体的启动子和终止序列。克隆和操作噬菌体启动子和噬菌体终止序列的方法是本领技术人员熟知的(如参见Yoo(2000)Biomol.Eng.16191-197；Bermudez-Cruz(1999)Biochimie 81757-764；Greenblatt(1998)Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.63327-336；Cisneros(1996)Gene 181127-133；以及美国专利6,143,518、6,110.680、6,096,523、5,891,636、5,792,625)。术语“噬菌体聚合酶”是指任何一种噬菌体聚合酶，包括那些与T3、T3和SP6噬菌体启动子相匹配的聚合酶。克隆和操作聚合酶的方法是本领域技术人员熟知的(如参见Temiakov(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9714109-14114；Paylov(2000)NucleicAcids Res.284658-4664；Jeng(1997)Can.J.Microbiol.431147-3830；美国专利5,604；118、5,556,769)。
术语“药物组合物”是指适于作为药物用于治疗对象的组合物。本发明的药物组合物是包含药学上有效量的组合物的制剂，其中包括本发明的载体与药学上可接受的载体的组合(即载体系统)。本发明提供一种制备物，该制备物包含基本上或完全没有辅助痘病毒的药物组合物。术语“基本上没有辅助痘病毒”或“基本上没有复制能力的病毒”是指制备物(如因为感染本发明的载体系统所得到的产物)中有少于大约0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或1％的衣壳可以在具有复制能力的细胞中复制而不需要其他来源的补充，如细胞、其他病毒、质粒等。在可选择的实施方案中，药物组合物有100％的纯度，而且辅助病毒的纯度可以达到大约99.99％、99.98％、99.97％、99.96％、99.95％、99.93％、99.90％、99.5％、99.0％、98％、97％、95％、93％、90％。
术语“具有复制能力的细胞”或“具有复制能力的宿主细胞”或“生产细胞”包括能够支持痘病毒基因组复制和衣壳包装的任何细胞。
术语“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指所有不依赖于mRNA 5’帽结构而启动核糖体“内部”进入的5’非翻译区。IRES是高度明确的RNA二级结构，如保守的茎-环结构。作为一种未见于真核细胞的机制，其为介导帽结构非依赖性病毒蛋白翻译起始的内部核糖体进入位点。IRES虽然未见于真核细胞，但可见于包括HCV在内的各种RNA病毒(如参见Jang(1990)Enzyme44292-309；Honda(1990)J.Virol.731165-1174；Psaridi(1999)FEBS Lett.45349-53，以及美国专利6,193,980、6,096,505、5,928,888、5,738,985)。
术语“核酶”描述可以自身切割的DNA序列，许多核酶及分离、克隆、操作核酶序列的方法，都是本领域技术人员已知的(如参见美国专利6,210,931、6,043,077、6,143,503、6,130,092、6,087,484、6,069,007、5,912,149、5,779,260、5,631,115)。
术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。该术语包括核酸，如寡核苷酸，其中包括天然核苷酸的已知类似物。该术语还包括带有人工合成的主链的核酸样结构(如参见Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach，ed.F.Eckstein，Oxford Univ.Press(1991)；Anti sense Strategies，Annalsof the N.Y.Academy of Sciences，Vol.600，Eds.Baserga et al.(NYAS1992)；Milligan(1993)J.Med.Chem.361923-1937；Antisense Researchand Applications(1993，CRC Press)，WO97/03211；WO96/39154；Mata(1997)Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197；Stauss-Soukup(1997)Biochemistry 368692-8698；Samstag(1996)Antisense Nucleic AcidDrug Dev.6153-156)。
在本文中，重组体是指体外合成的或人工操作的多核苷酸(如“重组多核苷酸”)，该术语还指在细胞或其他生物学系统中使用重组多核苷酸生产基因产物的方法，或由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。“重组手段”还包括将含有各种编码区或结构域或不同来源启动子序列的核酸连接到表达盒或表达载体中，在本发明的载体中进行可诱导性或结构性表达。通用技术本发明的核酸序列和用于实现本发明的其他核酸，包括RNA、cDNA、基因组DNA、载体、相关的病毒或其杂合体，均可从各种来源中分离得到并经受遗传工程操作、扩增，和/或被重组表达。
另外，也可以使用已知的化学合成技术体外合成这些核酸。所说的技术可参见Carruters(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.253440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19373-380；Blommers(1994)Biochemistry 337886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.6890；Brown(1979)Meth.Enzymol.108109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.221859；以及美国专利4,458,066。然后可合成互补链并将这些互补链在适当条件下一起退火，或者是使用DNA聚合酶，将此互补链与适当的引物序列相加合，以得到双链DNA片段。
核酸操作技术，例如造成序列突变、亚克隆、探针标记、测序、杂交等在科学文献和专利文献均已有充分描述(如参见Sambrook，ed.Molecular CloningA Laboratory Manul(2nd.ed.)，Vols.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory(1998)；Current Protocols In MolrcularBiology，Ausubel，ed.John wiley &Sons，Inc.New York(1997)；LaboratoryTechniques In Biochemi stry And Molecular BiologyHybridizationWtth Nucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993))。
核酸、载体、衣壳、多肽等的分析和定量可以使用许多通用的方法完成，如NMR等分析生物化学方法、分光光度法、放射显影法、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散层析、免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验等各种免疫学方法、Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其他核酸或靶或信号扩增技术、放射标记、闪烁计数及亲和层析等。RNA病毒丙型肝炎病毒本发明提供新的重组丙型肝炎病毒(HCV)基因组序列、包含这些HCV序列的病毒颗粒以及生产HCV颗粒的方法。HCV是单股正链RNA病毒，其基因组由5’端非编码区(5’UTR)、多聚蛋白编码区和3’UTR组成的。在5’端非编码区(5’UTR)内存在一个内部核糖体进入位点(IRES)(Houghton，Fielads Virology pp.10351058)。已发现一个肝炎病毒的IRES存在于341个核苷酸的5’端非编码区内，其为HCV基因中的最保守的部分(参见Kolupaeva(2000)J.Virol.746242-6250；Hellen(1999)J.Virol.Hepatology 670-87)。目前已报道了几株HCV的全长基因组RNA序列(如参见Choo，et al.Sience 244359；Aizaki et al.Hepatology 20621-627；Tahaka(1995)Biochem.Biophs.Res.Comm.215744)。
HCV是一种尚未在细胞培养物培养成功的RNA病毒。据报道，从病人血清中获得的HCV能够感染人原代肝细胞(Carlon(1993)Archives ofVirology 831-39；Iacovacci(1993)Research in Virology 144273-279；Faurnier(1998)J.Gen.Virol.792367-2374)、外周血单核细胞(Bouffard(1992)J.Infectious Disease 1661276-1280)人T细胞系(HPBMa10-2)、B细胞系(Daudi)(Bertolini(1993)Research inVirology144281-285；Shimizu(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA895477-5481)和肝细胞系(Tagwa(1995)J.Gastroenterol.Hepatol.10523-527；Seipp(1997)J.Gen.Virol.782467-2476；Yoo(1995)J.Virol.6932-38)。然而，HCV在这些细胞中的复制通常是瞬时的和低效的。在细胞培养物中生产HCV的另一种方法是使用体外“失控”转录方法(参见Yoo(1995)J.Virology 6932-38)合成的HCV基因组RNA转染到人肝细胞系Huh7中。尽管有报道说被转染的细胞中可产生感染性病毒颗粒，但这种方法的病毒复制效率很差。
重组RNA病毒基因组序列和载体(包括HCV基因组和病毒颗粒)的生产与操作方法是本领域已知的(如参见美国专利6,156,495、6,153,421、6,110,465、5,981,274、5,849,523和5,789,559)。鼻病毒本发明提供新的重组鼻病毒基因组序列，包含这些序列的病毒颗粒以及生产鼻病毒颗粒的方法。
鼻病毒是单股正链RNA病毒。其基因组由单链RNA分子组成，并包括5’端非编码区(5’UTR)、多聚蛋白编码区和在带有poly(A)未端的3’UTR以及一个小分子蛋白VPg(VPg紧靠基因组的5’末端)。已公布了全长基因组RNA的序列(参见Callahan(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82732-736)。鼻病毒可在人细胞和某些灵长类动物细胞中生长。培养鼻病毒最常用的人细胞系是二倍体成纤维细胞WI-38细胞系(Hayflick(1996)Exp.Cell.Res.25585-621)、胎儿扁桃体细胞系(Fox(1975)Arm.J.Epidemiol.101122-143)、MRC-5细胞系(Jacobs(1970)Nature227168-1)和HeLa细胞系(Conant(1968)J.Immunol.100107-113)。尽管尚未见有关由克隆的基因组RNA产生鼻病毒的报导，但已经证明用体外转录的病毒RNA转染人细胞可产生感染性脊髓灰质炎病毒(Semler(1984)Nucleic AcidsRes.125123-5141)。与鼻病毒一样，脊髓灰质炎病毒也属于微小RNA病毒科。
产生和操作重组RNA病毒基因组序列及载体(包括鼻病毒和脊髓灰质炎病毒基因组和病毒颗粒)的方法是本领域技术人员熟悉的(如参见McKnight(1998)RNA 41569-1584，以及美国专利6,156,538、5,614,413、5,691,134、5,753,521和5,674,729)。流感病毒本发明提供新的重组流感病毒基因组序列、包含这些序列的病毒颗粒以及生产流感病毒颗粒的方法。
流感病毒是负链RNA病毒。其基因组由几部分单链RNA分子组成，A型和B型流感病毒包含8个单链RNA片段，C型流感病毒包含7个单链RNA片段(如参见Lamb et al.(1996)Fields Virology，出处同上)。A、B和C流感病毒的完整个序列均已有报道。流感病毒能在受孕卵和肾细胞中生长。例如Neumann((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 699345-9350；(2000)Virology 267310-317)报道了由克隆的基因组RNA分子的cDNA拷贝生产病毒的方法。已报道的系统是利用人RNA聚合酶在人胚肾细胞293T中合成病毒RNA和mRNA，以产生流感病毒颗粒。
重组RNA病毒基因组序列和载体(包括流感病毒基因组和病毒颗粒)的生产和操作方法是本领域技术人员已知的(如参见Kemdirim(1986)Virology 152126-135，以及美国专利5,877,852和5,879,925)。慢病毒属衍生的载体本发明提供新的重组慢病毒基因组序列、包含这些序列的病毒颗粒以及生产慢病毒颗粒的方法。
慢病毒衍生的载体和相关的包装系统最初是由Naldini建立的(Science 272263-267)，近来Dull等人又对其进行了改进，以进一步降低产生有复制能力的HIV的可能性(Dull(1998)J.Virol.728463-71)。在该系统中，使用分别编码HIV Gag-Pol、Rev、疱疹性口腔炎病毒G(VSV-G)被膜蛋白和载体RNA的4个质粒转染人肾上皮细胞系293T。在载体颗粒生成细胞中合成HIV-1前体多聚蛋白Gag/Pol和Gag后，它们将依次包装载体RNA并从质膜出芽以形成病毒颗粒。当VSV-G蛋白与Gag-Pol被共表达时，便得到在其表面上展示有VSV-G蛋白的病毒颗粒，从而更有利于颗粒进入宿主细胞。
产生和操作重组RNA病毒基因组序列及载体(包括慢病毒基因组和病毒颗粒)的方法是本领域技术人员已知的(如参见Kirchhoff(1990)Viroloqy177305-311；以及美国专利6,165,782、5,994,516、5,994,136、5,747,324、5,624,795和5,614,404)。痘病毒本发明提供使用复制缺陷型痘病毒生产包壳RNA病毒和RNA基因组序列的方法。根据该方法的一个方面，将编码噬菌体聚合酶的序列克隆到复制缺陷型痘病毒中，从而使该编码序列能够与痘病毒启动子可操作地连接。
痘病毒是DNA病毒。它利用自身的酶进行DNA复制和转录。病毒的复制全部在宿主细胞的胞质中完成。痘苗病毒DNA聚合酶也能复制存在于胞质中的质粒，以产生不均一的和大的线性DNA。如果胞质中的DNA包含有痘苗病毒启动子，它便能够借助痘苗病毒RNA聚合酶进行转录。由于具有以上这些特点，痘病毒已被广泛用于表达外源蛋白(如参见Panicali andPaoletti，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA794927-31；Hackett etal.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 797415-19；Scheiflinger etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899977-81；Merchlinsky andMoss，1992，Virol.190522-26)。其中一个痘苗病毒表达系统是利用噬菌体RNA聚合酶，如T7、T3或SP6(参见Fuerst et al.，1987，Mol.Cell.Biol.72538-2-2544；Roariguez et al.，1990，J.Virol.644851-4857；Usdin et al.，1993，BioTech.14222-224)。在该表达系统中，使用编码噬菌体RNA聚合酶的重组痘苗病毒进行体内转录。将被转录的DNA克隆到质粒中噬菌体启动子的下游。用重组痘苗病毒感染细胞，然后再用质粒转染之。痘病毒感染后即可合成噬菌体RNA聚合酶，然后开始转录噬菌体启动子下游的DNA。
通过抑制一个或多个痘病毒生长所需的必要基因的表达，可使痘病毒失去复制能力。一种方法是在必要基因的ORF之前插入一个可诱导的启动子(如参见Fuerst et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862549-2553)。例如，条件致死性、诱导剂依赖性痘苗病毒即包含有可诱导的D13L基因(如参见Zhang(1992)Virol.187643-653)。如果缺乏诱导剂，必要基因的表达便受到抑制。另一种方法是从病毒基因组中去掉生长所需的必要基因。Falkner等人曾利用能稳定地表达相应的必要蛋白的互补细胞系来增殖缺少必要基因的缺陷型痘病毒重组体(Falkner等人(1998)美国专利5,770,212和5,766,882)。
产生和操作重组RNA病毒基因组序列及载体(包括痘病毒)的方法是本领域技术人员已知的(如参见美国专利6,214,353、6,168,943、6,130,066、6,051,410、5,990,091、5,849,304、5,770,212、5,770,210、5,766,882、5,762,938、5,747,324、5,718,902、5,605,692)。药物的配制和投用本发明还提供用于体外或体内向细胞中转移核酸的配制的药用载体。可使用本发明的载体、载体系统和方法生产复制缺陷型基因转染和基因治疗载体，特别是用于体内或体外向细胞中转移核酸。使用本发明的载体系统和方法，这些序列可被包装而制成基因治疗载体制剂，而且这些制剂无辅助病毒的污染，可以在基因置换治疗(在体细胞或生殖组织中)或肿瘤治疗中作为药物使用(如参见Karpati(1999)Muscle Nerve 161141-1153；Grystal(1999)Cancer Chemother.Pharmacol.43 SupplS90-9)。
本发明的载体、载体系统、药物组合物和方法也可用于其他非人类系统。例如，本发明的载体可用于实验动物(如小鼠、大鼠)及重要经济动物(如猪、牛)的基因的递送(如参见Mayr(1999)Virology 263496-506；Mittal(1996)Viroloqy 222299-309；Prevec (1999)J.Infect.Dis.16127-30)。
可以借助适当的配方投用这些药物。为实现本发明，由摄生学决定的常规投用方法在专利和非专利科学文献中已有充分的描述，一些典型的例子将在后面叙述。关于配方、剂量、用法等的详细描述也可参见有关专利和非专利科学文献，如参见最新版的Remingtons Pharmaceutial Scienccs，Maack Publishing Co.，Easton PA。药物组合物本发明提供由实质上没有辅助病毒的RNA病毒和载体颗粒制剂与药学上可作接受的载体组成的药物组合物。本发明的药物组合物可进一步包含其他活性剂，如其他重组病毒、质粒、裸DNA或药物(如抗肿瘤剂)。
药学上可接受的载体包括生理上可接受的化合物，例如用于稳定组合物，或增加或降低药物成分的吸收的化合物。生理上可接受的化合物包括碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂、低分子量蛋白质、降低共投用之药剂的清除率或水解率的成分，或赋形剂或其它稳定剂或缓冲液。也可使用去污剂稳定药物组合物，或用于增加或减少药物组合物的吸收率。
其它生理上可接受的成分包括润湿剂、乳化剂、分散剂或用于阻止微生物生长与繁殖的防腐剂。许多防腐剂都是已知的，如抗坏血酸。本领域技术人员可以依据给药途径和所投用之药剂的特定生理-化学特征来选择这些药学上可接受的载体，包括生理上可接受的化合物。
所投用的组合物通常包括其中含有RNA病毒和载体颗粒及药学上可接受的载体的缓冲液。可使用各种载体，如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，而且通常没有不需要的物质。可以使用已知的常规灭菌技术对这些组合物进行除菌处理。这些组合物还可以含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的病毒衣壳的浓度范围可以很宽，并主要依据液体体积、粘度、病人体重及给药途径等因素来选择并确定所需的特定浓度。给药剂量的确定可以依据疾病的性质、病人状况、给药途径等因素，按各种不同的剂量单位形式投用本发明的药物组合物。具体地说，每毫升含水溶液中病毒的浓度一般含有103-1018个，较好含有105-1015个，最好含有106-1013个病毒颗粒。更具体的剂量范围可参见最新版的Remington’s PharmaceuticalSciences；Sterman(1998)Hum.Gene Ther.91083-1092以及Smith(1997)Hum.Gene.Ther.8943-954。
RNA病毒的确切用量和浓度、给药次数或治疗有效剂量通常由临床医生确定。给药方案将取决于各种因素，例如待使用基因治疗载体治疗之疾病的进展阶段和严重程度、病人的一般状况、生理条件及年龄等。临床医生可以根据每个病人的具体病情来确定用药剂量。
遗传工程生产的RNA载体已被用于基因治疗(如参见Bosch(2000)Hum.Gene Ther.111139-1150；Mukhtar(2000)Hum.Gene Ther.11347-359；Deglon(2000)Hum.Gene Ther.11179-190；Sallberg(1998)Hum.Gene.Ther.91719-1729)。在实施本发明的过程中，可以参考具体实例，结合上述各种因素来确定所采用的给药途径、配方组成、给药次数及剂量水平。
可根据给药剂量和频率以及病人的耐受性，以单剂或多剂方式通过鞘内途径投用本发明的含有RNA病毒和载体颗粒的药物组合物。特定部位给药(如腹腔内或鞘内)的典型剂量为大约0.5至50ml，每毫升药物组合物含有大约1013个病毒颗粒。优选的给药剂量为大约5至20ml，每毫升药物组合物含有大约109个病毒颗粒。较低的给药剂量为大约1至5ml，每毫升含有大约106个病毒颗粒。可基于上文讨论的各种不同的因素和主客观标准，以及必要时参照常规剂量和病人的耐受能力投用本发明的药物组合物。
对于病毒的确切浓度、配方组成和剂量以及给药频率，还应在第一次用药后体内(如原位)的转基因表达水平和载体滞留水平的不同，分别作出必要的相应调整。递送途径可借助本领域已知的方法，以全身(如静脉内)或局部(如肿瘤周边或本囊腔内)给药方式递送本发明的含有RNA病毒构建体的药物组合物。可提到的重组病毒或病毒载体的递送途径包括动脉内、肿瘤内、静脉内、肠胃道外、腹腔内、胸腔内、口腔内、皮内、皮下、气管内(如通过气雾剂)、透粘膜(如口、膀胱、阴道、子宫、直肠、鼻)、肿瘤内(如经皮肤或局部注射)等途径。使用动脉内注射容易产生“区域效应”，将使药物集中到某一特定的器官(如脑、肝、脾、肺)。例如，如果希望在肝脏中产生抗肿瘤局部效应，可采用肝动脉注射或颈动脉注射方法。如希望向脑内递送病毒制剂(如治疗脑肿瘤)，则可以通过颈动脉注射或颈动脉系动脉(如枕动脉、耳动脉、颞动脉、脑动脉或上颌动脉等)注射方法递送。
本发明的载体可以单独或与其他适当的成分一起制成气雾剂用于呼吸道吸入给药。可将这些气雾剂放入加压的推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷或氮气内给药，也可将其制成通过雾化器或喷雾器给药的制剂。最好用上述的含水药用缓冲液配制适于这种给药方式的制剂，并使用支气管镜向肺内递送。肺部疾病的基因治疗方法包括以基因替代疗法(如使用囊性纤维化跨膜调节蛋白基因)治疗肺囊性纤维化，或治疗肺肿瘤或其他呼吸道疾病。
另外，可将本发明的载体与各种基质如乳化剂或水溶性基质相混合以制成栓剂。适于阴道内给药的制剂包括阴道栓、棉塞、霜剂、凝胶剂、软膏、泡沫剂或喷雾剂。
可将本发明的药物组合物以单剂或多剂形式密封在安瓿或小药瓶等容器内，于冻干条件下贮存备用。使用前只须加入适当的无菌液体赋形剂如注射用水重新配制即可。需要时，也可以由无菌粉末剂、颗粒剂或片剂临时配制成注射液或悬浮剂。
也可以以脂质制剂形式投用本发明的构建体，特别是可以与脂质体复合制成脂质/核酸复合物(如参见国际专利WO93/24640(Debs and Zhu)和WO91/06309(Brigham)，美国专利5,279,933，以及Mannino(1988)和Felgner(1987)的前述文献)。也可将本发明的RNA病毒重组构建体包裹在脂质体中进行局部或全身给药，或通过气雾剂递送。药盒本发明提供包含载体、载体系统或本发明的药物组合物的药盒。药盒还可包含复制感受态细胞。药盒中可包括教导使用者如何分离复制缺陷型RNA病毒和载体颗粒的有关方法学的详细说明书。含有药物制剂的药盒中还可包括有关适应症、给药剂量、给药途径及给药方法的说明。
不必再作更详尽的说明，相信以上的描述足以使本领域技术人员理解本发明的基本精神和原则，并充分利用本发明。下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。实施例1HCV-核酶-T7终止子-poly(A)RNA病毒颗粒的制备本实施例旨在举例说明制备或生产感染性HCV病毒颗粒，特别是HCV-核酶-T7终止子-Poly(A)RNA病毒颗粒的方法。
生产感染性HCV病毒颗粒的第一个步骤是构建下述两个质粒(a)含有全长度HCV基因组RNA之DNA拷贝的pT7HCV(图1)，和(b)含有处于合成的痘苗病毒晚期启动子下游HCV多聚蛋白编码区的pVHCV(图2)。包括5’UTR、多聚蛋白的ORF和3’UTR的HCV基因组的DNA拷贝两侧翼分别连接有上游噬菌体T7启动子(PT7)和下游噬菌体T7终止子(TT7)。图1中的细线代表PUC19主链。在质粒pVHCV中，HCV多聚蛋白编码区被连接到痘苗病毒启动子(pvacL)上。图2的中细线代表pUC19主链。
根据Aizaki(1998)Hepatology 27621-627报道的HCV基因组序列，利用逆转录偶联的聚合酶链反应(RT-PCR)，从HCV感染的病人血清中扩增得到HCV基因组的cDNA拷贝，之后克隆到质粒pUC19中。为了构建质粒pT7HCV，利用T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物扩增HCV基因组RNA的cDNA，引物序列如下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGG CGACACTCC-3’(SEQ IDNO1)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTGACATGATCTGCAGAGAGGCCAGTATCAG-3’(SEQ ID NO2)然后将PCR产物克隆到pUC19(Life Technology)中，得到质粒pT7HCV。利用RT-PCR技术扩增HCV多聚蛋白编码区的cDNA拷贝，并将其克隆到质粒pVAC(图3)中的痘苗病毒晚期启动子下游，得到质粒pVHCV。在该构建体中，为了更有利于帽结构依赖性翻译的进行，最好删去5’端非翻译区。在pVAC质粒中，痘苗病毒晚期启动子(PvacL)侧翼连接有多克隆位点区。图3中的细线代表pUC19质粒主链。
然后，在T25培养瓶中将10μg pT7HCV和10μg pVHCV与2ml加有2.5％胎牛血清的MEM培养基混合，借助DOTAP脂质体(Boehringer Mannheim)，用这些质粒共转染HeLa细胞(106个)。转染后4小时，弃去培养液，用加在含2.5％胎牛血清的MEM培养基中vT7ΔD13L(107pfu)感染细胞。感染后2小时，弃去接种物并在含2.5％胎牛血清的MEM培养液中，于30℃和5％CO2环境下培养细胞。培养48小时后，收集含有HCV颗粒的细胞培养物上清。
为了确定HCV的感染滴度，用含有1％胎牛血清的OPTI-MEMTM培养液对收集的细胞培养物上清进行系列10倍稀释，然后将1ml稀释的上清液加入到12孔培养板的各孔内。各孔内均接种有预培养的Huh7细胞(5×105个/孔)。培养24小时后弃去接种物，并换成1ml含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基。培养1-2天后，收集细胞并抽提总RNA。利用RT-PCR技术扩增HCV 5’端非编码区的300bp片段，以确定HCV RNA的负链。用于反转录的引物序列如下所示5’-ATGATGCACGGTCTACGAGAGACCTCCCGGGGC-3’(SEQ ID NO3)用于PCR扩增的引物序列如下所示5’-CCAGCCCCCTGATGGGGGCGACA-3’(SQE ID NO4)5’-ACTCGCAAGCACCTATCAGGCA-3’(SQE ID NO5)
也可按下述方法产生含有HCV基因组RNA，但没有T7终止子序列和poly(A)的HCV病毒颗粒首先，以HCV基因组RNA的cDNA作为模板，用T7终止子接尾引物(SEQ ID.NO2)和含有Mfe 1与Pac1酶切位点的T7终止子接尾引物进行PCR扩增。
含有Mfe 1和Pac1酶切位点的T7终止子接尾引物的序列如下所示5，-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACAATTGCCCCTTAATTAAGACACACATGATCTGC AGAGAGGCCAGTATCAG-3’(SQE ID NO6)下划线部分为Mfe 1、Pac1的酶切位点。将此PCR产物插入到pUC19。然后用Mfe 1和Pac1酶消化所得到的质粒，并与发夹结构-核酶cDNA连接，如此得到质粒pT7HCV-RIB(图4)。在质粒pT7HCV-RIB中，HCV基因组RNA的cDNA拷贝和相邻的发夹结构-核酶序列两侧翼分别连接有噬菌体T7启动子(PT7)和噬菌体T7终止子(TT7)。图4中的细线代表pBR322质粒的主链。
由下列两条寡核苷酸杂交形成含发夹结构-核酶编码序列的cDNA5’-TCCTCCAATTAAAGAACACAACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTAC-3’(SQE ID NO7)5’-AATTGTACCAGGTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGTTGTGTTCTTTAATTGGAGGAAT-3’(SQE ID NO8)用质粒pT7HCV-RIB和pVHCV共转染细胞。然后用辅助重组痘病毒vT7ΔD13L感染已被转染的细胞。辅助痘病毒重组体vT7ΔD13L中的D13L基因已按Falkner等人(美国专利5,770,212)所述的方法删除。合成HCV-核酶-T7终止子-poly(A)RNA后，酶切产生只有两个额外核苷酸GT，并在3’末端有2，3-环磷酸的HCV RNA。如此得到的病毒颗粒比含T7终止子和poly(A)尾部的HCV RNA具有稍高的感染性。实施例2感染性鼻病毒颗粒的生产本实施例举例说明本发明的生产感染性鼻病毒颗粒的方法。
以质粒转染和辅助痘苗病毒感染方法生产鼻病毒。使用本发明的方法，可在几天内得到高感染滴度的病毒原液。根据已报道的人鼻病毒14的基因组序列(Stanway et al.，1984，Nucleic Acids Res.127859-7875)，利用RT-PCR方法获得包括70个核苷酸poly(A)长尾部的鼻病毒基因组的cDNA拷贝。然后将此cDNA克隆到质粒pBR322中。从已克隆的鼻病毒cDNA构建两个用于病毒生产的质粒。
使用基于pUS19的质粒pRHIN(图5)表达鼻病毒的病毒蛋白。该质粒中，在痘苗病毒晚期启动子下游区插入了编码多聚蛋白的ORF序列。
另一个pT7RHRIN(图6)质粒被用作合成鼻病毒基因组RNA的模板。为了构建pT7RHRIN，使用T7启动子接尾引物和含有Mlu 1及Pac1酶切位点的T7终止子接尾引物扩增编码鼻病毒基因组RNA的cDNA。T7启动子接尾引物包含有Mlu 1与Pac1酶切位点的T7终止子接尾引物具有如下序列5’-TAATACGACTCACTATAGGTTAAAACTGGGTGTGGGTTG TTCCCAC-3’(SQE ID NO9)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATAACGCGTCCCCTTAATTAAGACACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SQE ID NO10)下划线部分为Mlu1和Pac1酶切位点。将此PCR产物克隆到pUC19中。用Mlu1和Pac1酶消化所得到的质粒，然后与发夹结构-核酶cDNA连接。下列两条寡核苷酸引物被用于杂交以形成发夹结构-核酶cDNA5’-TCCTCCAATTAAAGAACTTTACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCTGGTA-3’(SQE ID NO11)5’-CGCGTACCAGGTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGTAAAGTTCTTTAATTGGAGGAAT-3’(SQE ID NO12)所得到的pT7RHIN含有连接到发夹结构核酶cDNA(包括poly A尾部)上的病毒基因组RNA的cDNA拷贝。此鼻病毒-核酶编码序列两侧翼分别连接有T7启动和T7终止子。
为了生产鼻病毒颗粒，借助DOTAP脂质体用10μg pRHIN和10μg pT7RHIN共转染HeLa细胞(106个)，然后再用重组痘病毒vT7ΔD13L感染之。感染2小时后弃去接种物并换成含有2.5％胎牛血清的新鲜MEM培养基。30℃培养48小时后，收集含有鼻病毒颗粒的培养物上清。为了确定所得到的鼻病毒的感染滴度，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基对收集的细胞培养物上清进行系列10倍稀释。然后取1ml稀释的病毒加入到每孔含有预先培养的大约106个HeLa细胞的12孔培养板的各孔中。37℃培养2-3天后，计数噬菌斑的数目。
与天然鼻病毒RNA相比，重组产生的鼻病毒RNA包含有两个额外的核苷酸并在3’末端有2’，3’-环磷酸。实施例3感染性A型流感病毒颗粒的生产本实施例举例说明本发明的生产感染性A型流感病毒颗粒的方法。
以质粒转染和其后的辅助痘苗病毒感染方法生产A型流感病毒。使用本发明方法，可在几天内得到高感染滴度的病毒原液。根据已报道的人流感病毒A/PR/8/34的RNA片段序列(如参见Fields et al，1982，Cell28303-313；Fields et al.，1981，Nature 290213-217；Winter etal.，1982，Nucleic Acids Res.102135-2143；Winter et al.，1981，Nature29272-75；Winter et al.，1981，Virology 114423-428；Winter et al.，1981，Nuceic Acids Res.81965-1974；Baez et al.，1980，Nucleic AcidsRes.85845-5858)设计引物，并利用RT-PCR技术获得8个RNA片段的cDNA拷贝。然后将各个cDNA分别克隆到质粒pUC19中。从克隆的流感病毒cDNA构建两种类型的用于生产病毒颗粒的质粒。一个用于表达病毒蛋白。使用上述片段构建pINF1-8、pINF2-7、pINF3-6和pINF4-5四个质粒。每个质粒都有两个处于痘苗病毒晚期启动子控制下的病毒蛋白表达盒(图7)。
pINF1-8包含PB2和NS的ORF，pINF2-7包含PB1和M的ORF，pINF3-6包含PA和NA的ORF，pINF4-5包含HA和NP的ORF。另一类型的质粒用于表达基因组RNA片段。构建基于pUC19的下列八个质粒pT7INF1、pT7INF2、pT7INF3、pT7INF4、pT7INF5、pT7INF6、pT7INF7和pT7INF8。每个质粒都携带一个用于转录上述各病毒基因组RNA片段的转录单元。在各转录单元内，基因组RNA的cDNA拷贝都位于T7启动子和T7终止子之间，以这种方向插入便可借助T7RNA聚合酶转录这些cDNA，以产生基因组(负链)RNA。发夹结构-核酶cDNA被插入在基因组RNA的cDNA拷贝和T7终止子之间(图8)。
为了构建pT7INF1、pT7INF2、pT7INF3、pT7INF4、pT7INF5、pT7INF6、pT7INF7和pT7INF8这八个质粒，以八个T7启动子接尾引物和八个含有Mlu1与Pac1酶切位点的T7终止子接尾引物扩增每个基因组RNA片段的cDNA。用于扩增片段1的T7启动子接尾引物和T7终止子标记引物如序列下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGTCAATTAT ATTCAA-3’(SQE ID NO13)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTAGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC-3’(SQE ID NO14)划下线部分显示Mlu1和Pac1酶切位点。
用于扩增片段2的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAAGCAGGCAAACC ATTTGAATGGAT-3，(SQE ID NO15)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGGAACAAGGCATTTTTTCATG-3’(SQE ID NO16)用于扩增片段3的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGTACTGAT CCAAAATGG-3’(SQE ID NO17)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTG-3’(SQEID NO18)用于扩增片段4的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAAGCAGGGGAAA ATAAAAACAA-3’(SQE IDNO19)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTCC-3’(SQE ID NO20)用于扩增片段5的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物的序列如下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCAAAAGCAGGGTAGAAT ATCACTCACTG-3’(SQEID NO21)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTG-3’(SQE IDNO22)用于扩增片段6的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物的序列如下所示5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGGGTTTAA AATGAATCC-3’(SQE ID NO23)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAC-3’(SQE ID NO24)用于扩增片段7的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物具有下示序列5’-TAATACGACTCACTATAGGAGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGA-3’(SQE IDNO25)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCC-3’(SQE IDNO26)用于扩增片段8的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物具有下示序列5，-TAATACGACTCACTATAGGAGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACATAATG-3’(SQE IDNO27)5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTACGCGTCCCCTTAATTAAGACACAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATTATT-3’(SQE IDNO28)将所得到的PCR产物克隆到pUC19中。然后用Mlu 1和Pac1酶消化所得到的质粒，并与发夹结构-核酶cDNA相连接。使用下示两条寡核苷酸引物进行序列杂交，以形成发夹结构-核酶cDNA5，-TCCTCCAATTAAAGAACagtACCAGAGAAACACACGTTGTGGTATATTACCT3GGTA-3’(SQE ID NO29)
5’-CGCGTACCAGGTAATATACCACAACGTGTGTTTCTCTGGTactGTTCTTTAATTGGAGGAAT-3’(SQE ID NO30)所得到的八个质粒pT7INF1、pT7INF2、pT7INF3、pT7INF4、pT7INF5、pT7INF6、pT7INF7和pT7INF8各包含一个编码基因组RNA片段的cDNA。将cDNA连接到发夹结构-核酶编码序列上，得到两侧翼分别连接有T7启动子和T7终止子的编码RNA片段-核酶的cDNA。
为了生产流感病毒颗粒，借助DOTAP(Boehringer Mannheim)，使用各5μg pINF1至pINF8共转染T25培养瓶中的HeLa细胞(106个)，然后再用重组痘病毒vT7ΔD13L感染这些细胞。感染2小时后，弃去接种物并换成含有2.5％胎牛血清的新鲜MEM培养基。30℃保温48小时后，收集含有A型流感病毒颗粒的培养物上清。为了确定流感病毒的感染滴度，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基对收集到的细胞培养物上清进行系列10倍稀释。然后取1ml稀释的病毒加入到每孔含有约106个预培养的MDCK细胞(Madin-Darby狗肾细胞)的12孔平板各孔中。保温后计数噬菌斑的数目。
与野生型流感病毒RNA相比，按本发明方法重组产生的流感病毒RNA片段包含两个额外的核苷酸并在3’末端有2’，3’-羟基磷酸。实施例4HIV-1衍生的载体颗粒的生产本实施例举例说明本发明的生产HIV-1载体颗粒的方法。
根据HIV-1 HXB2病毒株(Wong-Staal et.al.(1985)Nature313277-284)和水泡性口腔炎病毒G糖蛋白(VSV-G)(Rose andBergmann(1983)Cell 34513-524)的序列数据，构建三个用于生产了HIV-1载体颗粒的质粒。用于表达HIV-I HXB2 gag-pol的质粒pGAG-POL(图9)含有被克隆在痘苗病毒7.5早/晚期启动子和痘苗病毒终止子之间的gag-pol的编码区。另一个质粒pVSV-G(图10)含有克隆到T7质粒的启动子和终止子之间的VSV-G编码区(Rose and Bergmann(1983)Cell 34513-524)。在痘苗病毒感染的细胞中，由于只有10％借助T7 RNA聚合酶在胞质中合成的转录产物带有帽结构并因此而被顺利翻译，所以利用T7 RNA聚合酶表达VSV-G被膜糖蛋白可避免在细胞表面积聚过多的被膜糖蛋白。VSV-G的过度表达可引起群体细胞间的融合并在细胞中产生毒性。这些影响将减少载体颗粒的产量。第三个质粒pT7EGFP(图11)被用作合成载体RNA分子的模板。该RNA分子包括HIV-1 5’长末端重复序列(5’CTR)，其后是包装信号序列和利于增强绿色荧光蛋白的CMV启动子控制的转录单元，再后面是多聚嘌呤序列段和3’LTR。在反转录过程中，由于3’U3和3’R之间已经有三联G与强终止DNA之3’末端的三联C相配对，所以不需要再插入三联G。将此载体RNA分子的DNA拷贝克隆到T7启动子和T7终止子之间，得到质粒pT7EGFP。
为了生产HIV-1衍生的载体颗粒，借助DOTAP(Boehringer Mannheim)脂质体，用悬浮于4ml含有2.5％胎牛血清的MEM中的10μg pGAG-POL、10μgpVSVG和10μg pT7EGFP共转染HeLa细胞(106个)。感染4小时后，再用纯化的辅助痘苗病毒重组体vT7ΔD13L(107pfu)感染细胞。感染2小时后弃去接种物并换成含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基以培养细胞。培养48小时后，收集含病毒载体颗粒的培养物上清。为了确定载体的滴度，对收集的细胞培养物上清进行系列10倍稀释，然后将1ml稀释的载体加入到每孔含有约105个预培养的HeLa细胞的12孔平板的各孔中。24小时后，使用荧光显微镜计数发出绿色荧光的细胞。
虽然上文已描述了本发明的许多实施方案，但应明确的是，在不背离本发明的精神和原则前提下，对本发明所作的各种改动和改变均将落入本发明的待批权利要求范围内。
序列表<110>广州绿健生物技术有限公司<120>生产RNA病毒和基于RNA病毒的载体颗粒的组合物及方法<130><140>01119744.7<141>2000-05-23<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>1taatacgact cactataggg ccagccccct gatgggggcg acactcc 47<210>2<211>76<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>2caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctagac atgatctgca 60gagaggccag tatcag 76<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>3atgatgcacg gtctacgaga cctcccgggg c31<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>4ccagccccct gatgggggcg aca 23<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>5actcgcaagc accctatcag gca 23<210>6<211>97<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>6caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacaa ttgcccctta 60attaagacac acatgatctc agagaggcca gtatcag 97<210>7<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>7tcctccaatt aaagaacaca accagagaaa cacacgttgt ggtatattac ctggtac57<210>8<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>8aattgtacca ggtaatatac cacaacgtgt gtttctctgg ttgtgttctt taattggagg 60aat 63<210>9<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>9taatacgact cactataggt taaaactggg tgtgggttgt tcccac46<210>10<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>10caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctaacg cgtcccctta 60attaagacac tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100<210>11<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>11tcctccaatt aaagaacttt accagagaaa cacacgttgt ggtatattac ctggta 56<210>12<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>12cgcgtaccag gtaatatacc acaacgtgtg tttctctggt aaagttcttt aattggagga 60at62<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>13taatacgact cactatagga gcgaaagcag gtcaattata ttcaa45<210>14<211>94<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>14caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa 60ttaagacaca gtagaaacaa ggtcgttttt aaac 94<210>15<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>15taatacgact cactatagga gcgaaaagca ggcaaaccat ttgaatggat50<210>16<211>94<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>16caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa 60ttaagacaca gtaggaacaa ggcatttttt catg 94<210>17<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>17taatacgact cactatagga gcgaaagcag gtactgatcc aaaatgg 47<210>18<211>92<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>18caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa 60ttaagacaca gtagaaacaa ggtacttttt tg 92<210>19<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>19taatacgact cactatagga gcgaaaagca ggggaaaata aaaacaa 47<210>20<211>92<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>20caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa 60ttaagacaca gtagaaacaa gggtgttttt cc 92<210>21<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>21taatacgact cactatagga gcaaaagcag ggtagataat cactcactg49<210>22<211>99<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>22caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa 60ttaagacaca gtagaaacaa gggtattttt ctttaattg99<210>23<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>23aatacgactc actataggag cgaaagcagg ggtttaaaat gaatcc46<210>24<211>94<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>24caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa 60ttaagacaca gtagaaacaa ggagtttttt gaac 94<210>25<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>25taatacgact cactatagga gcgaaagcag gtagatattg aaagatga 48<210>26<211>96<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>26caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa 60ttaagacaca gtagaaacaa ggtagttttt tactcc 96<210>27<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>27taatacgact cactatagga gcaaaagcag ggtgacaaag acataatg 48<210>28<211>97<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>28caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctacgc gtccccttaa60ttaagacaca gtagaaacaa gggtgttttt tattatt 97<210>29<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>29tcctccaatt aaagaacagt accagagaaa cacacgttgt ggtatattac ctggta 56<210>30<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>30cgcgtaccag gtaatatacc acaacgtgtg tttctctggt actgttcttt aattggagga 60at 6权利要求
1.生产包壳RNA病毒的方法，其包括以下步骤(a)提供能够在真核细胞中形式衣壳并包装RNA病毒基因组的多肽编码序列；(b)提供包括可操作地连接到噬菌体启动子和噬菌体转录终止子序列上的病毒RNA病毒基因组序列的构建体，其中噬菌体启动子和噬菌体转录终止序列是可操作地匹配的；(c)提供与步骤(b)的噬菌体启动子可操作地匹配的噬菌体RNA聚合酶编码序列，其中所说的编码序列被可操作地连接到痘病毒启动子上；(d)在允许序列表达并组装包含RNA病毒基因组序列的衣壳的条件下，在真核细胞中共同表达步骤(a)的多肽、步骤(b)的RNA病毒基因组序列以及步骤(c)的噬菌体RNA聚合酶编码序列，从而制得包壳的RNA病毒。
2.权利要求1的方法，其中真核细胞是动物细胞。
3.权利要求1的方法，其中所说的动物细胞是哺乳动物细胞。
4.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞是人细胞。
5.权利要求1的方法，其中编码衣壳形成多肽的基因被克隆到质粒或病毒载体中。
6.权利要求1的方法，其中步骤(a)的编码序列被操作地连接到在动物细胞胞质中有活性的启动子上。
7.权利要求1的方法，其中RNA病毒基因组序列包括内部核糖体进入位点(IRES)。
8.权利要求1的方法，其中所说的内部核糖体进入位点是肝炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)。
9.权利要求1的方法，其中含有RNA病毒基因组序列的构建体包括质粒或病毒载体。
10.权利要求1的方法，其中所说的噬菌体选自于T3噬菌体，T7噬菌体和SP6噬菌体。
11.权利要求1的方法，其中T3噬菌体RNA聚合酶的表达是由T3噬菌体启动子驱动的，T7噬菌体RNA聚合酶的表达是由T7噬菌体启动子驱动的，并且SP6噬菌体RNA聚合酶的表达是由SP6噬菌体启动子驱动的。
12.权利要求1的方法，其中构建体包括T3噬菌体转录终止序列和T3噬菌体启动子，T7噬菌体转录终止序列和T7噬菌体启动子，以及SP6噬菌体转录终止序列和SP6噬菌体启动子。
13.权利要求3的方法，其中所说的在动物细胞胞质中有活性的启动子是衍生于痘病毒科病毒的序动子。
14.权利要求13的方法，其中痘病毒科的病毒是正痘病毒属的病毒。
15.权利要求14的方法，其中正痘病毒属的病毒是痘苗病毒。
16.权利要求15的方法，其中痘苗病毒启动子是痘苗病毒晚期启动子。
17.权利要求1的方法，其中痘病毒是正痘病毒属的病毒。
18.权利要求17的方法，其中正痘病毒属的痘病毒是痘苗病毒。
19.权利要求1的方法，其中痘病毒是选下列一组病毒属的病毒；付痘病毒属、禽痘病毒属、山羊病毒属、亚塔痘病毒属、野兔痘病毒属、猪痘病毒属和软尤痘病毒属的病毒。
20.权利要求1的方法，其中所说真核细胞胞质包含真核细胞。
21.权利要求1的方法，其中真核细胞胞质包含体外制剂。
22.权利要求1的方法，其中RNA病毒是包含RNA基因组的肝炎病毒。
23.权利要求22的方法，其中RNA病毒是丙型肝炎病毒。
24.权利要求22的方法，其中RNA病毒是不成熟的乙型肝炎病毒。
25.权利要求22的方法，其中RNA病毒是甲型肝炎病毒。
26.权利要求1的方法，其中RNA病毒是慢病毒。
27.权利要求1的方法，其中RNA病毒是鼻病毒。
28.权利要求1的方法，其中RNA病毒是流感病毒。
29.权利要求1的方法，其中RNA病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。
30.权利要求29的方法，其中人免疫缺陷病毒(HIV)是HIV-1。
31.权利要求30的方法，其中人免疫缺陷病毒缺少Rev反应元件或被膜序列。
32.权利要求1的方法，其中RNA病毒是选自下列一组的病毒腺病毒、LCMV、付流感病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、星状病毒、丝状病毒和冠状病毒。
33.权利要求1的方法，其中噬菌体RNA聚合酶被克隆到复制缺陷型痘病毒中。
34.权利要求1的方法，其中包壳RNA病毒是感染性的。
35.权利要求1的方法，其中包壳RNA病毒是非感染性的。
36.权利要求1的方法，其中所说的方法产生的制备物99％是没有复制能力的痘病毒。
37.权利要求36的方法，其中所说的方法产生的制备物100％是没有复制能力的痘病毒。
38.权利要求1的方法，其中复制缺陷型痘病毒缺少制造病毒复制所必需的多肽的能力。
39.权利要求38的方法，其中病毒复制所必需的多肽是病毒衣壳多肽。
40.权利要求1的方法，其中复制缺陷型痘病毒的缺陷在于转录激活或转录调节缺陷。
41.权利要求1的方法，其中步骤(a)的一个、几个或所有的多肽编码序列被掺入到步骤(b)的RNA病毒基因组序列中，并且所说的构建体进一步包括内部核糖体进入位点(IRER)。
42.生产包壳RNA病毒的系统，其包括下列成分(a)多肽编码序列，其中所说的多肽能包装RNA病毒基因组序列，并且各编码序列均被克隆到构建体中，从而使之可操作地连接到启动子上；(b)包含与噬菌体启动子及噬菌体转录终止序列可操作地连接的RNA病毒基因组序列的构建体，其中所说的RNA病毒基因组序列能够被步骤(a)的多肽包装到衣壳内；(c)与步骤(b)的噬菌体启动子可操作地配合的噬菌体RNA聚合酶的编码序列，其中所说的编码序列可操作地连接到痘病毒启动子上；其中在允许编码序列表达并组装包含RNA病毒基因组序列的衣壳的条件下，在真核细胞胞质中共同表达步骤(a)的多肽，步骤(b)的RNA病毒基因组序列及步骤(c)的噬菌体RNA聚合酶编码序列；以产生包壳RNA病毒。
43.权利要求42的系统，其中真核细胞是动物细胞。
44.权利要求43的系统，其中动物细胞是哺乳动物细胞。
45.权利要求44的系统，其中哺乳动物细胞是人细胞。
46.权利要求42的系统，其中编码衣壳形成多肽的基因被克隆到质粒或病毒载体中。
47.权利要求42的系统，其中步骤(a)的一个、几个或所有的多肽编码序列被掺入到步骤(b)的RNA病毒基因组序列中并且所说的构建体进一步包括内部核糖体进入序列(IRES)。
48.权利要求42的系统，其中所说的噬菌体RNA聚合酶的编码序列被克隆到复制缺陷痘病毒中。
49.权利要求42的系统，其中包壳RNA病毒是感染性的。
50.权利要求42的系统，其中包壳RNA病毒是非感染性的。
51.权利要求42的系统，其中所说的方法产生的制备物99％是没有复制能力的痘病毒。
52.权利要求51的系统，其中所说的方法产生的制备物100％是没有复制能力的痘病毒。
53.权利要求42的系统，其中所说的噬菌体启动子被克隆到复制缺陷型痘病毒中。
54.包含RNA基因组序列并在其3’末端有2’，3’-环磷酸的重组病毒基因组序列。
55.包含RNA基因组序列及其3’末端有2’，3’-环磷酸的重组病毒颗粒。
56.包含RNA基因组序列和噬菌体RNA聚合酶的转录终止子序列及其3’末端poly(A)序列的重组病毒基因组序列。
57.包含RNA基因组序列和噬菌体RNA聚合酶的转录终止子序列及其3’末端poly(A)序列的重组病毒颗粒。
58.缺少Rev反应元件(RRE)或被膜序列并包含噬菌体RNA聚合酶的终止子序列的重组慢病毒基因组序列。
59.包含有缺少Rev反应元件(RRE)或被膜序列，并包含有噬菌体RNA聚合酶终止子序列的重组慢病毒颗粒。
全文摘要
本发明提供使用无复制能力的辅助痘病毒重组体在细胞培养物中以及体外生产RNA病毒序列、重组RNA病毒、RNA病毒突变体和RNA病毒衍生的载体的方法。这些方法允许不依赖于其天然复制途径并避开任何细胞屏障，在细胞培养物中以及体外产生RNA病毒序列和病毒颗粒。本发明还提供按本发明方法制得的新的RNA病毒序列和病毒颗粒。
文档编号C12N15/86GK1478147SQ01813270
公开日2004年2月25日 申请日期2001年5月10日 优先权日2000年5月24日
发明者冯愈, 唐恒立, 愈 冯 申请人:广州绿健生物技术有限公司